Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out

Resumo

O presente protocolo descreve um método que utiliza o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out para determinar a permeabilidade intestinal. Este método pode ser usado para determinar a permeabilidade paracelular em enteróides que modelam doenças inflamatórias intestinais, como enterocolite necrosante.

Resumo

Os enteróides são uma ferramenta de pesquisa emergente no estudo de doenças inflamatórias intestinais, como a enterocolite necrosante (NEC). Eles são tradicionalmente cultivados na conformação basolateral-out (BO), onde a superfície apical da célula epitelial está voltada para o lúmen interno. Nesse modelo, o acesso à superfície luminal dos enteroides para tratamento e experimentação é desafiador, o que limita a capacidade de estudar as interações hospedeiro-patógeno. Para contornar isso, foi criado um modelo apical-out neonatal (AO) para enterocolite necrosante. Uma vez que as alterações da permeabilidade das células epiteliais intestinais são patognomônicas para a NEC, este protocolo descreve o uso do amarelo lucifer (LY) como marcador de permeabilidade paracelular. O LY atravessa a barreira epitelial intestinal através de todas as três principais vias paracelulares: poros, vazamento e irrestrito. O uso de LY em um modelo AO permite um estudo mais amplo da permeabilidade em NEC. Após a aprovação do IRB e o consentimento dos pais, amostras cirúrgicas de tecido intestinal foram coletadas de recém-nascidos prematuros humanos. As células-tronco intestinais foram colhidas via isolamento de criptas e usadas para cultivar enteróides. Os enteróides foram cultivados até a maturidade e, em seguida, transformados AO ou deixados em conformação BO. Estes não foram tratados (controle) ou foram tratados com lipopolissacarídeo (LPS) e submetidos a condições hipóxicas para a indução de NEC in vitro . O LY foi utilizado para avaliar a permeabilidade. A coloração imunofluorescente da proteína apical zonula occludens-1 e da proteína basolateral β-catenina confirmou a conformação da AO. Os enteróides AO e BO tratados com LPS e hipóxia demonstraram um aumento significativo da permeabilidade paracelular em comparação com os controles. Ambos os enteróides AO e BO mostraram aumento da absorção de LY no lúmen dos enteróides tratados em comparação com os controles. A utilização de LY em um modelo enteróide AO permite a investigação de todas as três principais vias de permeabilidade paracelular. Além disso, permite a investigação das interações hospedeiro-patógeno e como isso pode afetar a permeabilidade em comparação com o modelo enteróide BO.

Introdução

Os enteroides são estruturas tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco intestinais humanas com restrição de órgãos ^1,2. Eles são compostos inteiramente de linhagem epitelial e contêm todos os tipos diferenciados de células epiteliais intestinais². Os enteróides também mantêm a polaridade celular composta por uma superfície luminal apical formando um compartimento interno e uma superfície basolateral voltada para o meio circundante. Os enteróides são um modelo único na medida em que preservam as características do hospedeiro a partir do qual foram gerados³. Assim, os enteroides gerados a partir de prematuros humanos representam um modelo útil para a investigação de doenças que acometem principalmente essa população, como a enterocolite necrosante (NEC).

O modelo enteróide tradicional é cultivado em uma conformação basolateral-out (BO), onde o enteróide é envolto em uma cúpula de matriz de membrana basal (BMM). A BMM induz o enteróide a manter uma estrutura 3D com a superfície basolateral do lado de fora. Os enteróides BO são um modelo adequado para NEC que preenche a lacuna entre linhagens celulares humanas primárias bidimensionais (2D) e modelos animais in vivo ^2,4. A NEC é induzida em enteroides pela colocação de patógenos como LPS ou bactérias no meio ao redor dos enteroides, seguida de exposição a condições hipóxicas ^2,3. O desafio com o modelo NEC enteróide BO é que ele não permite o estudo efetivo das interações hospedeiro-patógeno, que ocorrem na superfície apical in vivo. Alterações na permeabilidade intestinal são devidas a essas interações hospedeiro-patógeno. Para entender melhor como a permeabilidade afeta a base fisiopatológica da doença, um modelo deve ser criado que envolva o tratamento da superfície apical.

Co et al. foram os primeiros a demonstrar que enteroides BO maduros podem ser induzidos a formar uma conformação apical-out (AO) removendo as cúpulas de BMM e ressuspendendo-as em meio⁵. Este artigo demonstrou que os enteroides AO mantiveram a polaridade epitelial correta, continham todos os tipos de células intestinais, mantinham a barreira epitelial intestinal e permitiam o acesso à superfície apical⁵. O uso de enteroides AO como um modelo NEC alcança uma reprodução fisiológica do processo da doença e o estudo das interações hospedeiro-patógeno.

Um dos principais contribuintes para a fisiopatologia da NEC é o aumento da permeabilidade intestinal⁶. Diversas moléculas têm sido propostas como forma de testar a permeabilidade intestinal in vitro⁷. Dentre estes, o amarelo lúcifer (LY) é um corante hidrofílico com picos de excitação e emissão a 428 nm e 540 nm, respectivamente⁸. Ao atravessar todas as principais vias paracelulares, tem sido utilizado para avaliar a permeabilidade paracelular em diversas aplicações, incluindo as barreiras hematoencefálicas e epiteliais intestinais ^8,9. A aplicação tradicional de LY utiliza células cultivadas em monocamadas sobre uma superfície semipermeável¹⁰. O LY é aplicado à superfície apical e atravessa através de proteínas de junção apertada paracelular para se reunir no lado basolateral. Concentrações mais elevadas de LY no compartimento basolateral indicam diminuição das proteínas da junção apertada com subsequente quebra da barreira celular epitelial intestinal e aumento da permeabilidade¹⁰. Também foi descrita em modelos enteroides 3D BO onde LY foi adicionado ao meio e enteróides individuais foram fotografados para absorção de LY no lúmen¹¹. Embora isso permita a análise qualitativa através da visualização da absorção de LY, a análise quantitativa é limitada. Este protocolo descreve uma técnica única que usa LY para avaliar a permeabilidade paracelular usando um modelo enteróide NEC in vitro em enteróides AO, mantendo a orientação 3D. Este método pode ser usado para análise qualitativa e quantitativa da permeabilidade.

Protocolo

A presente pesquisa foi realizada em conformidade com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB, #11610, 11611) na Universidade de Oklahoma. O consentimento dos pais foi necessário antes da coleta de espécimes cirúrgicos humanos de acordo com as especificações do IRB. Após a aprovação do IRB e o consentimento dos pais, o tecido intestinal delgado humano foi obtido de lactentes (idade gestacional (IG) corrigida variando de 36-41 semanas no momento da coleta da amostra, todos com história de parto prematuro em um GA estimado de 25-34 semanas, 2:1 M:F) submetidos a cirurgia para NEC ou outra ressecção intestinal, como retirada de ostomia ou reparo de atresia. Os enteróides foram gerados a partir de tecido obtido do jejuno ou do íleo.

1. Culturas enteróides derivadas de crianças humanas: isolamento de criptas e revestimento de todo o tecido

1. Preparar o meio de cultura, o tampão quelante nº 1 e o tampão quelante nº 2 (Tabela 1) seguindo o relatório anterior⁴. Armazenar os tamponadores quelantes a 4 °C e utilizá-los no prazo de 48 h.
2. Preparar meios miniintestinais humanos (Tabela 1). Conservar a unidade populacional a -20 °C e aquecer em banho-maria de 37 °C antes da utilização.
3. Preparar meios condicionados (CM) L-WRN a 50% (Tabela 1). Conservar as existências a 4 °C até 1 semana.
   NOTA: A base 100% L-WRN para a mídia condicionada é descrita em protocolo de Miyoshi et ^al.12.
4. Gerar enteroides a partir de amostras de tecido do intestino delgado obtidas de espécimes cirúrgicos seguindo o relato anterior⁴. Placa quatro poços de enteróides em uma placa de 24 poços de um pedaço de 0,75-2,5 g de tecido intestinal.
   NOTA: Os enteróides podem ser gerados com sucesso a partir de tecido armazenado em 30 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 em um tubo cônico de 50 mL a 4 °C por até 48 h.
5. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ de cabeça para baixo por 15-20 min para permitir a polimerização das cúpulas BMM⁴.
6. Adicionar 500 μL de 50% L-WRN CM (conforme descrito na etapa 1.3) com 0,5 μL de Y-27632, inibidor de ROCK (IR, ver Tabela de Materiais) a cada poço. Após 2-3 dias, substitua por 50% L-WRN CM sem IR.

2. Geração de enteróides AO

1. Cultivar enteróides embutidos em BMM por 7-10 dias com 50% L-WRN CM⁴.
2. Remova o meio e adicione 500 μL de solução de recuperação celular (SRI, consulte Tabela de materiais) a um poço. Raspe a cúpula, pipeta para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, adicione a solução CRS/enteroid/BMM ao próximo poço.
3. Raspe a cúpula, pipeta para cima e para baixo várias vezes e coloque a solução em um tubo de microcentrífuga. Adicione 500 μL de SRI ao segundo poço, pipeta para cima e para baixo, depois adicione-o ao primeiro poço. Transfira esta solução para o mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Repita a etapa 2.3, agrupando dois poços em um tubo de microcentrífuga até que todo o conteúdo do poço esteja em SRI.
   NOTA: Mais de dois poços podem ser agrupados em um tubo cônico maior de 15 mL se gerar grandes volumes de enteróides AO. Manter uma relação CRS por poço de 500 μL é importante para garantir a solubilização completa da BMM.
5. Colocar os tubos de microcentrífuga (passo 2.3) com solução agrupada de SRI/enteróide/BMM num rotador durante 1 h a 4 °C para solubilizar o BMM.
6. Centrifugar a solução a 200 x g durante 3 min a 4°C e, em seguida, remover o sobrenadante com uma micropipeta, deixando o pellet para trás.
7. Ressuspender o pellet enteróide em 1 mL de L-WRN CM a 50% (conforme preparado na etapa 1.3) por tubo de microcentrífuga. Pipetar suavemente 500 μL da solução enteróide/meio ressuspensa em cada poço das placas de cultura de tecidos de 24 poços de fixação ultrabaixa (ver Tabela de Materiais).
8. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 3 dias antes da experimentação.

3. Verificação da conformação enteróide AO através de coloração imunofluorescente de montagem completa

1. Após a incubação dos enteróides em suspensão média durante 3 dias, pipetar a suspensão enteróide/média de um poço para um tubo de microcentrífuga.
2. Centrifugar a suspensão enteróide/meio a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante com uma micropipeta.
3. Ressuspender os enteróides em 20 μL de BMM. Pipetar 10 μL de suspensão enteróide sobre uma lâmina de microscópio e espalhá-la em uma camada fina de aproximadamente 1 cm por 1 cm quadrada. Repetir com os restantes 10 μL de suspensão enteróide numa parte separada da mesma lâmina de modo a que existam duas manchas de suspensão enteróide/BMM.
4. Permita que os esfregaços enteróides/BMM se solidifiquem à temperatura ambiente (RT) por 15 min.
5. Trabalhando no exaustor, coloque a lâmina em um frasco de coloração e encha com paraformaldeído a 4% até cobrir o esfregaço enteróide / BMM (~ 30 mL para uma lâmina se usar um vitral de vidro com capacidade de 10 lâminas). Aguarde 30 minutos (à temperatura ambiente) para que a fixação ocorra.
   CUIDADO: 4% de paraformaldeído é perigoso e pode causar danos nos olhos / irritação, irritação da pele e câncer. Sempre trabalhe sob um exaustor ao usá-lo. Use luvas de proteção e equipamentos de proteção individual ao manuseá-lo. Elimine-o num contentor de eliminação de resíduos aprovado.
6. Rejeitar 4% de paraformaldeído num recipiente de resíduos adequado. Adicione 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao frasco de coloração ou até que o PBS cubra os esfregaços enteróides/BMM. Deixe descansar por 3 minutos no RT e, em seguida, descarte o PBS na garrafa de resíduos de paraformaldeído. Repita este passo mais duas vezes para um total de três lavagens.
7. Encha um novo frasco de coloração com 30 mL de Triton X-100 a 0,5% diluído em PBS. Coloque a lâmina com esfregaços enteróides/BMM na solução de Triton e deixe permeabilizar por 20 min no RT.
8. Descarte o Triton X-100 a 0,5% diluído em PBS. Adicione 30 mL de PBS ao frasco de coloração e deixe descansar por 3 min. Descarte o PBS por decantação.
9. Limpe suavemente a lâmina ao redor dos esfregaços enteróides / BMM, tomando cuidado para não interrompê-los. Usando uma caneta de barreira hidrofóbica (caneta PAP de barreira, consulte Tabela de materiais), desenhe um círculo em torno de cada um dos esfregaços enteróides/BMM. Faça um soro a 20%, específico para o animal em que o anticorpo secundário foi criado (ver Tabela de Materiais).
10. Coloque a lâmina do microscópio no banco do laboratório. Bloqueie a lâmina durante 1 h a 4 °C pipetando 100 μL de soro específico a 20% a partir do passo 3.9 em cada um dos esfregaços enteróides/BMM circundados pela caneta de barreira hidrofóbica.
11. Preparar uma solução de 100 μL com diluições de 1:100 e 1:200 de anticorpos primários β-catenina e ZO-1, respectivamente, diluídos em PBS.
    NOTA: Cada anticorpo primário deve ser de um animal diferente para garantir que eles terão canais imunofluorescentes distintos quando fotografados. O presente estudo utiliza um anticorpo β-catenina de rato e um anticorpo ZO-1 de coelho (ver Tabela de Materiais).
12. Toque na lâmina no balcão para remover o soro de 20% e seque suavemente, tomando cuidado para não interromper os esfregaços enteróides / BMM. Pipetar 100 μL de solução de anticorpo primário de β-catenina/ZO-1 para um dos esfregaços enteróides/BMM. Pipeta de 100 μL de PBS sem anticorpo primário para o outro esfregaço enteróide/BMM como controle negativo.
13. Forre o fundo de um recipiente de plástico com uma toalha de papel molhada para criar um recipiente umeificado. Coloque o slide no recipiente, tomando cuidado para não interromper as soluções que cobrem os esfregaços enteróides/BMM. Coloque a tampa no recipiente para selar e guarde plana a 4 °C durante a noite.
    Observação : não permitir que o slide seque. Certifique-se de que o recipiente está fechado para evitar a dessecação.
14. Uma vez pronto para prosseguir, toque no slide no balcão para remover anticorpos primários e PBS dos esfregaços enteróides / BMM.
15. Realize uma etapa de lavagem colocando a lâmina em um frasco de coloração e enchendo com 30 mL de PBS ou até que a PBS cubra os esfregaços enteróides/BMM. Deixe descansar por 3 min à temperatura ambiente. Descarte o PBS e repita esta etapa mais duas vezes para um total de três lavagens.
16. Preparar 200 μL de anticorpos secundários para dois canais imunofluorescentes diferentes, com cada anticorpo a ter uma diluição de 1:1000 em PBS (ver Tabela de Materiais). Mantenha a solução longe da luz.
17. Pipetar 100 μL de solução de anticorpos secundários para cada um dos esfregaços enteróides/BMM. Coloque-o no escuro e deixe-o descansar por 1 h no RT.
18. Toque no slide no contador para remover anticorpos secundários. Repita as etapas de lavagem descritas na etapa 3.15, garantindo que todas as lavagens sejam realizadas no escuro.
19. Adicione uma gota de meio de montagem de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Fluoroshield com DAPI, ver Tabela de Materiais) a cada um dos esfregaços enteróides/BMM e aplique uma folha de cobertura para garantir que ambos os esfregaços estão adequadamente cobertos. Evite prender bolhas sob a tampa. Mantenha a lâmina no escuro até que esteja pronta para visualização ao microscópio.
    NOTA: A imagem imediata das lâminas produz os resultados mais ideais; no entanto, as lâminas podem ser armazenadas planas em um recipiente umidificado a 4 °C e fotografadas por até 1 semana após a adição de DAPI.

4. Indução de NEC experimental

1. Certifique-se de que os enteróides AO estiveram em suspensão durante, pelo menos, 72 horas antes da utilização.
2. Pipete suavemente toda a suspensão enteróide/média de cada poço para um tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Vários poços podem ser agrupados em um tubo cônico de 15 mL se um grande volume de poços for tratado. Um mínimo de três poços por grupo de tratamento é recomendado para este protocolo.
3. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
4. Adicionar 10 μL de 5 mg/mL de lipopolissacarídeo (LPS, ver Tabela de Materiais) a 500 μL de 50% de LWRN CM por poço (concentração final de 100 μg/mL de LPS).
5. Ressuscite os enteróides AO designados como o grupo de tratamento em 50% LWRN + LPS e alíquota de 500 μL de suspensão para uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Ressuspender os enteróides AO designados como controles não tratados em 500 μL de 50% de CM LWRN por poço. Aliquota 500 μL desta suspensão a uma placa de fixação ultrabaixa separada de 24 poços.
6. Induzir hipóxia nos enteróides AO tratados com LPS através de uma câmara de incubadora modular (CIM) com 1% de O 2, 5% de CO 2 e 94% de N ₂ de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Trate os enteróides com hipóxia e LPS por 24 h.
7. Colocar as culturas não tratadas e LPS + hipóxia, ainda na câmara MIC, em incubadora de CO₂ a 37 °C, a 5% por 24 h.

5. Medição da permeabilidade paracelular utilizando LY

1. Pipetar suavemente a suspensão enteróide/média de cada poço para um tubo de microcentrífuga. DPBS quente e 50% LRWN CM em banho-maria de 37 °C.
2. Centrifugar a suspensão enteróide/média a 300 x g durante 3 min a RT.
3. Remova a mídia. Lave os enteróides com DPBS morno de 500 μL.
4. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT. Remova o sobrenadante com uma micropipeta.
5. Repita as etapas 5.3-5.4 mais uma vez por um total de duas vezes.
6. Após a lavagem, adicionar 450 μL de CM LWRN a 50% a quente (conforme preparado no passo 1.3).
7. Adicionar 50 μL de 2,5 mg/mL de LY (a concentração final é de 0,25 μg/μL, ver Tabela de Materiais) a cada poço e girar suavemente para misturar. Colocar numa incubadora a 37 °C, 5% de CO 2 durante₂ h.
8. Pipetar suavemente a suspensão enteróide/média de cada poço para um tubo de microcentrífuga.
9. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT e, em seguida, remover o sobrenadante, deixando a pastilha enteróide para trás.
10. Lave os enteróides com 500 μL de DPBS quente.
11. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT e, em seguida, remover o sobrenadante que deixa o pellet enteróide para trás.
12. Repita os passos 5.10-5.11 mais três vezes para um total de quatro lavagens.
13. Ressuscite cada pellet com 1.000 μL de DPBS frio e pipete vigorosamente para cima e para baixo para dissociar os enteróides.
14. Preparar padrões para a curva padrão LY diluída em DPBS (100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).
15. Pipetar 150 μL de cada amostra por poço em triplicado sobre uma placa de 96 poços.
16. Meça a fluorescência a um pico de excitação de 428 nm e um pico de emissão de 536 nm num leitor de placas capaz de ler a fluorescência (ver Tabela de Materiais). Usando software estatístico (ver Tabela de Materiais), calcule as concentrações interpolando a curva padrão e usando uma curva de quatro parâmetros.

Resultados

Conformação AO
Enteroides suspensos em meios LWRN a 50% por 72 h assumem uma conformação AO (Figura 1). Isso foi confirmado por meio de coloração imunofluorescente utilizando montagens inteiras enteroides da proteína apical, zonula occludens-1 (ZO-1), e proteína basolateral, β-catenina (Figura 1). Os enteroides AO mostram ZO-1 (verde) na superfície externa apical do enteróide, enquanto a β-catenina (vermelha) está na sup...

Discussão

A permeabilidade intestinal é complexa e reflexiva da função de barreira epitelial. A barreira intestinal compreende uma única camada de células epiteliais que medeia o transporte transcelular e paracelular¹⁴. A permeabilidade paracelular depende de proteínas de junção apertada que selam o espaço entre as células epiteliais¹⁴. Dentro desse transporte paracelular, existem três vias distintas pelas quais as moléculas podem se cruzar: poros, vazamento e irrestrito<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254