A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה המשתמשת בצהוב לוציפר במודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט כדי לקבוע חדירות מעיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע חדירות paracellular ב enteroids כי מודל מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית.
אנטרואידים הם כלי מחקר מתפתח בחקר מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת מעי נמקית (NEC). הם גדלים באופן מסורתי בקונפורמציה הבזולטרלית-החוצה (BO), שבה פני השטח האפיקליים של תא האפיתל פונים לומן הפנימי. במודל זה, הגישה למשטח הזוהר של אנטרוידים לצורך טיפול וניסויים היא מאתגרת, מה שמגביל את היכולת לחקור אינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. כדי לעקוף זאת, נוצר מודל ילודים (AO) לדלקת אנטרוקוליטיס נמקית. מאחר ששינויים בחדירות תאי אפיתל במעיים הם פתוגנומיים עבור NEC, פרוטוקול זה מתאר שימוש בלוציפר צהוב (LY) כסמן של חדירות על-תאית. LY חוצה את מחסום אפיתל המעי דרך כל שלושת המסלולים העל-תאיים העיקריים: נקבוביות, דליפה ובלתי מוגבלות. השימוש ב-LY במודל AO מאפשר מחקר רחב יותר של חדירות ב-NEC. לאחר אישור IRB והסכמת ההורים, נאספו דגימות כירורגיות של רקמת מעיים מילודים פגים אנושיים. תאי גזע מעיים נקטפו באמצעות בידוד קריפטה ושימשו לגידול אנטרואידים. אנטרואידים גודלו לבגרות ולאחר מכן הפכו AO או הושארו בקונפורמציה BO. אלה לא טופלו (בקרה) או טופלו בליפופוליסכריד (LPS) והיו נתונים לתנאים היפוקסיים להשראת NEC במבחנה . LY שימש להערכת חדירות. צביעה אימונופלואורסצנטית של החלבון האפיקלי זונולה occludens-1 והחלבון הבזולטרלי β-קטנין אישרה את קונפורמציית AO. גם אנטרואידים מסוג AO וגם BO שטופלו ב-LPS ובהיפוקסיה הדגימו חדירות על-תאית מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. גם אנטרואידים של AO וגם של BO הראו ספיגה מוגברת של LY לתוך לומן של האנטרואידים שטופלו בהשוואה לבקרים. השימוש ב-LY במודל אנטרואידי AO מאפשר לחקור את כל שלושת המסלולים העיקריים של חדירות על-תאית. זה גם מאפשר לחקור אינטראקציות פונדקאי-פתוגן וכיצד זה עשוי להשפיע על חדירות בהשוואה למודל אנטרואיד BO.
אנטרואידים הם מבנים תלת-ממדיים (3D) שמקורם בתאי גזע אנושיים מוגבלים באיברים 1,2. הם מורכבים לחלוטין משושלת אפיתל ומכילים את כל סוגי תאי אפיתל המעי המובחנים2. אנטרואידים גם שומרים על קוטביות תאית המורכבת ממשטח לומינלי אפיקלי היוצר תא פנימי ומשטח בזולטרלי הפונה למדיה הסובבת. אנטרואידים הם מודל ייחודי בכך שהם משמרים את המאפיינים של המארח שממנו הם נוצרו3. לפיכך, אנטרוידים שנוצרו מתינוקות אנושיים פגים מייצגים מודל שימושי לחקר מחלות המשפיעות בעיקר על אוכלוסייה זו, כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית (NEC).
המודל האנטרואידי המסורתי גדל בקונפורמציה בזולטרלית-החוצה (BO), שבה האנטרואיד עטוף בכיפה של מטריצת קרום מרתף (BMM). BMM משרה את האנטרואיד לשמור על מבנה תלת-ממדי עם המשטח הבזולטרלי מבחוץ. אנטרוידים BO הם מודל מתאים ל-NEC המגשר על הפער בין קווי תאים אנושיים ראשוניים דו-ממדיים (דו-ממדיים) לבין מודלים של חיות in vivo 2,4. NEC מושרה באנטרוואידים על ידי הצבת פתוגנים כגון LPS או חיידקים בתקשורת המקיפה את האנטרואידים, ולאחר מכן חשיפה לתנאים היפוקסיים 2,3. האתגר עם מודל ה-NEC האנטרואידי BO הוא שהוא אינו מאפשר מחקר יעיל של אינטראקציות פונדקאי-פתוגן, המתרחשות על פני השטח האפיקליים in vivo. שינויים בחדירות המעיים נובעים מאינטראקציות אלה בין המארח לפתוגן. כדי להבין טוב יותר כיצד חדירות משפיעה על הבסיס הפתופיזיולוגי של המחלה, יש ליצור מודל הכולל טיפול במשטח האפי.
Co et al. היו הראשונים שהדגימו כי ניתן לגרום לאנטרואידים בוגרים של BO ליצור קונפורמציה אפיקל-אאוט (AO) על ידי הסרת כיפות ה-BMM והחייאתן במדיה5. מאמר זה הראה כי אנטרואידים AO שמרו על קוטביות אפיתל נכונה, הכילו את כל סוגי תאי המעי, שמרו על מחסום אפיתל המעיים ואפשרו גישה למשטח האפיקלי5. שימוש באנטרואואידים AO כמודל NEC משיג שכפול פיזיולוגי של תהליך המחלה ומחקר של אינטראקציות פונדקאי-פתוגן.
אחד התורמים העיקריים לפתופיזיולוגיה של NEC הוא חדירות מעיים מוגברת6. מספר מולקולות הוצעו כדרך לבדוק חדירות מעיים במבחנה7. בין אלה, לוציפר צהוב (LY) הוא צבע הידרופילי עם עירור ופליטה פסגות ב 428 ננומטר ו 540 ננומטר, בהתאמה8. כאשר הוא חוצה את כל המסלולים העל-תאיים העיקריים, הוא שימש להערכת חדירות על-תאית ביישומים שונים, כולל מחסומי דם-מוח ואפיתל מעיים 8,9. היישום המסורתי של LY משתמש בתאים הגדלים במונו-שכבות על משטח חדיר למחצה10. LY מוחל על פני השטח האפיקליים וחוצה דרך חלבוני צומת הדוקים פארא-תאיים כדי להתכנס בצד הבזולטרלי. ריכוזי LY גבוהים יותר בתא הבזולטרלי מצביעים על ירידה בחלבוני צומת הדוקים עם פירוק מחסום תאי אפיתל במעיים לאחר מכן וחדירות מוגברת10. זה תואר גם במודלים אנטרואידים של 3D BO שבהם LY נוסף למדיה ואנטרוידים בודדים צולמו לקליטה של LY לתוך לומן11. למרות שזה מאפשר ניתוח איכותי באמצעות הדמיה של קליטת LY, ניתוח כמותי מוגבל. פרוטוקול זה מתווה טכניקה ייחודית המשתמשת ב- LY כדי להעריך חדירות פארא-תאית באמצעות מודל אנטרואיד NEC במבחנה באנטרואידים של AO תוך שמירה על כיוון תלת-ממדי. שיטה זו יכולה לשמש הן לניתוח איכותי והן כמותי של חדירות.
המחקר הנוכחי בוצע בהתאם לאישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB, #11610, 11611) באוניברסיטת אוקלהומה. נדרשה הסכמת הורים לפני איסוף דגימות כירורגיות אנושיות בהתאם למפרטי IRB. לאחר אישור IRB והסכמת ההורים, רקמת המעי הדק האנושית התקבלה מתינוקות (גיל הריון מתוקן (GA) שנע בין 36-41 שבועות בזמן איסוף הדגימה, כולם עם היסטוריה של לידה מוקדמת ב- GA מוערך של 25-34 שבועות, 2:1 M:F) שעברו ניתוח ל- NEC או כריתת מעיים אחרת, כגון הסרת אוסטומיה או תיקון אטרזיה. אנטרואידים נוצרו מרקמה המתקבלת מהג'ג'ונום או מהאיליאום.
1. תרביות אנטרואידיות אנושיות שמקורן בתינוקות: בידוד קריפטה וציפוי מרקמה שלמה
2. דור של אנטרואידים AO
3. אימות של קונפורמציה אנטרואידית AO באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה
4. אינדוקציה של NEC ניסיוני
5. מדידת חדירות פרא-תאית באמצעות LY
קונפורמציה של AO
אנטרואידים המושהים ב-50% מדיית LWRN למשך 72 שעות מניחים קונפורמציה של AO (איור 1). זה אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית תוך שימוש ברכיבים שלמים אנטרואידיים של החלבון האפיקלי, זונולה occludens-1 (ZO-1), וחלבון בזולטרלי, β-קטנין (איור 1). א...
חדירות המעי מורכבת ומשקפת את תפקוד מחסום האפיתל. מחסום המעי מורכב משכבה אחת של תאי אפיתל המתווכת הובלה טרנס-תאית ופארא-תאית14. חדירות פארא-תאית מסתמכת על חלבוני צומת הדוקים האוטמים את החלל שבין תאי אפיתל14. בתוך ההובלה העל-תאית הזו, ישנם שלושה מסלולים נפרדים שבאמצע?...
המחברים אינם מדווחים על שום עניין קנייני או מסחרי בשום מוצר או מושג המוזכר במאמר זה.
ברצוננו להודות לאשלי נלסון מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר על עזרתה האינסטרומנטלית במודל האנטרואיד שלנו. ברצוננו להודות גם למחלקה לכירורגיית ילדים באוניברסיטת אוקלהומה על תמיכתם בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות [NIH Grant R03 DK117216-01A1], מרכז אוקלהומה לחקר תאי גזע בוגרים, ומענק קרן הבריאות הפרסביטריאנית #20180587 שהוענק למחלקה לכירורגיה במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
[leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
Dissecting scissors | |||
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
Forceps | |||
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
Glass coverslips | |||
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved