通过颈内动脉注射癌细胞模拟脑转移

摘要

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。大多数脑转移小鼠模型因全身转移而复杂化，混淆死亡率和治疗干预结果的分析。这里介绍的是颈动脉内注射癌细胞的方案，该方案产生一致的颅内肿瘤和最小的全身性肿瘤。

摘要

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。转移性疾病的关键方面，例如复杂的神经微环境和基质细胞相互作用，不能完全通过 体外 测定复制;因此，动物模型对于研究和理解治疗干预的效果至关重要。然而，大多数脑肿瘤异种移植方法在时间框架和肿瘤负荷方面不能一致地产生脑转移。通过心内注射癌细胞产生的脑转移模型可导致意外的颅外肿瘤负荷，并导致非脑转移发病率和死亡率。虽然颅内注射癌细胞可以限制颅外肿瘤的形成，但它有几个注意事项，例如注射的细胞经常在注射部位形成单一的肿瘤肿块，高软脑膜受累，以及在针刺穿透过程中脑血管系统受损。该协议描述了由颈内动脉注射产生的脑转移的小鼠模型。该方法在没有其他器官参与的情况下持续产生颅内肿瘤，从而能够评估脑转移的治疗剂。

引言

脑转移是一种普遍的恶性肿瘤，预后非常差^1，2。脑转移患者的护理标准是多模式的，包括神经外科、全脑放疗和/或立体定向放射外科手术，具体取决于患者的一般健康状况、颅外疾病负担以及脑部肿瘤的数量和位置^3，4。最多 3 个颅内病变的患者适合手术切除或立体定向放射外科手术，而建议有多个病变的患者进行全脑放疗，以避免手术相关感染和水肿的风险⁵.然而，全脑放疗会对放射敏感的大脑结构造成损害，导致生活质量下降⁶。

全身治疗是治疗多发病变患者的非侵入性替代和合乎^{逻辑的方法7}。然而，由于长期以来认为全身治疗疗效不佳，因为通过血流被动递送细胞毒性药物无法在没有不安全毒性风险的情况下达到大脑中的治疗水平，因此较少考虑^8。随着最近美国食品和药物管理局（FDA）批准的全身治疗（图卡替尼联合曲妥珠单抗和卡培他滨用于转移性HER2+乳腺癌脑^转移）9，¹⁰，11，12以及治疗指南的更新，包括考虑脑转移患者的全身治疗选择，这种范式开始改变^13，14。

在这种情况下，分子靶向治疗，免疫疗法和替代药物递送系统（例如靶向纳米药物载体）领域的发展可以潜在地克服脑转移治疗的挑战¹⁵，¹⁶，^17，18。此外，还正在研究通过脑肿瘤屏障透化来改善药物递送的化学和机械方法^19，20。为了研究和优化这些方法以适应目的，使用临床前模型至关重要，这些模型不仅反映了脑转移的复杂生理学，而且还允许对颅内药物反应进行客观分析。

从广义上讲，目前模拟体内脑转移的方法涉及心内（左心室），静脉内（通常是尾静脉），颅内或颈内（颈总动脉）注射小鼠的癌细胞²¹，^22，23，²⁴，²⁵，^26，27.除了肿瘤植入策略外，通过去除肿瘤抑制基因或激活癌基因触发肿瘤形成的基因工程小鼠模型可用于肿瘤建模。然而，据报道，只有少数基因工程小鼠模型产生继发性肿瘤，甚至更少可靠地产生脑转移瘤²⁸，^29，30。

植入方法，如心内（左心室）和静脉注射（通常是尾静脉）模仿癌症的全身播散。这些模型通常在多个器官（例如，脑、肺、肝、肾、脾脏）中产生病变，这取决于在循环"首次通过"期间捕获大多数肿瘤细胞的毛细血管床³¹。然而，不一致的脑植入率将需要更多的动物才能达到所需统计功效的样本量。通过这些心内和静脉注射方法 最终 在大脑中建立的肿瘤细胞数量是可变的。因此，脑转移肿瘤负荷可能因动物而异，进展的差异可能使标准化实验时间表和结果解释成为一项挑战。颅外肿瘤负荷可导致非脑转移死亡，使这些模型不适合评估颅内疗效。已经使用人工克隆选择过程建立了脑-热带细胞系以减少颅外建立，但摄取速率不一致，并且克隆选择过程可以降低通常在人类肿瘤中发现的异质性³²。

脑特异性植入方法，如颅内和颈内注射，可实现更一致和有效的脑转移建模。在颅内方法³³中，癌细胞通常被注射到额叶大脑皮层中，其产生快速且可重复的肿瘤生长，全身受累低。虽然该手术耐受性良好，死亡率低³³，但需要注意的是，这是一种相对粗糙的方法，可迅速在大脑中引入（局部）细胞推注，并且不能模拟早期脑转移发病机制。针头会破坏脑组织脉管系统，然后引起局部炎症^5，34。根据经验，在拔针过程中，肿瘤细胞注射有反流的趋势，导致软脑膜受累。或者，颈内方法将细胞输送到颈总动脉中，脑微脉管系统作为遇到的第一个毛细血管床，模拟循环、外渗和定植的存活率²⁴。与其他人^一致25，我们使用这种方法的经验发现，由于癌细胞通过颈外动脉 无意 中递送到这些组织中的毛细血管床，它可能导致面部肿瘤（未发表的数据）。通过在颈总动脉注射之前首先结扎颈外动脉可以预防面部肿瘤（图1）。在本文的其余部分，这种方法被称为"颈内动脉注射"。根据经验，颈内动脉注射方法始终如一地产生脑转移，全身性事件很少，并且已成功生成不同原发性癌症（例如黑色素瘤、乳腺癌和肺癌）的脑转移模型（图 1）。缺点是它在技术上具有挑战性、耗时、侵入性强，并且需要仔细优化细胞数量和监测时间表。总之，颅内和颈内动脉注射方法都产生了适合评估对脑肿瘤相关生存益处的治疗影响的小鼠模型。

该协议描述了颈内动脉注射方法，以产生几乎没有全身参与的脑转移小鼠模型，因此适用于药物分布和实验疗法疗效的临床前评估。

图1:脑转移的颈内动脉注射方案示意图。 颈内动脉注射与颈外动脉结扎可以可靠地产生来自各种原发性癌症的脑转移模型。在该协议中，三个结扎放置在颈动脉上（图中注释为L1-L3）。 请点击此处查看此图的大图。

研究方案

所有研究均在昆士兰大学动物伦理委员会（UQCCR/186/19）和澳大利亚科学动物护理和使用守则的指导方针下进行。

1.注射用癌细胞的制备

注意:在这项研究中，使用了人乳腺癌细胞系BT-474（BT474）。BT474在完全生长培养基中培养，该培养基含有补充有10%胎牛血清和1%胰岛素的RPMI 1640培养基。将细胞保持在37°C的培养箱中，空气中有5%的二氧化碳。通过卫星串联重复检测³⁵鉴定细胞系，确认报告蛋白（例如荧光素酶）的表达（如果有），并检查支原体感染。

1. 注射前，使用10mL完全生长培养基和培养物（在37°C下，5%CO 2）将接种密度为_2.0 x 10⁶个细胞的BT474癌细胞接种到T75烧瓶中至70%-80%汇合度。
2. 在注射当天，丢弃生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞单层两次。
3. 加入5mL预热的细胞培养解离试剂（参见 材料表），并在37°C下孵育5分钟或直到细胞分离。5分钟后，轻轻敲击烧瓶以帮助细胞分离。
4. 加入 5 mL 含有 10% 胎牛血清的完全生长培养基以淬灭解离试剂活性。
5. 通过移液轻轻重悬细胞以减少细胞团块。
6. 将细胞悬液转移到 50 mL 管中，并在室温下以 180 x g 离心 3 分钟。
7. 倒出上清液并将细胞沉淀重悬于不含钙和镁的 10 mL 汉克平衡盐溶液 （HBSS） 中，以尽量减少细胞结块。
8. 在室温下以180× g 离心细胞悬液3分钟。
9. 倒出上清液以除去残留的血清/解离试剂，并将细胞沉淀重悬于 3 mL HBSS 中。
10. 将 100 μm 细胞过滤器放在新鲜的 50 mL 锥形管上，并将细胞悬液通过以去除细胞团块。
    注意:单细胞悬液对于最大限度地减少血管闭塞和注射时中风的风险至关重要。
11. 使用台盼蓝排除和具有标准方法的血细胞计数器计算活细胞的数量。
12. 用HBSS将细胞悬液稀释至2.5 x 10⁶ 个细胞/ mL的细胞浓度。
13. 将管子水平放在冰上，并定期轻轻摇动管子以尽量减少结块。细胞悬液可以在冰上储存最多6小时。
    注意:摇摆是手动完成的，但也可以使用低转速的振动台来完成。

2.为该程序准备鼠标

注意:在这项研究中，使用了4-5周龄的雌性NOD scid小鼠。在手术前3天向小鼠引入软饮食恢复食物（例如，减肥凝胶，水凝胶，捣碎的小鼠食物），以鼓励手术后进食。

1. 高压灭菌手术工具。用表面消毒剂喷洒并擦拭手术区域和设备，然后用70%乙醇。
2. 在手术板下方放置动物加热垫以防止体温过低。在手术前30分钟打开它。用表面消毒剂喷洒并擦拭手术板，然后用70%乙醇。
3. 准备一个干净的动物笼子和一个温暖的加热垫以进行恢复。
4. 穿上干净的个人防护装备（防护服、口罩、发网和手套）。通过使用干净的检查手套和"仅器械尖端"技术，在整个过程中保持无菌。
5. 用麻醉室麻醉小鼠，使用5%异氟醚，氧气流量为2L / min，直到小鼠失去踏板反射。
6. 将动物从腔室中取出，并将其放入鼻锥中，以2 L / min的氧气流量提供2%异氟醚，用于剩余的外科手术。
7. 用于识别的打耳鼠标，并使用电动剪从颈部区域剃掉皮毛。用胶带清洁裸露皮肤上多余的毛发。
8. 称量小鼠以计算所需的麻醉和镇痛药物剂量。通过皮下注射分别以50μg/ kg和1mg / kg给予丁丙诺啡和美洛昔康。
9. 将鼠标转移到温暖的手术板上，并用胶带固定鼻锥。
10. 将眼部润滑剂涂抹在眼睛上以防止干燥。
11. 首先用粘在手术板上的线钩住上门牙，然后用胶带粘住前腿和后腿，轻轻地固定鼠标。这一步在手术过程中伸展身体并保持颈部伸直。
12. 进行术前皮肤准备，如下所述。
    1. 用局部消毒剂（聚维酮碘）擦拭颈部，以减少皮肤微生物群落负荷并去除松散的毛发。从皮肤中心清洁，向外工作以防止切口部位再次污染。使用70%乙醇重复该过程。进行三轮碘和乙醇交替进行消毒。
    2. 在动物身上铺上手术布。这是从一块无菌纸巾或高压灭菌袋切割和成型的。
13. 摆放无菌纸巾或高压灭菌袋作为手术工具。
14. 在继续手术之前， 通过 "捏测"检查反射以确保充分麻醉。

3.颈内注射

注意:在该实验中，使用31 G输液插管和脚激活注射器驱动器设置来促进注射过程（补充图1）。此设置是可选的，用户可以使用 31 G 胰岛素注射器并跳过步骤 3.11 和 3.12。为了准备输液插管，使用两对缝合夹将针头部分与31 G针头的注射器接头部分拉动并分离。接下来，将针头部分连接到长度约为 10 cm 的细输液管的一端。

1. 将解剖显微镜放在鼠标上。
2. 用剪刀沿着颈部区域的中线做一个垂直的15毫米切口，从下颌下方5毫米开始到胸廓入口。
3. 使用两对倾斜的镊子，分开皮肤和下面的唾液腺，并应用牵开器以保持气管暴露。下一步将暴露与气管平行的颈动脉鞘。
4. 使用两对细角镊子，钝性地解剖气管附近的肌肉和脂肪组织，露出右颈动脉鞘。颈动脉鞘是覆盖颈总动脉、静脉和迷走神经的纤维层，该束可通过鲜红色的颈总动脉可见。在这项研究中，注射是在右颈动脉上进行的。
5. 清除颈总动脉尾部的一部分到周围筋膜的颈动脉分叉处，并将其与迷走神经和静脉分开。
6. 从周围神经和筋膜中分离并清除颈动脉分叉（连接颈外动脉和颈内动脉的连接处）。将细镊子放在颈外动脉下方，并在动脉下方通过丝线（5-0厚度）。打结并收紧缝合线并切断多余的线。
   注意:此结扎（L1）将防止注射液通过颈外动脉。
7. 将细钳放在颈总动脉下方，并在动脉下方通过丝线（5-0厚度）。打一个结，并在建议的注射部位附近的位置收紧缝合线。切开多余的缝合线，留下约10毫米的线。
   注意:第二次结扎（L2）将限制注射后的血流和出血。它还用于在注射过程中定位和保持颈动脉。
8. 切割并润湿一条（高压灭菌的）低绒毛一次性雨刷（见 材料表）约 10 毫米 x 5 毫米。将条带折叠成4毫米x 5毫米，2-3毫米厚，并将其放置在建议的注射部位的颈动脉下方。这将在注射过程中支撑容器。
9. 在拟议注射部位的颈总动脉口，放置第三个结扎（L3）。仅在注射后（在步骤3.16）拧紧。
10. 轻轻搅拌细胞悬液，并将 200 μL 细胞悬液吸入胰岛素注射器（用 31 G 针头）。
11. 将注射器装入连接到激活脚踏板的注射器驱动器中。
12. 用31 G针头将细插管连接到注射器上并灌注线。
13. 检查颈动脉位置是否良好并加压。
14. 使用两个细角镊子，一个轻轻张紧到第一个结扎的末端，另一个握住31 G针，慢慢地将带有斜面的针头插入血管腔，注意不要刺穿它。
15. 以 10 μL/s 的速度将 100 μL 细胞悬液（从步骤 1.13 开始）缓慢注入颈总动脉。这将把2.5 x 10⁵ 个细胞输送到血管中。通过清除颈动脉血管中的血液 来 可视化成功的注射。
16. 抽出针头后立即轻轻提起并收紧松散的结扎（L3）（从步骤3.9开始），以防止回流和出血。修剪多余的缝合线。
    注意:拔出针头后观察到少量血液喷出是正常的。但是，收紧第三个结扎后不得有任何活动性出血。
17. 取下一块湿润的低绒毛一次性雨刷器。
18. 使用 P200 移液器，用 150-200 μL 无菌水或生理盐水冲洗手术腔两次。
19. 再次检查出血，然后取下牵开器。
20. 将软组织、唾液腺和皮肤重新定位在颈动脉和气管上。
21. 使用缝合针支架，镊子和可吸收或不可吸收的6/0单丝缝合线以连续模式关闭切口的皮肤层。
22. 丢弃套管针头注射器并为下一个鼠标准备新的设置。使用新的注射器将确保注射到每只小鼠中的细胞数量是一致的。
    注意:该过程的代表性快照在 补充图2中。如果血管被针刺穿或撕裂，由注射液泄漏或出血表明，该过程被视为不成功。在此之后，必须拔出针头，并且必须立即收紧第三个结扎以防止进一步出血。如果在收紧缝合线后出血持续存在，则必须用戊巴比妥对动物实施安乐死。

4. 注射后恢复

1. 通过皮下注射 注射 丁丙诺啡（50μg/kg）和美洛昔康（1mg/kg）作为术后疼痛缓解。
2. 将动物移至温暖干净的笼子中以从麻醉中恢复。动物在醒来后活动受限（蜷缩和不活动或缓慢移动）是正常的。
3. 30-45分钟后，将小鼠转移到长期保持设施中。
4. 手术后至少一周为小鼠提供软饮食（减肥凝胶，水凝胶，醪液），并每天检查身体状况，特别注意伤口周围是否有中风，感染，出血的迹象。
5. 手术后两天，动物通常会活动减少，皮毛轻微褶皱，术前体重减轻 15%。手术后 2-3 天每天服用镇痛药（美洛昔康），以控制疼痛并帮助恢复。
6. 从第3天开始，动物必须恢复活动，增加喂养和梳理频率，并恢复体重。手术后 4 天通过腹腔注射 以 200 mg/kg 的戊巴比妥钠对身体状况持续缺陷（疼痛、蜷缩、不活动、体重减轻）的动物实施安乐死。
7. 肿瘤植入和进展可以使用麻醉和所选的成像方式（如生物发光成像、MRI 或 PET/MRI）进行监测。进行这种成像的要求和能力将取决于进行这种成像的单个项目目标和设施，并且取决于所用细胞系的报告标记类型、相关放射化学和核成像设施的可及性^36，37
   注意:尽管手术成功，但有些动物可能反应不佳并出现中风。手术后，出现任何神经痛苦症状（转头和拉向一侧，盘旋行为，滚动，捶打，运动功能丧失）的动物必须立即实施安乐死。

结果

颈总动脉注射联合或不联合颈外动脉结扎术的比较
当通过颈总动脉 注射 癌细胞而不首先结扎颈外动脉²⁴时，在77.8%的移植小鼠中发现了面部肿瘤（n = 7/9动物）。面部肿瘤的一个例子如 补充图3所示。本协议中描述的方法通过在颈总动脉之前结扎颈外动脉来防止意外的面部转移。

为了比较这两种方法，将凝集素注射到...

讨论

脑转移是癌细胞从原发部位扩散到大脑的复杂过程。有不同的动物模型可以反映这个多步骤过程的某些阶段，并且设计临床前转移研究有生理和实际考虑^41，42。大多数已发表的研究调查使用纳米药物进行脑转移治疗的研究都使用了心内⁴³，44和颅内^45，46，47，^48，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010