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Resumo

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Resumo

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. Aspectos críticos de doenças metastáticas, como o complexo microambiente neural e a interação de células estromais, não podem ser inteiramente replicados com ensaios in vitro ; assim, os modelos animais são fundamentais para investigar e compreender os efeitos da intervenção terapêutica. No entanto, a maioria dos métodos de xenoenxertia de tumores cerebrais não produz metástases cerebrais consistentemente em termos de período de tempo e carga tumoral. Modelos de metástases cerebrais gerados pela injeção intracardíaca de células cancerígenas podem resultar em carga tumoral extracraniana não intencional e levar à morbidade e mortalidade metastática não cerebral. Embora a injeção intracraniana de células cancerígenas possa limitar a formação de tumores extracranianos, ela tem várias ressalvas, como as células injetadas frequentemente formam uma massa tumoral singular no local da injeção, alto envolvimento leptomeníngeo e danos à vasculatura cerebral durante a penetração da agulha. Este protocolo descreve um modelo de rato de metástase cerebral gerada pela injeção da artéria carótida interna. Este método produz tumores intracranianos de forma consistente sem o envolvimento de outros órgãos, possibilitando a avaliação de agentes terapêuticos para metástases cerebrais.

Introdução

A metástase cerebral é uma neoplasia maligna prevalente associada a um prognóstico muito ruim 1,2. O padrão de atendimento para pacientes com metástases cerebrais é multimodal, consistindo em neurocirurgia, radioterapia de todo o cérebro e/ou radiocirurgia estereotáxica, dependendo do estado geral de saúde dos pacientes, da carga de doença extracraniana e do número e localização de tumores no cérebro 3,4. Pacientes com até três lesões intracranianas são elegíveis para ressecção cirúrgica ou radiocirurgia estereotáxica, enquanto a radioterapia de todo o cérebro é recomendada para pacientes com lesões múltiplas para evitar o risco de infecção e edema relacionados à cirurgia5. No entanto, a radioterapia de todo o cérebro pode infligir danos às estruturas cerebrais radiossensíveis, contribuindo para a má qualidade de vida6.

A terapia sistêmica é uma alternativa não invasiva e uma abordagem lógica para o tratamento de pacientes com lesões múltiplas7. No entanto, é menos considerado devido à noção de longa data de que as terapias sistêmicas têm baixa eficácia, pois a entrega passiva de drogas citotóxicas através da corrente sanguínea não pode atingir níveis terapêuticos no cérebro sem o risco de toxicidade insegura8. Esse paradigma está começando a mudar com a terapia sistêmica recentemente aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA (tucatinibe com trastuzumabe e capecitabina, indicada para metástase cerebral metastática com câncer de mama HER2+)9,10,11,12 e a atualização nas diretrizes de tratamento para incluir a consideração de opções de terapia sistêmica para pacientes com metástase cerebral 13,14.

Nesse contexto, os desenvolvimentos no campo da terapia molecular direcionada, imunoterapia e sistemas alternativos de liberação de medicamentos, como um portador de nanofármacos direcionado, podem potencialmente superar os desafios do tratamento de metástases cerebrais15,16,17,18. Além disso, abordagens químicas e mecânicas para melhorar a administração de fármacos via permeabilização da barreira crânio-tumoral também estão sendo investigadas19,20. Para estudar e otimizar tais abordagens para serem adequadas ao propósito, é crucial usar modelos pré-clínicos que não apenas espelhem a complexa fisiologia da metástase cerebral, mas também permitam a análise objetiva da resposta intracraniana a medicamentos.

Em termos gerais, as abordagens atuais para modelar metástases cerebrais in vivo envolvem injeção intracardíaca (ventrículo esquerdo), intravenosa (geralmente veia da cauda), intracraniana ou intracarótida (artéria carótida comum) de células cancerígenas em camundongos 21,22,23,24,25,26,27 . Além das estratégias de enxerto tumoral, modelos de camundongos geneticamente modificados em que a formação de tumores é desencadeada pela remoção de genes supressores de tumor ou ativação de oncogenes são úteis para a modelagem tumoral. No entanto, apenas alguns modelos de camundongos geneticamente modificados são relatados para produzir tumores secundários e ainda menos que produzem de forma confiável metástases cerebrais28,29,30.

Métodos de enxerto como injeção intracardíaca (ventrículo esquerdo) e intravenosa (geralmente veia da cauda) imitam a disseminação sistêmica do câncer. Esses modelos normalmente produzem lesões em múltiplos órgãos (por exemplo, cérebro, pulmões, fígado, rins, baço), dependendo do leito capilar que retém a maioria das células tumorais durante sua "primeira passagem" circulatória31. No entanto, taxas inconsistentes de enxerto cerebral exigirão mais animais para atingir o tamanho da amostra para o poder estatístico desejado. O número de células tumorais que eventualmente se estabelecem no cérebro através desses métodos de injeção intracardíaca e intravenosa é variável. Assim, a carga tumoral de metástase cerebral pode variar entre os animais e a diferença na progressão pode tornar a padronização da linha do tempo experimental e a interpretação dos resultados um desafio. A carga tumoral extracraniana pode levar à mortalidade por metástases não cerebrais, tornando esses modelos inadequados para avaliar a eficácia intracraniana. Linhagens celulares cérebro-trópicas têm sido estabelecidas usando processos de seleção clonal artificial para reduzir o estabelecimento extracraniano, mas as taxas de tomada têm sido inconsistentes, e o processo de seleção clonal pode reduzir a heterogeneidade normalmente encontrada em tumores humanos32.

Métodos de enxerto específicos do cérebro, como a injeção intracraniana e intracarótida, permitem uma modelagem de metástases cerebrais mais consistente e eficiente. No método intracraniano33, as células cancerosas são tipicamente injetadas no córtex cerebral frontal, o que gera crescimento tumoral rápido e reprodutível com baixo envolvimento sistêmico. Embora o procedimento seja bem tolerado com baixa mortalidade33, as ressalvas são de que é uma abordagem relativamente grosseira que introduz rapidamente um bolo (localizado) de células no cérebro e não modela a patogênese precoce da metástase cerebral. A agulha danifica a vasculatura do tecido cerebral, o que causa inflamação localizada 5,34. Por experiência, há uma tendência de células tumorais injetadas para refluxo durante a remoção da agulha, levando ao envolvimento leptomeníngeo. Alternativamente, o método intracarotídeo entrega células na artéria carótida comum com microvasculatura cerebral como o primeiro leito capilar a ser encontrado, modelando a sobrevivência na circulação, extravasamento e colonização24. Concordando com outros25, nossa experiência com esse método constatou que ele pode resultar em tumores faciais devido à entrega não intencional de células cancerígenas através da artéria carótida externa para leitos capilares nesses tecidos (dados não publicados). É possível prevenir tumores faciais ligando primeiro a artéria carótida externa antes da injeção da artéria carótida comum (Figura 1). No resto do artigo, este método é referido como a "injeção interna da artéria carótida". A partir da experiência, o método de injeção da artéria carótida interna gera consistentemente metástases cerebrais com muito poucos eventos sistêmicos e tem sido bem-sucedido na geração de modelos de metástases cerebrais de diferentes cânceres primários (por exemplo, melanoma, mama e câncer de pulmão) (Figura 1). As desvantagens são que é tecnicamente desafiador, demorado, invasivo e requer otimização cuidadosa do número de células e um cronograma de monitoramento. Em resumo, os métodos de injeção intracraniana e interna da artéria carótida produzem modelos de camundongos adequados para avaliar o impacto terapêutico no benefício de sobrevida relacionado ao tumor cerebral.

Este protocolo descreve o método de injeção da artéria carótida interna para produzir um modelo de metástase cerebral em camundongo com quase nenhum envolvimento sistêmico e, portanto, adequado para avaliação pré-clínica da distribuição de medicamentos e eficácia da terapêutica experimental.

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Figura 1: Representação esquemática do protocolo de injeção da artéria carótida interna para metástase cerebral. A injeção interna da artéria carótida com ligadura externa da artéria carótida pode produzir de forma confiável um modelo de metástase cerebral de vários cânceres primários. Neste protocolo, três ligaduras são colocadas na artéria carótida (anotadas como L1-L3 na figura). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Todos os estudos foram conduzidos dentro das diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (UQCCR/186/19) e do Código Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos.

1. Preparação de células cancerosas para injeção

NOTA: Neste estudo, a linhagem celular de câncer de mama humano, BT-474 (BT474), foi usada. O BT474 foi cultivado em meio de crescimento completo composto por meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de insulina. As células foram mantidas em incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono na atmosfera aérea. Autentique a linhagem celular por repetição em tandem de satélite testando35, confirme a expressão da proteína repórter (por exemplo, luciferase), se houver, e verifique se há infecção por micoplasma.

  1. Sementes de células cancerosas BT474 a uma densidade de semeadura de 2,0 x 106 células em um frasco de T75 usando 10 mL de meio de crescimento completo e cultura (a 37 °C com 5% de CO2) a 70%-80% de confluência antes da injeção.
  2. No dia da injeção, descarte o meio de crescimento e lave a monocamada celular com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes.
  3. Adicionar 5 ml de reagente de dissociação da cultura celular pré-aquecida (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 5 min ou até que as células se desprendam. Após 5 minutos, bata suavemente no balão para ajudar no descolamento celular.
  4. Adicionar 5 mL de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino para extinguir a atividade do reagente de dissociação.
  5. Ressuscite suavemente as células pipetando para reduzir os aglomerados celulares.
  6. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL e centrifugar a 180 x g por 3 min à temperatura ambiente.
  7. Decant o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) sem cálcio e magnésio para minimizar a aglomeração celular.
  8. Centrifugar a suspensão da célula a 180 x g durante 3 min à temperatura ambiente.
  9. Decantar o sobrenadante para remover o soro residual/reagente de dissociação e ressuspender o pellet celular em 3 mL de HBSS.
  10. Coloque um filtro celular de 100 μm em um tubo cônico fresco de 50 mL e passe a suspensão celular para remover aglomerados celulares.
    NOTA: Uma suspensão de célula única é essencial para minimizar a oclusão dos vasos sanguíneos e o risco de acidente vascular cerebral na injeção.
  11. Calcule o número de células viáveis usando a exclusão de Trypan Blue e um hemocitômetro com métodos padrão.
  12. Diluir a suspensão celular com HBSS até uma concentração celular de 2,5 x 106 células/ml.
  13. Mantenha o tubo horizontal no gelo e agite suavemente o tubo periodicamente para minimizar a aglomeração. A suspensão celular pode ser armazenada no gelo por um período máximo de 6 h.
    NOTA: O balanço foi feito manualmente, mas isso também pode ser feito usando um agitador em baixas rotações.

2. Preparação do rato para o procedimento

NOTA: Neste estudo, 4-5 semanas de idade, fêmeas de NOD scid camundongos foram usados. Introduza alimentos de recuperação de dieta macia (por exemplo, gel dietético, hidrogel, ração de rato amassada) em camundongos 3 dias antes do procedimento para incentivar a alimentação após o procedimento.

  1. Ferramentas cirúrgicas de autoclave. Pulverize e limpe a área cirúrgica e o equipamento com desinfetante de superfície, seguido de etanol a 70%.
  2. Coloque um tapete de calor animal sob a placa cirúrgica para evitar a hipotermia. Ligue isso 30 minutos antes da cirurgia. Pulverize e limpe a placa cirúrgica com desinfetante de superfície seguido de etanol a 70%.
  3. Prepare uma gaiola de alojamento de animais limpa e uma almofada de aquecimento quente para recuperação.
  4. Coloque equipamentos de proteção individual limpos (bata, máscara, rede de cabelo e luvas). Mantenha a esterilidade durante todo o procedimento usando luvas de exame limpas e uma técnica de "apenas dicas de instrumentos".
  5. Anestesiar o rato com uma câmara anestésica utilizando isoflurano a 5% com um fluxo de oxigénio de 2 L/min até que o rato perca o reflexo do pedal.
  6. Retire o animal da câmara e coloque-o num cone nasal que forneça 2% de isoflurano a um fluxo de oxigénio de 2 L/min para o restante procedimento cirúrgico.
  7. Ear punch mouse para identificação e usar cortadores elétricos para raspar a pele da região do pescoço. Limpe o excesso de cabelo da pele exposta usando fita adesiva.
  8. Pese o rato para calcular as doses de anestésico e analgésico necessários. Administrar buprenorfina e meloxicam a 50 μg/kg e 1 mg/kg, respetivamente, através de injeção subcutânea.
  9. Transfira o mouse para uma placa cirúrgica quente e prenda o cone do nariz com fita adesiva.
  10. Aplique lubrificante ocular nos olhos para evitar a secagem.
  11. Prenda o rato suavemente prendendo primeiro os dentes incisivos superiores usando fio colado à placa cirúrgica, seguido de colar as patas dianteira e traseira. Este passo estende o corpo e mantém o pescoço reto durante o procedimento.
  12. Realizar a preparação pré-operatória da pele conforme descrito abaixo.
    1. Limpe o pescoço com antisséptico tópico (povidona-iodo) para reduzir a carga da microflora da pele e remover os pelos soltos. Limpe do centro da pele, trabalhando para fora para evitar a recontaminação do local da incisão. Repita o processo usando etanol a 70%. Realizar três rodadas alternadas de iodo e etanol para desinfecção.
    2. Coloque uma cortina cirúrgica sobre o animal. Este é cortado e moldado a partir de um pedaço de papel toalha estéril ou saco de autoclave.
  13. Coloque toalhas de papel estéreis ou sacos de autoclave para ferramentas cirúrgicas.
  14. Verifique se há reflexo através do 'teste de pinça' para garantir anestesia suficiente antes de continuar com o procedimento.

3. Injeção interna de carótida

NOTA: Neste experimento, uma cânula de infusão de 31 G e uma configuração de driver de seringa ativada pelo pé foi utilizada para facilitar o procedimento de injeção (Figura 1 Suplementar). Esta configuração é opcional e o usuário pode usar uma seringa de insulina 31 G e pular as etapas 3.11 e 3.12. Para preparar a cânula de perfusão, puxe e separe a porção da agulha da porção de encaixe da seringa de uma agulha 31 G utilizando dois pares de braçadeiras de sutura. Em seguida, prenda a porção da agulha a uma extremidade de uma tubulação de infusão fina de aproximadamente 10 cm de comprimento.

  1. Posicione o microscópio de dissecção sobre o rato.
  2. Usando uma tesoura, faça uma incisão vertical de 15 mm ao longo da linha média na região do pescoço a partir de 5 mm abaixo da mandíbula até a entrada torácica.
  3. Usando dois pares de pinça angulada, parta a pele e as glândulas salivares subjacentes e aplique afastadores para manter a traqueia exposta. O próximo passo irá expor a bainha carotídea que fica paralela à traqueia.
  4. Usando dois pares de pinça de ângulo fino, disseque sem rodeios o músculo e o tecido adiposo adjacente à traqueia para expor a bainha da carótida direita. A bainha carotídea é a camada fibrosa que cobre a artéria carótida comum, veia e nervo vago, e esse feixe pode ser visualizado pela artéria carótida comum vermelha brilhante. Neste estudo, a injeção foi realizada na artéria carótida direita.
  5. Limpe um segmento da artéria carótida comum caudal para a bifurcação carotídea da fáscia circundante e separe-o do nervo vago e das veias.
  6. Isole e limpe a bifurcação carotídea (a junção que une as artérias carótidas externas e internas) dos nervos e fáscia circundantes. Posicione pinças finas sob a artéria carótida externa e passe uma sutura de seda (5-0 espessura) sob a artéria. Amarre e aperte a sutura e corte o excesso de linha.
    NOTA: Esta ligadura (L1) impedirá que o injetado transite através da artéria carótida externa.
  7. Posicione pinças finas sob a artéria carótida comum e passe uma sutura de seda (5-0 de espessura) sob a artéria. Amarre um nó e aperte a sutura numa posição proximal ao local de injeção proposto. Corte o excesso de sutura deixando cerca de 10 mm de linha.
    NOTA: Esta segunda ligadura (L2) irá restringir o fluxo sanguíneo e sangramento após a injeção. Também é usado para posicionar e segurar a artéria carótida durante a injeção.
  8. Corte e umedeça uma tira de limpadores descartáveis (autoclavados) de fiapos baixos (ver Tabela de Materiais) cerca de 10 mm x 5 mm. Dobre a tira em 4 mm x 5 mm, 2-3 mm de espessura e coloque-a sob a artéria carótida no local proposto de injeção. Isto irá apoiar o vaso durante a injeção.
  9. Na artéria carótida comum rostral ao local de injeção proposto, coloque uma terceira ligadura (L3) com um nó solto. Este é apertado apenas após a injeção (no passo 3.16).
  10. Agite suavemente a suspensão celular e retire 200 μL de suspensão celular para uma seringa de insulina (com agulha de 31 G).
  11. Carregue a seringa no controlador da seringa que está ligado a um pedal de pé ativador.
  12. Colocar uma cânula fina com uma agulha de 31 G à seringa e preparar a linha.
  13. Verifique se a artéria carótida está bem posicionada e pressurizada.
  14. Usando duas pinças angulares finas, uma tensionando suavemente na extremidade da primeira ligadura e a outra segurando a agulha 31 G, insira lentamente a agulha com chanfro no lúmen do vaso sanguíneo, tomando cuidado para não perfurá-la.
  15. Injetar lentamente 100 μL de suspensão celular (a partir do passo 1.13) na artéria carótida comum a 10 μL/s. Isso fornecerá 2,5 x 105 células no vaso sanguíneo. A injeção bem-sucedida é visualizada através da limpeza do sangue do vaso sanguíneo carotídeo.
  16. Levante e aperte suavemente a ligadura solta (L3) (a partir do passo 3.9) imediatamente após a retirada da agulha para evitar o refluxo e hemorragia. Aparar o excesso de sutura.
    NOTA: É normal observar uma pequena quantidade de sangue jorrando após a retirada da agulha. No entanto, não deve haver qualquer sangramento ativo após a terceira ligadura ser apertada.
  17. Retire o pedaço de limpadores descartáveis umedecidos de fiapos baixos.
  18. Usando uma pipeta P200, lave a cavidade cirúrgica duas vezes com 150-200 μL de água estéril ou solução salina.
  19. Verifique novamente se há sangramento e, em seguida, remova os afastadores.
  20. Reposicione os tecidos moles, as glândulas salivares e a pele sobre a artéria carótida e a traqueia.
  21. Feche a camada de pele da incisão usando um suporte de agulha de sutura, pinça e uma sutura de monofilamento 6/0 absorvível ou não absorvível em um padrão contínuo.
  22. Descarte a seringa de agulha de cânula e prepare uma nova configuração para o próximo rato. O uso de uma nova seringa garantirá que o número de células injetadas em cada camundongo seja consistente.
    NOTA: Instantâneos representativos do procedimento estão na Figura 2 Suplementar. Se o vaso for perfurado ou rasgado pela agulha, indicado pelo vazamento de injetado ou sangramento, o procedimento é considerado malsucedido. Depois disso, a agulha deve ser retirada e a terceira ligadura deve ser imediatamente apertada para evitar mais sangramento. Se o sangramento for persistente após o aperto da sutura, o animal deve ser sacrificado com pentobarbital.

4. Recuperação pós-injeção

  1. Injete buprenorfina (50 μg/kg) e meloxicam (1 mg/kg) através de injeção subcutânea como alívio da dor pós-cirúrgica.
  2. Mova o animal para uma gaiola quente e limpa para se recuperar da anestesia. É normal que um animal tenha atividade moderada (amontoado e inativo ou movendo-se lentamente) depois de acordar.
  3. Após 30-45 min, transfira os ratos para uma instalação de detenção de longo prazo.
  4. Forneça aos ratos uma dieta suave (gel de dieta, hidrogel, purê) por pelo menos uma semana após a cirurgia e verifique o estado físico diariamente com atenção especial para sinais de acidente vascular cerebral, infecção, sangramento ao redor do local da ferida.
  5. Dois dias após a cirurgia, é típico que o animal tenha atividade reduzida, pelo leve e perda de 15% do peso corporal pré-operatório. Administrar analgésico (meloxicam) diariamente durante 2-3 dias pós-cirurgia para controlar a dor e ajudar na recuperação.
  6. A partir do dia 3, os animais devem ter recuperado a atividade, aumentado na frequência de alimentação e higiene e recuperado o peso. Eutanasiar animais com déficits persistentes de condição física (dor, amontoados, inativos, perda de peso) após 4 dias após a cirurgia, injetando pentobarbital sódico a 200 mg/kg via injeção intraperitoneal.
  7. O enxerto e a progressão do tumor podem ser monitorados usando anestesia e modalidade de imagem de escolha, como imagem bioluminescente, ressonância nuclear magnética (RNM) ou PET/RM. A exigência e a capacidade de realizar tais imagens dependerão inerentemente dos objetivos individuais do projeto e da instalação dentro da qual ela é realizada e, dependendo do tipo de identificação do repórter nas linhas celulares utilizadas, da acessibilidade das instalações relevantes de radioquímica e de imagem nuclear36,37
    NOTA: Alguns animais podem não responder bem e experimentar um acidente vascular cerebral, apesar de um procedimento bem sucedido. Após o procedimento, os animais que apresentem quaisquer sintomas de desconforto neurológico (virar a cabeça e puxar para um lado, comportamento circular, rolar, bater, perda da função motora) devem ser sacrificados imediatamente.

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Resultados

Comparando a injeção da artéria carótida comum com ou sem ligadura externa da artéria carótida
Quando as células cancerosas foram injetadas através da artéria carótida comum sem primeiro ligar a artéria carótida externa24, tumores faciais foram encontrados em 77,8% dos camundongos enxertados (n = 7/9 animais). Um exemplo de tumor facial é ilustrado na Figura Suplementar 3. O método descrito neste protocolo previne metástases fac...

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Discussão

A metástase cerebral é um processo complexo de células cancerosas que se espalham de seu local primário para o cérebro. Diferentes modelos animais estão disponíveis que espelham certos estágios desse processo de várias etapas e há considerações fisiológicas e práticas para o desenho de estudos pré-clínicos de metástases41,42. A maioria dos estudos publicados que investigam o uso da nanomedicina para o tratamento de metástases cerebrais utilizou ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo; na coleta, análise ou interpretação de dados; na redação do manuscrito ou na decisão de publicar o artigo.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho Nacional Australiano de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC), número de concessão APP1162560. O ML foi financiado por uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da UQ. Gostaríamos de agradecer a todos que ajudaram com a criação de animais e imagens in vivo dos animais. Agradecemos ao Royal Brisbane and Women's Hospital por doar alíquotas de zircônio para este estudo.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100µm cell strainerCorningCLS431752
30G Microlance needleBD23748
31G Ultra-Fine II insulin syringeBD326103
Angled forcepsProscitechT67A-SSFine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycoticThermoFisher Scientific15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell lineATCCHTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counterThermoFisher ScientificC10227
Diet-76AClearH2O72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forcepsProscitechDEF11063-07Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100inCole ParmerEW-06419-00
Foetal bovine serumThermoFisher Scientific26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesiumThermoFisher Scientific14170120
HydrogelClearH2O70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipersKimberly Clark- KimwipesZ188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose coneFashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) Bausch and lomb
Povidone-iodine solutionBetadine2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
RetractorsKent ScientificSURGI-5001
RPMI 1640 MediaThermoFisher Scientific11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cmEthiconJJ-640G
Sterile normal salineThermoFisher ScientificTM4469
Sticky tape
Surgical boardA chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissorsProscitechT104Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forcepsProscitechT113CCurved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)ProscitechTC1322-180length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pumpWorld Precision InstrumentsUMP3-3
T75 tissue culture flaskThermoFisher Scientific156499
Thread
Trigene II surface disinfectantCeva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientificC10228
TrypLE Express dissociating mediumThermoFisher Scientific12605010

Referências

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