太平洋水母干细胞样细胞的荧光原位杂交和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记

摘要

在这里，我们描述了一种用于可视化水母 Cladonema中干细胞样增殖细胞的协议。与干细胞标记物的全安装荧光 原位 杂交可以检测干细胞样细胞，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记可以鉴定增殖细胞。一起，可以检测到活跃增殖的干细胞样细胞。

摘要

刺胞动物，包括海葵、珊瑚和水母，表现出不同的形态和生活方式，表现为无柄息肉和自由游泳的美杜莎。正如 在Hydra 和 Nematostella等已建立的模型中的例子，干细胞和/或增殖细胞有助于刺胞珊瑚虫的发育和再生。然而，大多数水母的潜在细胞机制，特别是在美杜莎阶段，在很大程度上尚不清楚，因此，开发一种用于识别特定细胞类型的稳健方法至关重要。本文描述了一种可视化水生动物水母 Cladonema pacificum 中干细胞样增殖细胞的方案。 Cladonema medusae拥有分枝触手，在整个成虫阶段不断生长并保持再生能力，为研究增殖和/或干细胞样细胞协调的细胞机制提供了一个独特的平台。使用干细胞标记物的全安装荧光 原位 杂交（FISH）可以检测干细胞样细胞，而使用S相标记物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）进行脉冲标记可以鉴定增殖细胞。结合FISH和EdU标记，我们可以检测固定动物上活跃增殖的干细胞样细胞，并且该技术可以广泛应用于其他动物，包括非模型水母物种。

引言

刺胞动物被认为是一种基部分支的后生动物门，包含具有神经和肌肉的动物，使它们处于了解动物发育和^{生理学进化}的独特位置1^，2。刺胞动物分为两大类:花生动物（例如海葵和珊瑚）仅拥有扁平幼虫和无柄息肉阶段，而Medusozoa（水生动物，Staurozoa，Scyphozoa和Cubozoa的成员）通常采取自由游泳的水母或水母的形式，以及扁平幼虫和息肉。刺胞动物通常表现出很高的再生能力，其潜在的细胞机制，特别是它们拥有成体干细胞和增殖细胞，引起了人们的广泛关注^3，4。最初在Hydra中鉴定，水生干细胞位于外胚层上皮细胞之间的间质空间中，通常称为间质细胞或i细胞³。

水生动物i细胞具有共同的特征，包括多能性，广泛保守的干细胞标志物（例如，纳米，Piwi，Vasa）的表达和迁移潜力³，⁵，⁶，^7，8。作为功能性干细胞，i细胞广泛参与水生动物的发育、生理和环境反应，这证明了它们的高再生能力和可^塑性3。虽然干细胞与i细胞相似，尚未在水生动物之外发现，即使在已建立的模式物种Nematostella中，增殖细胞仍然参与体细胞组织的维持和再生以及生殖系⁹。由于刺胞动物发育和再生的研究主要在息肉型动物（如Hydra，Hydractinia和Nematostella）上进行，因此水母物种中干细胞的细胞动力学和功能在很大程度上仍未得到解决。

水生动物水母 Clytia hemisphaerica是一种 世界性水母物种，在世界各地（包括地中海和北美）具有不同的栖息地，已在几项发育和进化研究中被用作实验模型动物¹⁰。 Clytia 体积小、易于处理、卵大，适用于实验室维护，以及引入遗传工具，例如最近建立的转基因和敲除方法¹¹，为详细分析水母生物学背后的细胞和分子机制提供了机会。在 Clytia medusa 触手中，i细胞位于称为球茎的近端区域，线虫等祖细胞迁移到远端尖端，同时分化成不同的细胞类型，包括线细胞¹²。

在水母的口腔器官Clytia manubrium的再生过程中，存在于性腺中的Nanos1 ⁺ i细胞迁移到手稿因损伤而丢失的区域，并参与手稿^的再生7。这些发现支持了Clytia中的i细胞也表现为参与形态发生和再生的功能性干细胞的观点。然而，鉴于i细胞的性质在具有代表性的息肉型动物（如Hydra和Hydractinia³）之间有所不同，因此干细胞的特征和功能可能在水母物种中多样化。此外，除了Clytia之外，其他水母的实验技术受到限制，增殖细胞和干细胞的详细动力学未知¹³。

水生动物水母 Cladonema pacificum 是一种新兴的模式生物，可以在没有水泵或过滤系统的情况下保存在实验室环境中。Cladonema medusa具有分支触手，这是 Cladonematidae 家族的共同特征，并且在灯泡¹⁴附近的外胚层上有一个称为ocellus的感光器官。触手分支过程发生在沿着触手的近轴侧出现的新分支部位。随着时间的流逝，触手继续伸长并分枝，较老的枝条被推向尖端¹⁵。此外， Cladonema 触手可以在截肢后的几天内再生。最近的研究表明增殖细胞和干细胞样细胞在 Cladonema^16，17的触手分支和再生中的作用。然而，虽然传统的 原位 杂交（ISH）已被用于可视化 Cladonema中的基因表达，但由于其分辨率低，目前很难在细胞水平上详细观察干细胞动力学。

本文描述了一种通过FISH可视化Cladonema中的干细胞样细胞并与细胞增殖标志物EdU共染色的方法¹⁸。我们通过FISH可视化了干细胞标记⁵，17Nanos1的表达模式，这允许在单细胞水平上鉴定干细胞样细胞分布。此外，Nanos1表达与EdU标记的共染色使得区分活跃增殖的干细胞样细胞成为可能。这种监测干细胞样细胞和增殖细胞的方法可以应用于广泛的研究领域，包括触手分支、组织稳态和克拉多内玛的器官再生，类似的方法可以应用于其他水母物种。

研究方案

注意:有关本协议中使用的所有材料，试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 探针合成

1. 核糖核酸提取
   1. 使用切断吸头的 3.1 mL 移液管将三个在人工海水 （ASW） 中培养的活水母在 1.5 mL 管中，并尽可能多地去除 ASW。
      注意:ASW是通过用氯中和剂将矿物盐混合物溶解在自来水中制备的;最终比重（S.G.）为1.018或千分之几（ppt）为~27。
   2. 将 1.5 mL 管冷冻在液氮中以抑制 RNase 活性。从总RNA分离试剂盒中加入30 μL裂解缓冲液，其中添加了2-巯基乙醇（1 μL/100 μL裂解缓冲液），并使用匀浆器均质裂解缓冲液中的样品。
      注意:为避免缓冲液和样品从试管中溢出，建议使用少量裂解缓冲液进行均质化。
   3. 加入 570 μL 裂解缓冲液，按照总 RNA 分离试剂盒的方案提取总 RNA（图 1）。
   4. 使用分光光度计测量提取的RNA的浓度，并储存在-80°C直至使用。
2. cDNA合成
   1. 使用试剂盒，使用从水母中提取的总RNA作为模板合成cDNA（图 1和 表1）。
   2. 在65°C孵育5分钟。
   3. 在冰上迅速冷却。
   4. 使用步骤1.2.1中的混合物进行cDNA合成（表1）。通过移液充分混合并在42°C下孵育60分钟。
   5. 在95°C孵育5分钟。
   6. 在冰上迅速冷却。
   7. 使用分光光度计测量合成的cDNA的浓度，并储存在-20°C或以下直至使用。
3. PCR产物合成
   1. 要创建PCR模板，请使用引物-BLAST设计特异性引物。从NCBI数据或RNA-seq数据中获取参考序列。
      注意:有关本协议中使用的引物，请参阅 材料表 。
   2. 为了扩增靶序列，请进行TA克隆，这不需要使用限制性内切酶。要获得在3'端添加腺嘌呤的PCR产物，请使用以下设置:98°C2分钟;35个循环，98°C10秒，55-60°C30秒，72°C1分钟。 使用Taq DNA聚合酶进行反应（表1）。
      注意:要确定PCR条件，请遵循要使用的DNA聚合酶随附的方案，该方案通常提供推荐的退火温度和延长时间。
   3. 通过1%琼脂糖凝胶运行PCR产物并切出感兴趣的条带。使用凝胶提取试剂盒从切割的凝胶中提取PCR产物。
4. 结扎
   1. 通过混合试剂（表1）并在37°C下孵育30分钟，将PCR产物与3'胸腺嘧啶突出的载体连接（图1）。
      注意:载体:PCR的分子比例应为1:>3。pTA2 载体大小约为 3 kb。如果PCR产物（插入片段）为A（kb）和B（ng/μL），则要采集的插入片段（ 表1中的X）的体积可以通过（[50 ng载体×插入片段的A kb]）/（3 kb载体×[1/3]）= 50·插入的 ng。如果插入片段浓度为B ng/μL，则取体积为50·A / B μL插入物。
5. 转化和电镀
   1. 为了转化，在冰上解冻感受态细胞并将它们分配到每个 20 μL 等分试样中。加入 1 μL 含有 PCR 产物的质粒（小于感受态细胞体积的 5%）并涡旋 1 秒。在冰上孵育5分钟，然后在42°C下孵育45秒，涡旋1秒。
   2. 向感受态细胞中加入 180 μL 具有分解代谢抑制 （SOC） 培养基（营养丰富的细菌培养基）的超级最佳肉汤，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。30分钟后，将感受态细胞散布到含有氨苄西林，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-gal）和异丙基-β-d-1-吡喃硫代半乳糖苷（IPTG）的琼脂平板上，并在37°C孵育12-16小时（图1）。
      注意:X-gal和IPTG用于选择蓝色和白色菌落。
6. 液体培养
   1. 从盘子上的白色和蓝色菌落中挑选一个白色菌落。将其加入3-5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，并在37°C下在摇床上孵育12-16小时（图1）。
7. 迷你准备
   1. 使用质粒小制备从LB培养基中提取质粒（图1）。
   2. 使用分光光度计定量质粒浓度。
8. 阅读序列。
   1. 要读取质粒的DNA序列，请将质粒发送进行Sanger测序，然后使用软件将其与基因组/转录组序列进行比对，以确认靶序列是否正确合成，并评估靶序列插入质粒的方向（5'至3'或3'至5'）。
      注意:如果将靶序列从靠近3'端的RNA聚合酶结合位点以5'至3'方向插入质粒中，则可以通过 体外 转录产生反义探针。如果以相反的3'至5'方向插入目标序列，则可以生成检测探针（阴性对照）。如果使用pTA2等载体，则可以根据目的使用两个转录结合位点。
9. 体外 转录
   1. 通过使用质粒中RNA聚合酶结合位点（例如T7 / T3结合位点）外的引物进行PCR，从创建的质粒制备DNA模板（图1）。
      注意:通用引物（如M13-20正向引物和M13反向引物）可用于制备包含RNA聚合酶结合位点的DNA模板。
   2. PCR扩增后使用凝胶/ PCR提取试剂盒纯化模板。
   3. 混合如下所示的试剂，并在37°C下进行转录反应3小时（图 1和 表1）。
   4. 加入 1.5 μL 脱氧核糖核酸酶并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   5. 加入 10 μL 不含 RNase 的水，并使用净化柱从转录反应溶液中纯化探针。
   6. 通过将 1 μL 上样到 1% 琼脂糖凝胶上来检查合成 RNA 的大小，并使用分光光度计确定浓度。
      注意:合成的RNA探针的浓度应至少为100 ng / μL。
   7. 加入 30 μL 甲酰胺，在 −20 °C 或以下储存。

2. 教育合并和固定

1. 使用 3.5 mL 移液管将 Cladonema medusae（每管 5-10 只动物）放入 1.5 mL 管中，并加入 ASW 至总体积为 500 μL。 加入 7.5 μL 10 mM EdU 储备溶液，并将样品在 22 °C 下孵育 1 小时（图 2）。EdU最终浓度为150μM。
   注意:使用5-7天大的美杜莎监测第三分支的形成（图3A）。水母从息肉上分离的那一天算作第 1 天，在第 5 天，水母通常开始在其主触手上展示第三个分支。
2. 1小时后，尽可能多地去除含有EdU的ASW。
3. 为了麻醉水母，在H₂O中加入7%MgCl₂并孵育5分钟。
4. 在H₂O中除去7%MgCl 2，并在ASW中用4%多聚甲醛（PFA）在4°C下固定水母过夜（图2）。
   注意:在没有EdU掺入的情况下进行FISH时，可以像麻醉后用EdU处理的样品一样固定样品（步骤2.3-2.4）。

3. 荧光原位 杂交

1. 蛋白酶治疗和固定后
   1. 取出PFA，用含有0.1%吐温-20（PBST）的PBS洗涤样品3 x 10分钟。每次洗涤使用 300-500 μL PBST。
      注意:从此步骤到杂交结束，实验应在无RNA酶的环境中进行，戴手套和口罩。此步骤中的 1x PBS 必须使用 DEPC 处理过的水制成。杂交后，可以使用未经DEPC处理的水制成的1x PBS。一些ISH和FISH方案使用甲醇步骤使样品脱水，这使得可以将固定样品保存在-20°C直至使用。为了避免多余的工作，该方案省略了脱水过程，特别是因为样品可以在PBST中保存长达几天。
   2. 固定后，将样品放入摇床上的 1.5 mL 管中，抗 DIG-POD 抗体 O.N. 孵育步骤除外（步骤 3.4.2）。洗涤后，在PBST中加入10mg / mL蛋白酶K储备溶液，并将美杜莎与蛋白酶K（终浓度:10μg/ mL）在37°C孵育10分钟。
   3. 取出蛋白酶K溶液，用PBST洗涤样品2 x 1分钟。
   4. 为了后缀美杜莎，在1x PBS中加入4%PFA，并在37°C下孵育15分钟。
   5. 取出PFA溶液，用PBST洗涤样品2 x 10分钟。
      注意:如果靶基因高表达且背景信号低，则可以跳过步骤3.1.2-3.1.5。
2. 杂交
   1. 取出PBST并加入杂交缓冲液（HB缓冲液， 表1）。将样品在室温（RT）下在HB缓冲液中孵育15分钟。使用 300-400 μL HB 缓冲液，可为成功杂交提供足够的体积。
      注意:HB缓冲液，洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2用20x SSC储备制备。HB缓冲液储存在-20°C或以下，使用前必须置于室温。
   2. 移除 HB 缓冲液并添加新的 HB 缓冲液。在杂交培养箱中在55°C下预杂交至少2小时。
   3. 取出HB缓冲液，并与含有步骤1.9.7中储存的探针的HB缓冲液一起孵育（最终探针浓度:HB缓冲液中的0.5-1ng / μL）。在杂交培养箱中在55°C下杂交18-24小时（图2）。
      注意:FISH 信号强度和特异性可能因靶基因表达以及探针长度和特异性而异。为了增加强度，可以调整杂交持续时间（18-72小时）和温度（50-65°C）等参数，并且可以测试不同的探针。为了避免非特异性信号，可以修改蛋白酶K处理（浓度和持续时间）¹⁹。
3. 探头移除
   1. 取出含有探针的HB缓冲液，然后加入洗涤缓冲液1（表1）。用洗涤缓冲液1在55°C下洗涤样品2 x 15分钟。 使用 300-400 μL 洗涤缓冲液。
      注意:含有探针的HB缓冲液可以重复使用，最多约十次。不要丢弃，而是将含有探针的HB缓冲液储存在−20°C或以下。 使用前在55°C下预热洗涤缓冲液1，洗涤缓冲液2，2x SSC和PBST。
   2. 取出洗涤缓冲液1，然后加入洗涤缓冲液2（表1）。用洗涤缓冲液2在55°C下洗涤样品2 x 15分钟。
   3. 取出洗涤缓冲液 2，然后加入 2x SSC。在55°C下用2x SSC洗涤样品2 x 15分钟。
   4. 取出 2x SSC，然后加入预热的 PBST。在室温下用PBST洗涤样品1 x 15分钟。
4. 抗DIG抗体孵育
   1. 去除 PBST，然后加入 1% 封闭缓冲液。将样品在室温下孵育至少1小时，同时在摇杆上缓慢摇动。
      注意:通过稀释5%封闭缓冲液储备液新鲜制备1%封闭缓冲液（表1）。在下一次抗体反应之前检查样品，因为样品由于摇晃而容易粘在盖子的背面或壁上。
   2. 封闭后，除去1%封闭缓冲液，加入抗DIG-POD溶液（1:500，在1%封闭缓冲液中），并将样品在4°C孵育（图2）。
      注意:注意将孵育时间保持在12-16小时内，以防止检测到非特异性信号。
5. 检测DIG标记的探针
   1. 取出抗DIG-POD溶液，然后加入Tris-NaCl-吐温缓冲液（TNT， 表1）。用TNT在室温下洗涤样品3 x 10分钟。
      注意:使用酪胺信号放大（TSA）技术可针对辣根过氧化物酶标记的试剂（例如抗DIG-POD）提供更好的分辨率图像。
   2. 在扩增稀释缓冲液中稀释荧光染料偶联酪胺（Cy5-酪酰胺）储备溶液（1:50），制成活性Cy5-酪酰胺溶液（图2）。
   3. 尽可能多地去除TNT，然后加入活性Cy5-酪酰胺溶液。将样品在黑暗中孵育10分钟。
   4. 用PBST在黑暗中洗涤样品3 x 10分钟。
6. 检测教育
   注意:EdU试剂盒将掺入的EdU检测为荧光信号（图2）。
   1. 要制备EdU检测混合物，请如 表1所示混合组分。每个样品使用 100 μL EdU 检测混合物。
      注意:用超纯水稀释10x反应缓冲液添加剂，制备1x反应缓冲液添加剂。
   2. 删除 PBST，然后添加 EdU 检测鸡尾酒。在黑暗中孵育30分钟。
   3. 用PBST在黑暗中洗涤3 x 10分钟。
7. 脱氧核糖核酸染色
   1. 在PBST中稀释Hoechst 33342（1:500）以制备Hoechst溶液。删除 PBST，然后添加 Hoechst 解决方案。将样品在黑暗中孵育30分钟（图2）。
   2. 用PBST在黑暗中洗涤样品3-4 x 10分钟。
8. 安装
   1. 在载玻片上做一个银行，以防止样品被压碎。将乙烯基胶带涂在载玻片上并挖空中心。
   2. 使用切断吸头的 3.1 mL 转移移液器将水母转移到载玻片上的岸边。
      注意:注意不要让触手重叠。
   3. 用P200移液器取出任何PBST，然后缓慢加入70%甘油作为封片剂（图2）。
      注意:可以使用抗褪色封片剂代替70%甘油，以防止荧光褪色。
   4. 用镊子轻轻地将盖玻片放在水母上，并用透明的指甲油密封盖玻片的侧面。
   5. 如果不立即进行显微镜观察，请将载玻片保持在4°C的黑暗中。
9. 成像
   1. 使用激光扫描共聚焦显微镜获取图像。对于单细胞分辨率，请使用 40 倍油性镜头或更高放大倍率的镜头。
   2. 图像采集后，使用ImageJ / FIJI软件打开图像，并通过多点工具²⁰对EdU ⁺和/或Nanos1 ⁺阳性的细胞进行计数。

结果

Cladonema触手已被用作研究形态发生和再生的细胞过程的模型¹⁵，^16，17。触手结构由上皮管组成，其中干细胞样细胞或i细胞位于近端区域，称为触手球，并且沿着近轴侧将新分支依次添加到球茎远端区域的后部（图3A）¹⁵。以前的报告表明，细胞增殖在触手球和新的分支位点使用EdU?...

讨论

增殖细胞和干细胞是形态发生、生长和再生等各种过程中的重要细胞来源^21，22。本文描述了一种通过FISH和EdU标记在水母乳中对干细胞标记物Nanos1进行共染色的方法。先前使用EdU或BrdU标记的工作表明，增殖细胞定位于触手球¹⁶，^17，但它们的分子特征尚不清楚。本研究显示了增殖细胞分布和Nano...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Wako	137-06862
3.1 mL transfer pipette	Thermo Scientific	233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Wako	029-15043
anti-DIG-POD	Roche	11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer			5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer			5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer			5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer			5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen	C10337	EdU kit
Coroline off	GEX Co. ltd	N/A	chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent	Roche	11175041910	blocking buffer
DIG RNA labeling mix	Roche	11277073910
DTT	Promega	P117B
ECOS competent cell DH5α	NIPPON GENE	316-06233	competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit	Fast gene	FG-91302	gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit	Fast gene	FG-90502	plasmid miniprep
Formamide	Wako	068-00426
Heparin sodium salt from porcine	SIGMA-ALDRICH	H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)	Wako	096-05143
LB Agar	Invitrogen	22700-025	agar plate
LB Broth Base	Invitrogen	12780-052	LB medium
Maleic acid	Wako	134-00495
mini Quick spin RNA columns	Roche	11814427001	clean-up column
NaCl	Wako	191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	Wako	166-21115
PowerMasher 2	nippi	891300	homogenizer
Proteinase K	Nacarai Tesque	29442-14
RNase Inhibitor	TaKaRa	2313A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74004	total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)	TaKaRa	T9172
SEA LIFE	Marin Tech	N/A	mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase	Roche	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche	10881767001
TAITEC HB-100	TAITEC	0040534-000	Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A	Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit	TaKaRa	6210A	cDNA synthesis kit
Target Clone	TOYOBO	TAK101	pTA2 Vector
tRNA	Roche	10109541001
TSA Plus Cyanine 5	AKOYA Biosciences	NEL745001KT	tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880	ZEISS	N/A	laser scanning confocal microscope