Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה Cladonema. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה עם סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. יחד, ניתן לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל.

Abstract

קנידריאנים, כולל שושנות ים, אלמוגים ומדוזות, מפגינים מורפולוגיה ואורחות חיים מגוונים המתבטאים בפוליפים ססיליים ובמדוזות שחייה חופשית. כפי שמודגם במודלים מבוססים כגון הידרה ונמטוסטלה, תאי גזע ו/או תאים מתרבים תורמים להתפתחות והתחדשות של פוליפים קנידריים. עם זאת, המנגנונים התאיים הבסיסיים ברוב המדוזות, במיוחד בשלב המדוזה, אינם ברורים במידה רבה, ולכן פיתוח שיטה איתנה לזיהוי סוגי תאים ספציפיים הוא קריטי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum. ל-Cladonema medusae יש זרועות ציד מסועפות שגדלות ללא הרף ושומרות על יכולת התחדשות לאורך כל שלב הבוגרים שלהן, ומספקות פלטפורמה ייחודית שבאמצעותה ניתן לחקור את המנגנונים התאיים המתוזמרים על ידי תאים מתרבים ו/או דמויי גזע. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה (FISH) באמצעות סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, בעוד תיוג פולסים עם 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), סמן שלב S, מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. בשילוב של תיוג FISH ו-EdU, אנו יכולים לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל על בעלי חיים קבועים, וטכניקה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על בעלי חיים אחרים, כולל מיני מדוזות שאינן דוגמניות.

Introduction

Cnidaria נחשב לגוף מטזואני מסתעף בסיסי המכיל בעלי חיים עם עצבים ושרירים, מה שמציב אותם בעמדה ייחודית להבנת האבולוציה של התפתחות בעלי חייםופיזיולוגיה 1,2. קנידרים מסווגים לשתי קבוצות עיקריות: אנתוזואה (למשל, שושנות ים ואלמוגים) הם בעלי זחלי פלנולה בלבד ושלבי פוליפ ססיליים, בעוד שמדוסוזואה (חברי הידרוזואה, סטאורוזואה, סקיפוזואה וקובוזואה) לובשים בדרך כלל צורה של מדוזה בשחייה חופשית, או מדוזות, כמו גם זחלי פלנולה ופוליפים. קנידריאנים מפגינים בדרך כלל יכולת התחדשות גבוהה, והמנגנונים התאיים הבסיסיים שלהם, במיוחד החזקתם בתאי גזע בוגרים ובתאים מתרבים, משכו תשומת לב רבה 3,4. תאי גזע הידרוזואניים, שזוהו לראשונה בהידרה, ממוקמים בחללים הבין-תאיים שבין תאי אפיתל אקטודרמליים והם מכונים בדרך כלל תאים אינטרסטיציאליים או תאי i3.

תאי i הידרוזואניים חולקים מאפיינים משותפים הכוללים ריבוי פוטנציות, ביטוי של סמני תאי גזע שהשתמרו באופן נרחב (למשל, נאנוס, פיווי, ואסה), ופוטנציאל נדידה 3,5,6,7,8. כתאי גזע פונקציונליים, תאי i מעורבים באופן נרחב בהתפתחות, בפיזיולוגיה ובתגובות הסביבתיות של בעלי חיים הידרוזואניים, מה שמעיד על יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהםופלסטיותם 3. בעוד שתאי גזע, בדומה לתאי i, לא זוהו מחוץ להידרוזואנים, אפילו במין המודל המבוסס Nematostella, תאים מתרבים עדיין מעורבים בתחזוקה והתחדשות של רקמות סומטיות, כמו גם בקו הנבט9. מכיוון שמחקרים בהתפתחות והתחדשות של מדוזות נערכו בעיקר על בעלי חיים מסוג פוליפ כמו הידרה, הידרקטיניה ונמטוסטלה, הדינמיקה התאית והתפקודים של תאי גזע במיני מדוזות נותרו ברובם ללא שינוי.

המדוזה ההידרוזואנית Clytia hemisphaerica , מין מדוזה קוסמופוליטית עם בתי גידול שונים ברחבי העולם, כולל הים התיכון וצפון אמריקה, שימשה כחיית מודל ניסיונית במספר מחקרים התפתחותיים ואבולוציוניים10. עם גודלה הקטן, הטיפול הקל והביציות הגדולות שלה, Clytia מתאימה לתחזוקת מעבדה, כמו גם להכנסת כלים גנטיים כגון שיטות הטרנסגנזה והנוקאאוטשנקבעו לאחרונה 11, מה שפותח את ההזדמנות לניתוח מפורט של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס הביולוגיה של המדוזות. בזרועות הציד Clytia medusa , תאי i ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא הנורה, ואבות אבים כגון נמטובלסטים נודדים לקצה הדיסטלי תוך התמיינות לסוגי תאים שונים, כולל נמטוציטים12.

במהלך התחדשות של Clytia manubrium, איבר הפה של מדוזות, Nanos1 + i-תאים הנמצאים בגונדות נודדים לאזור שבו manubrium הוא איבד בתגובה לנזק ולהשתתף התחדשות של manubrium7. ממצאים אלה תומכים ברעיון שתאי i בקליטיה מתנהגים גם כתאי גזע פונקציונליים המעורבים במורפוגנזה ובהתחדשות. עם זאת, בהתחשב בכך המאפיינים של תאי i שונים בין בעלי חיים מייצגים מסוג פוליפ כגון הידרה ו Hydractinia3, ייתכן כי המאפיינים והפונקציות של תאי גזע מגוונים בין מיני מדוזות. יתר על כן, למעט קליטיה, טכניקות ניסיוניות הוגבלו עבור מדוזות אחרות, והדינמיקה המפורטת של תאים מתרבים ותאי גזע אינה ידועה13.

המדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum היא אורגניזם מודל מתפתח שניתן לשמור בסביבת מעבדה ללא משאבת מים או מערכת סינון. למדוזה Cladonema יש זרועות ציד מסועפות, מאפיין נפוץ במשפחת Cladonematidae, ואיבר פוטורצפטור הנקרא ocellus בשכבה האקטודרמלית ליד הנורה14. תהליך הסתעפות זרועות הציד מתרחש באתר הסתעפות חדש המופיע לאורך הצד האדאקסיאלי של זרוע הציד. עם הזמן, זרועות הציד ממשיכות להתארך ולהסתעף, כאשר הענפים הישנים נדחקים החוצה לכיוון קצה15. בנוסף, זרועות הקלדונמה יכולות להתחדש תוך מספר ימים לאחר קטיעה. מחקרים אחרונים הציעו את תפקידם של תאים מתרבים ותאים דמויי גזע בהסתעפות זרועות ציד והתחדשות בקלדונמה16,17. עם זאת, בעוד הכלאה קונבנציונלית באתרה (ISH) נוצלה כדי לדמיין ביטוי גנים בקלדונמה, בשל הרזולוציה הנמוכה שלה, כיום קשה לצפות בדינמיקה של תאי גזע ברמה התאית בפירוט.

מאמר זה מתאר שיטה להדמיית תאים דמויי גזע בקלדונמה על ידי FISH וצביעה משותפת עם EdU, סמן של התפשטות תאים18. אנו מדמיינים את תבנית הביטוי של Nanos1, סמן תאי גזע 5,17, על ידי FISH, המאפשרת זיהוי של התפלגות תאים דמויי גזע ברמת התא הבודד. בנוסף, הצביעה המשותפת של ביטוי Nanos1 עם תיוג EdU מאפשרת להבחין בין תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל. שיטה זו לניטור תאים דמויי גזע ותאים מתרבים יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של אזורי חקירה, כולל הסתעפות זרועות ציד, הומאוסטזיס רקמות והתחדשות איברים בקלדונמה, וגישה דומה יכולה להיות מיושמת על מיני מדוזות אחרים.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. סינתזת בדיקה

  1. מיצוי RNA
    1. הניחו שלוש מדוזות Cladonema חיות שגודלו במי ים מלאכותיים (ASW) בצינור של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה של 3.1 מ"ל עם קצה מנותק, והסירו כמה שיותר ASW.
      הערה: ASW מוכן על ידי המסת תערובת של מלחים מינרליים במי ברז עם מנטרל כלור; כוח המשיכה הסגולי הסופי (S.G.) הוא 1.018 או החלקים לאלף (ppt) הוא ~27.
    2. הקפיאו את צינורות ה-1.5 מ"ל בחנקן נוזלי כדי לעכב את פעילות ה-RNase. הוסף 30 μL של מאגר ליזיס מתוך ערכת בידוד ה-RNA הכוללת שבה נוספו 2-mercaptoethanol (1 μL/100 μL של חיץ ליזה) והומוגניות של הדגימות במאגר הליזיס באמצעות הומוגנייזר.
      הערה: כדי למנוע הצפה של המאגר ודגימה מהצינורות, מומלץ הומוגניזציה עם כמות קטנה של מאגר תזה.
    3. הוסיפו 570 μL של מאגר ליזה והוציאו את סך הרנ"א בהתאם לפרוטוקול של ערכת הבידוד הכוללת של רנ"א (איור 1).
    4. יש למדוד את ריכוז הרנ"א המופק באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן בטמפרטורה של 80°C- עד לשימוש.
  2. סינתזת cDNA
    1. באמצעות ערכה, סנתז cDNA באמצעות סך הרנ"א המופק מהמדוזה כתבנית (איור 1 וטבלה 1).
    2. דגירה ב-65°C למשך 5 דקות.
    3. מצננים במהירות על קרח.
    4. בצע סינתזת cDNA עם התערובת משלב 1.2.1 (טבלה 1). מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודגירה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    5. דגירה ב-95°C למשך 5 דקות.
    6. מצננים במהירות על קרח.
    7. יש למדוד את ריכוז ה-cDNA המסונתז באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן בטמפרטורה של 20°C- או מתחת ל-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. סינתזת מוצר PCR
    1. כדי ליצור תבנית PCR, עצב את הפריימר הספציפי באמצעות Primer-BLAST. מקור רצף הייחוס מנתוני NCBI או מנתוני RNA-seq.
      הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הפריימרים המשמשים בפרוטוקול זה.
    2. כדי להגביר את רצף היעד, בצע שיבוט TA, שאינו דורש שימוש באנזימי הגבלה. כדי לקבל מוצר PCR שבו אדנין נוסף בקצה 3 ', השתמש בהגדרות הבאות: 98 °C למשך 2 דקות; 35 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
      הערה: כדי לקבוע את תנאי ה-PCR, פעל לפי הפרוטוקול המלווה את ה-DNA פולימראז שבו יש להשתמש, שבדרך כלל מספק טמפרטורת חישול מומלצת וזמן הארכה.
    3. הפעל את מוצר ה- PCR באמצעות ג'ל אגרוז של 1% וחתך את רצועת העניין. חלצו את מוצרי ה-PCR מהג'לים החתוכים באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.
  4. קשירה
    1. הצמידו את מכפלת ה-PCR לווקטור באמצעות תימין בגודל 3' על-ידי ערבוב הריאגנטים (טבלה 1) ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (איור 1).
      הערה: היחס המולקולרי של וקטור:PCR צריך להיות 1:>3. גודל וקטור pTA2 הוא כ 3 kb. אם מכפלת ה-PCR (הוספה) היא A (kb) ו-B (ng/μL), ניתן לחשב את נפח ההוספה (X בטבלה 1) שיש לקחת על-ידי ([50 ננוגרם של וקטור × קילו-בייט של הוספה])/(3 קילו-× וקטורי [1/3]) = 50· ng של הוספה. אם ריכוז התוספת הוא B ng/μL, אז הנפח שנלקח הוא 50· A/B μL של הוספה.
  5. טרנספורמציה וציפוי
    1. לצורך טרנספורמציה, הפשירו את התאים המוכשרים על הקרח וחילקו אותם ל-20 μL aliquots כל אחד. הוסף 1 μL של פלסמידים המכילים את המוצר PCR (פחות מ 5% של נפח התא המוסמך) ומערבולת במשך 1 s. דגירה על קרח במשך 5 דקות, ולאחר מכן דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות, מערבולת במשך 1 שניות.
    2. יש להוסיף 180 מיקרו-ליטר של ציר Super Optimal עם מדיום דיכוי קטבוליטים (SOC) (מדיום תרבית חיידקים עשיר מבחינה תזונתית) לתאים המוכשרים ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, מרחו את התאים המתאימים על צלחת אגר המכילה אמפיצילין, 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-בטא-D-גלקטו-פירנוסייד (X-gal), ואיזופרופיל-β-d-1-תיוגלקטופיראנוזיד (IPTG), ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות (איור 1).
      הערה: X-gal ו- IPTG משמשים לבחירת מושבות כחולות ולבנות.
  6. תרבות נוזלית
    1. בחר מושבה לבנה מתוך המושבות הלבנות והכחולות על הצלחת. הוסיפו אותו ל-3-5 מ"ל של LB בינוני עם אמפיצילין ודגרו על שייקר במשך 12-16 שעות ב-37 מעלות צלזיוס (איור 1).
  7. מיניפרפ
    1. חלצו את הפלסמיד ממדיום ה-LB באמצעות מיניפרפ פלסמיד (איור 1).
    2. לכמת את ריכוז הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר.
  8. קרא את הרצף.
    1. כדי לקרוא את רצף הדנ"א של הפלסמיד, שלח את הפלסמיד לריצוף סנגר ולאחר מכן השתמש בתוכנה כדי ליישר אותו עם רצף הגנום/תעתיק כדי לאשר אם רצף המטרה מסונתז כראוי ולהעריך באיזה כיוון רצף המטרה מוכנס לפלסמיד (5' עד 3' או 3' עד 5').
      הערה: אם רצף המטרה מוכנס לפלסמיד בכיוון 5' עד 3' מאתר קשירת ה-RNA פולימראז בסמוך לקצה ה-3', ניתן ליצור בדיקה אנטיסנסואלית על-ידי שעתוק במבחנה . אם רצף המטרה מוכנס בכיוון ההפוך 3' עד 5', ניתן ליצור בדיקה חושית (בקרה שלילית). אם משתמשים בווקטורים כגון pTA2, ניתן להשתמש בשני אתרי קשירה של תמלול בהתאם למטרה.
  9. תמלול במבחנה
    1. הכינו את תבנית הדנ"א מהפלסמיד שנוצר על-ידי ביצוע PCR באמצעות פריימרים מחוץ לאתר הקישור של RNA פולימראז (לדוגמה, אתרי קשירה T7/T3) בפלסמיד (איור 1).
      הערה: ניתן להשתמש בפריימרים אוניברסליים כגון פריימר קדמי M13-20 ופריימר הפוך M13 להכנת תבנית DNA הכוללת אתרי קשירה של RNA פולימראז.
    2. טהרו את התבנית לאחר הגברת PCR באמצעות ערכת מיצוי ג'ל/PCR.
    3. ערבבו את הריאגנטים המוצגים להלן, ובצעו את תגובת השעתוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות (איור 1 וטבלה 1).
    4. יש להוסיף 1.5 μL של DNase ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    5. הוסף 10 μL של מים ללא RNase וטהר את הבדיקה מתמיסת תגובת השעתוק באמצעות עמודת ניקוי.
    6. בדוק את גודל ה- RNA המסונתז על ידי טעינת 1 μL על ג'ל אגרוז של 1% וקבע את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: בדיקות RNA מסונתזות צריכות להיות בריכוז של לפחות 100 ng/μL.
    7. הוסף 30 μL של formamide לאחסון בטמפרטורה של −20 °C או פחות.

2. התאגדות וקיבעון של EdU

  1. הנח את Cladonema medusae (5-10 בעלי חיים לכל צינור) בצינורות של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה להעברה של 3.5 מ"ל והוסף ASW עד לנפח כולל של 500 μL. הוסף 7.5 μL של תמיסת מלאי EdU של 10 mM ודגר את הדגימות במשך שעה אחת ב-22 °C (איור 2). הריכוז הסופי של EdU הוא 150 מיקרומטר.
    הערה: השתמשו במדוזה בת 5-7 ימים כדי לעקוב אחר היווצרות ענף שלישי (איור 3A). היום שבו המדוזה מתנתקת מהפוליפ נספרת כיום 1, וביום החמישי, המדוזות בדרך כלל מתחילות להציג ענף שלישי על זרועות הציד העיקריות שלהן.
  2. לאחר שעה אחת, הסר כמה שיותר ASW המכיל EdU.
  3. כדי להרדים את המדוזה, להוסיף 7% MgCl 2 ב H2 O ולדגור במשך5 דקות.
  4. הסירו את ה-7% MgCl 2 ב-H 2 O וקבעו את המדוזה למשך הלילה (O.N.) ב-4 מעלות צלזיוס עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-ASW (איור 2).
    הערה: בעת ביצוע FISH ללא שילוב EdU, ניתן לתקן דגימות באופן דומה לאלה שטופלו ב- EdU לאחר הרדמה (שלבים 2.3-2.4).

3. הכלאה פלואורסצנטית באתרה

  1. טיפול בפרוטאינאז ופוסט קיבוע
    1. הסר את ה- PFA ושטוף את הדגימות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 (PBST) למשך 3 x 10 דקות. יש להשתמש ב-300-500 מיקרו-ליטר PBST לכל כביסה.
      הערה: משלב זה ועד סוף ההכלאה, הניסוי צריך להתבצע בסביבה נטולת RNase, כשהוא לובש כפפות ומסכה. 1x PBS בשלב זה חייב להתבצע עם מים מטופלים DEPC. לאחר הכלאה, 1x PBS שנעשו עם מים ללא טיפול DEPC ניתן להשתמש. חלק מהפרוטוקולים של ISH ו-FISH מייבשים דגימות באמצעות שלבי מתנול, מה שמאפשר לשמור את הדגימות הקבועות בטמפרטורה של 20°C- עד לשימוש. כדי למנוע עבודה מיותרת, תהליך התייבשות מושמט מפרוטוקול זה, במיוחד מכיוון שניתן לשמור את הדגימות ב- PBST עד מספר ימים.
    2. לאחר הקיבוע, הניחו את הדגימה בצינורות של 1.5 מ"ל על שייקר, למעט שלב הדגירה נגד נוגדן DIG-POD O.N. (שלב 3.4.2). לאחר הכביסה, יש להוסיף תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase K ב-PBST ולדגור על המדוזה עם פרוטאינאז K (ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם/מ"ל) בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות.
    3. הסר את תמיסת Proteinase K ושטוף את הדגימות במשך 2 x 1 דקות עם PBST.
    4. כדי לפרסם את המדוזה, יש להוסיף 4% PFA ב-PBS אחד ולדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. הסר את תמיסת PFA ושטוף את הדגימות במשך 2 x 10 דקות עם PBST.
      הערה: אם גן המטרה מתבטא מאוד עם אות רקע נמוך, ניתן לדלג על שלבים 3.1.2-3.1.5.
  2. הכלאה
    1. הסר את ה- PBST והוסף מאגר היברידיזציה (מאגר HB, טבלה 1). דגירה של הדגימות ב-HB Buffer למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השתמש ב- 300-400 μL של HB Buffer, המספק נפח מספיק להיברידיזציה מוצלחת.
      הערה: מאגר HB, מאגר כביסה 1 ומאגר כביסה 2 מוכנים עם מלאי SSC של 20x. HB Buffer מאוחסן בטמפרטורה של −20°C או מתחת לכך, ויש להביא אותו ל-RT לפני השימוש.
    2. הסר את מאגר HB והוסף מאגר HB חדש. קדם-הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות באינקובטור הכלאה.
    3. הסר את מאגר HB ודגר עם HB Buffer המכיל את הגשושיות שאוחסנו בשלב 1.9.7 (ריכוז בדיקה סופי: 0.5-1 ng/μL במאגר HB). הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות (איור 2) באינקובטור הכלאה.
      הערה: עוצמת האות והספציפיות של FISH עשויות להשתנות בהתאם לביטוי גני היעד, כמו גם לאורך הבדיקה ולספציפיותה. כדי להגביר את העוצמה, ניתן להתאים פרמטרים כגון משך הכלאה (18-72 שעות) וטמפרטורה (50-65 מעלות צלזיוס), וניתן לבדוק בדיקות שונות. כדי למנוע אותות לא ספציפיים, טיפול Proteinase K (ריכוז ומשך) ניתן לשנות19.
  3. הסרת בדיקה
    1. הסר את מאגר HB המכיל בדיקות ולאחר מכן הוסף את מאגר Wash 1 (טבלה 1). שטפו את הדוגמאות עם Wash Buffer 1 למשך 2 x 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. יש להשתמש ב-300-400 μL של מאגר כביסה.
      הערה: ניתן להשתמש במאגר HB המכיל בדיקות שוב ושוב, עד כעשר פעמים. במקום להשליך, אחסן את מאגר HB המשומש המכיל בדיקות ב- −20 מעלות צלזיוס או מתחתיהן. לפני השימוש יש לחמם מראש את חיץ הכביסה, את מאגר הכביסה 2, את ה-2x SSC ואת ה-PBST בטמפרטורה של 55°C לפני השימוש.
    2. הסר את מאגר הכביסה 1 ולאחר מכן הוסף את מאגר הכביסה 2 (טבלה 1). שטפו את הדוגמאות עם Wash Buffer 2 למשך 2 x 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את Wash Buffer 2 ולאחר מכן הוסף 2x SSC. לשטוף את הדגימות עם 2x SSC במשך 2 x 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.
    4. הסר 2x SSC ולאחר מכן הוסף PBST שחומם מראש. שטפו את הדגימות במשך 1 x 15 דקות עם PBST ב- RT.
  4. דגירה של נוגדנים נגד DIG
    1. הסר PBST ולאחר מכן הוסף מאגר חסימה של 1%. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת לפחות ב-RT תוך כדי ניעור איטי על נדנדה.
      הערה: הכן מאגר חוסם 1% טרי על ידי דילול מלאי מאגר חוסם של 5% (טבלה 1). בדוק את הדגימות לפני תגובת הנוגדנים הבאה מכיוון שהדגימה נוטה להידבק לחלק האחורי של המכסה או הקיר כתוצאה מרעידות.
    2. לאחר החסימה, הסר את מאגר החסימה של 1%, הוסף פתרון נגד DIG-POD (1:500, במאגר חסימה של 1%), ודגירה של דגימות O.N. ב-4 מעלות צלזיוס (איור 2).
      הערה: הקפד לשמור על זמן הדגירה בטווח של 12-16 שעות כדי למנוע זיהוי של אותות לא ספציפיים.
  5. זיהוי בדיקה עם תווית DIG
    1. הסר את הפתרון נגד DIG-POD ולאחר מכן הוסף את Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, טבלה 1). שטפו את הדגימות עם TNT במשך 3 x 10 דקות ב- RT.
      הערה: השימוש בטכניקת הגברת אות הטירמיד (TSA) מספק תמונה ברזולוציה טובה יותר כנגד ריאגנטים בעלי תווית פרוקסידאז חזרת (לדוגמה, anti-DIG-POD).
    2. דילול תמיסת מלאי של טירמיד מצומד צבע פלואורסצנטי (Cy5-tyramide) (1:50) במאגר דילול ההגברה כדי ליצור את תמיסת Cy5-tyramide הפעילה (איור 2).
    3. הסר כמה שיותר TNT ולאחר מכן הוסף את הפתרון Cy5-tyramide פעיל. לדגור את הדגימות במשך 10 דקות בחושך.
    4. לשטוף את הדגימות עם PBST במשך 3 x 10 דקות בחושך.
  6. זיהוי של EdU
    הערה: ערכת EdU מזהה EdU משולב כאותות פלואורסצנטיים (איור 2).
    1. כדי להכין את קוקטייל זיהוי EdU, ערבבו את הרכיבים כפי שמוצג בטבלה 1. השתמש ב-100 μL של קוקטייל זיהוי EdU עבור כל דגימה.
      הערה: הכן תוסף מאגר תגובה 1x על ידי דילול תוסף מאגר תגובה 10x עם מים טהורים במיוחד.
    2. הסר PBST ולאחר מכן הוסף את קוקטייל זיהוי EdU. לדגור בחושך במשך 30 דקות.
    3. לשטוף עם PBST במשך 3 x 10 דקות בחושך.
  7. צביעת דנ"א
    1. דילול Hoechst 33342 (1:500) ב- PBST כדי להכין את פתרון Hoechst. הסר את ה- PBST ולאחר מכן הוסף את פתרון Hoechst. דגרו את הדגימות במשך 30 דקות בחושך (איור 2).
    2. לשטוף את הדגימות עם PBST במשך 3-4 x 10 דקות בחושך.
  8. הרכבה
    1. צור בנק על שקופית הזכוכית כדי למנוע את ריסוק הדגימה. מרחו את סרט הוויניל על שקופית הזכוכית והחללו את המרכז.
    2. העבירו את המדוזה לגדה שעל זכוכית השקופיות באמצעות פיפטה להעברה של 3.1 מ"ל כשהקצה נחתך.
      הערה: יש להיזהר שלא לתת לזרועות הציד לחפוף.
    3. הסר כל PBST עם פיפטה P200, ולאחר מכן הוסף באיטיות 70% גליצרול כמדיום ההרכבה (איור 2).
      הערה: במקום 70% גליצרול, ניתן להשתמש במדיום הרכבה מונע דהייה כדי למנוע את דהיית הפלואורסצנטיות.
    4. יש להניח בעדינות כיסוי על המדוזה בעזרת מלקחיים, ולאטום את צד הכיסוי עם לק שקוף.
    5. שמור את השקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך אם לא מבצע מיד תצפית מיקרוסקופיה.
  9. דימות
    1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר כדי להשיג תמונות. לרזולוציה של תא בודד, השתמש בעדשת שמן של 40x או בעדשה להגדלה גבוהה יותר.
    2. לאחר רכישת התמונה, פתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ/FIJI וספור תאים חיוביים עבור EdU+ ו/או Nanos1+ על ידי הכלי הרב-נקודתי20.

תוצאות

זרועות הציד של קלדונמה שימשו כמודל לחקר התהליכים התאיים של מורפוגנזה והתחדשות15,16,17. מבנה זרועות הציד מורכב מצינור אפיתל שבו תאים דמויי גזע, או תאי i, ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא נורת זרועות ציד, וענפים חדשים מתווספים ברצף לחלק האח...

Discussion

תאים מתרבים ותאי גזע הם מקורות תאיים חשובים בתהליכים שונים כגון מורפוגנזה, גדילה והתחדשות21,22. מאמר זה מתאר שיטה להכתמה משותפת של סמן תאי הגזע Nanos1 על ידי תיוג FISH ו- EdU ב- Cladonema medusae. עבודות קודמות שהשתמשו בתיוג EdU או BrdU הציעו כי תאים מתרבים מתמקמים לנור?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי AMED תחת מענק מספר JP22gm6110025 (ל- Y.N.) ועל ידי מענק JSPS KAKENHI מספר 22H02762 (ל- Y.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol Wako137-06862
3.1 mL transfer pipetteThermo Scientific233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Wako029-15043
anti-DIG-PODRoche11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dyeInvitrogen C10337EdU kit
Coroline offGEX Co. ltdN/Achlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking ReagentRoche11175041910blocking buffer 
DIG RNA labeling mix Roche11277073910
DTT PromegaP117B
ECOS competent cell DH5αNIPPON GENE316-06233competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kitFast geneFG-91302gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kitFast geneFG-90502plasmid miniprep
FormamideWako 068-00426
Heparin sodium salt from porcineSIGMA-ALDRICH H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)Wako096-05143
LB AgarInvitrogen22700-025agar plate
LB Broth BaseInvitrogen12780-052LB medium
Maleic acidWako134-00495
mini Quick spin RNA columnsRoche11814427001clean-up column
NaClWako 191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-FiThermo ScientificND-ONEC-Wspectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)Wako 166-21115
PowerMasher 2nippi 891300homogenizer
Proteinase KNacarai Tesque 29442-14
RNase InhibitorTaKaRa2313A
RNeasy Mini kitQiagen 74004total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)TaKaRaT9172
SEA LIFEMarin TechN/Amixture of mineral salts
T3 RNA polymerase Roche11031163001
T7 RNA polymerase Roche10881767001
TAITEC HB-100TAITEC0040534-000Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001ATaq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis KitTaKaRa6210AcDNA synthesis kit
Target CloneTOYOBO TAK101pTA2 Vector
tRNARoche10109541001
TSA Plus Cyanine 5AKOYA BiosciencesNEL745001KTtyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880ZEISSN/Alaser scanning confocal microscope

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186FISHEdUCladonema pacificum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved