从人窦卵泡中提取、标记和纯化谱系特异性细胞

摘要

在这里，我们提出了从窦卵泡中鉴定和纯化卵巢细胞的方案。我们详细说明了处理整个卵巢以冷冻保存皮质条的方法，同时还收获完整的窦卵泡，这些卵泡经过酶处理以释放多种卵泡常驻细胞类型，包括颗粒细胞、膜细胞、内皮细胞、造血细胞和基质细胞。

摘要

卵母细胞的活化、生长、发育和成熟是一个复杂的过程，不仅在卵巢的多种细胞类型之间协调，而且在下丘脑/垂体/卵巢回路内的多个控制点之间协调。在卵巢内，多种特化的细胞类型与卵巢卵泡内的卵母细胞密切相关。这些细胞的生物学在后期阶段得到了很好的描述，当它们很容易作为辅助生殖治疗的副产品回收时。然而，由于人类卵巢组织的稀缺和接受辅助生殖治疗的患者对卵巢的访问有限，对直接从卵巢分离的小窦卵泡的深入分析并不常见。

这些用于处理整个卵巢以冷冻保存皮质条的方法，同时鉴定/分离卵巢驻留细胞，能够对窦卵泡发育的早期阶段进行高分辨率分析。我们展示了通过酶促处理窦卵泡并分离颗粒、膜细胞、内皮细胞、造血细胞和基质细胞来分离离散细胞类型的方案。从各种大小和发育阶段的窦卵泡中分离细胞，可以全面分析驱动卵泡生长和卵巢生理学的细胞和分子机制，并提供可以在 体外 培养的活细胞来源，以概括卵泡微环境。

引言

人类卵巢的主要功能元素是卵泡，卵泡控制着卵母细胞的生长和发育。在体外受精的背景下，已经建立了分离滤泡细胞的方案，但这些方案仅适用于在卵母细胞提取时从黄 体 化卵泡中收集细胞¹。我们开发了一种方案，可以在天然卵巢或异种移植卵巢组织产生的不同发育阶段从窦卵泡中分离离散细胞群²。尽管人们一致认为卵泡驻留细胞对卵母细胞培养的贡献非常重要，但很少有研究前瞻性地鉴定和提取窦期卵泡中存在的独特表型亚型。更深入地了解不同发育阶段特化细胞之间的分化层次结构和信号转导可以拓宽我们对稳态和病理条件下卵巢生理学的理解。此外，对离散细胞亚型的区分及其对卵泡生长/成熟的分子贡献可能提供一种产生离 体 替代物的方法，这些替代物重建卵巢功能以促进卵母细胞成熟和/或治疗内分泌功能障碍。

卵巢内的每种独特细胞类型都有助于卵泡的复杂功能，卵泡有效地充当离散的微型器官，以促进其所含卵母细胞的生长和成熟。卵母细胞是卵泡的核心，直接被连续的颗粒细胞（GC）层包裹，膜细胞（TC）形成第二层细胞，与卵母细胞和GC结合以构成卵泡单位。虽然分为两组，但GC和TC包含许多亚型。GC根据其在卵泡中的位置进行分类;围绕卵母细胞的GC和邻近基底膜的GC分别被指定为卵泡和壁壁GC，这些亚型显示出独特的转录组特征。TC 具有许多亚型，可提供类固醇生成、代谢和结构支持。内皮细胞、血管周围细胞和免疫细胞在维持正....

研究方案

所有涉及小鼠的程序均由威尔康奈尔医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。所有使用卵巢组织的异种移植实验均按照相关指南和规定进行。两个卵巢都是从一名14岁的脑死亡器官捐献者中分离出来的，该捐献者没有放疗/化疗史，也没有内分泌或生殖疾病记录。威尔康奈尔医学院的机构审查委员会（IRB）委员会批准了组织的采集，并在知情同意使用组织后获得了器官捐献者家属的批准。

1. 卵巢组织的采集和处理

1. 收集整个卵巢和相关组织，并在无菌盐水溶液中冲洗。
2. 使用无菌镊子，将卵巢放入无菌容器中。将无菌、缓冲、冷的溶液（例如，莱博维茨的 L-15 培养基）倒入容器中。确保组织完全被液体覆盖。
3. 关闭容器并使用无菌塑料袋将其装袋。将容器放在隔离箱内的冰上运输（例如，聚苯乙烯泡沫塑料）。将标本转移到实验室，该实验室将尽快处理卵巢，最好在不超过5小时^3，4的时间内。

2. 卵巢组织处理

注意：确保在组织到达实验室之前准备好所有试剂和工具，以尽可能减少缺血间隔。缓冲液可以在冷冻前1周制备，并在使用前冷藏。

1. 卵巢处理和冷冻的....

结果

我们从卵巢表面分离卵泡并对其进行酶处理，以分离GC以及窦腔周围的膜和基质细胞。收集细胞，并通过FACS将细胞组分从窦卵泡（直径范围在0.5mm至4mm之间）分选至>95%纯度（图1）。

为了标记和纯化人窦卵泡内独特的细胞组分，我们将酶消化与流式细胞术分选相结合。我们之前发现了特异性标记卵泡驻留部分的表面蛋白²。我们已经表明.......

讨论

由于几个原因，更好地解析卵巢卵泡内的细胞多样性在临床上很重要。在将上述方案应用于分离位于窦期卵泡内的独特表型亚型时，应考虑几个因素。首先，来源于窦卵泡的卵巢组织的健康和活力对于确定细胞的质量和下游应用的成功至关重要。这可以通过最小化缺血间隔、快速工作（最好成对）以及准备将用于组织处理和 FACS 的实验室空间来优化。其次，这些方案非常适合窦期卵泡，因为它们?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss