İnsan Antral Foliküllerinden Soya Özgü Hücrelerin Ekstraksiyonu, Etiketlenmesi ve Saflaştırılması

Özet

Burada, yumurtalık hücrelerinin antral foliküllerden tanımlanması ve saflaştırılması için protokoller sunuyoruz. Kortikal şeritlerin kriyoprezervasyonu için tüm yumurtalıkların işlenmesi için yöntemler üzerinde dururken, aynı zamanda granüloza, teka, endotelyal, hematopoetik ve stromal hücreler de dahil olmak üzere çoklu folikül yerleşik hücre tiplerini serbest bırakmak için enzimatik olarak muamele edilen bozulmamış antral folikülleri hasat ediyoruz.

Özet

Yumurtaların aktivasyonu, büyümesi, gelişmesi ve olgunlaşması, sadece yumurtalığın çoklu hücre tipleri arasında değil, aynı zamanda hipotalamik / hipofiz / yumurtalık devresindeki çoklu kontrol noktaları arasında koordine edilen karmaşık bir süreçtir. Yumurtalık içinde, yumurtalık folikülleri içindeki oosit ile yakın ilişki içinde çok sayıda özelleşmiş hücre tipi büyür. Bu hücrelerin biyolojisi, yardımcı üreme tedavilerinin yan ürünleri olarak kolayca geri kazanıldıkları sonraki aşamalarda iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, doğrudan yumurtalıktan izole edilen küçük antral foliküllerin derinlemesine analizi, insan yumurtalık dokusunun azlığı ve yardımcı üreme tedavisi gören hastalarda yumurtalıklara sınırlı erişim nedeniyle yaygın olarak yapılmamaktadır.

Kortikal şeritlerin kriyoprezervasyonu için tüm yumurtalıkların işlenmesi için kullanılan bu yöntemler, yumurtalık yerleşik hücrelerinin eşzamanlı tanımlanması / izolasyonu ile antral folikül gelişiminin erken aşamalarının yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. Antral folikülleri enzimatik olarak tedavi ederek ve granüloza, teka, endotelyal, hematopoetik ve stromal hücreleri ayırarak ayrık hücre tiplerini izole etmek için protokoller gösteriyoruz. Hücrelerin antral foliküllerden çeşitli boyutlarda ve gelişim aşamalarında izolasyonu, folikül büyümesini ve yumurtalık fizyolojisini yönlendiren hücresel ve moleküler mekanizmaların kapsamlı analizini sağlar ve folikül mikroortamını özetlemek için in vitro olarak kültürlenebilen canlı hücrelerin bir kaynağını sağlar.

Giriş

İnsan yumurtalıklarının birincil fonksiyonel elemanları, oositlerin büyümesini ve gelişimini yöneten foliküllerdir. Foliküler hücrelerin izolasyonu için protokoller in vitro fertilizasyon bağlamında iyi bir şekilde oluşturulmuştur, ancak bunlar sadece oosit elde etme noktasında luteinize foliküllerden hücrelerin toplanması için uygundur¹. Doğal yumurtalıklardan veya ksenotransplante edilmiş yumurtalık dokusundan kaynaklanan farklı gelişim aşamalarında ayrı hücre popülasyonlarının antral foliküllerden izole edilmesini sağlayan bir protokol geliştirdik². Folikül yerleşik hücrelerinin oosit yetiştiriciliğine katkılarının son derece önemli olduğu konusunda fikir birliği olmasına rağmen, az sayıda çalışma antral evre foliküllerinde bulunan benzersiz fenotipik alt tipleri prospektif olarak tanımlamış ve çıkarmıştır. Farklı gelişim aşamalarında uzmanlaşmış hücreler arasındaki farklılaşma hiyerarşisinin ve sinyal iletiminin daha derin bir şekilde anlaşılması, homeostatik ve patolojik koşullar altında yumurtalık fizyolojisi anlayışımızı genişletebilir. Ayrıca, ayrık hücresel alt tiplerin ayırt edilmesi ve folikül büyümesine / olgunlaşmasına moleküler katkıları, oosit olgunlaşmasını teşvik etmek ve / veya endokrin disfonksiyonu tedavi etmek için yumurtalık fonksiyonunu yeniden yapılandıran ex vivo vekiller üretmenin bir yolunu sağlayabilir.

Yumurtalık içindeki her benzersiz hücre tipi, içerdiği oositin büyümesini ve olgunlaşmasını teşvik etmek için ayrı bir mini organ olarak etkili bir şekilde işlev gören folikülün karmaşık işlevine katkıda bulunur. Folikülün merkezi olan oosit, doğrudan sürekli bir granüloza hücresi tabakası (GC'ler) ile sarılır, teka hücreleri (TC'ler), foliküler üniteyi oluşturmak için oosit ve GC'lerle birleşen ikincil bir hücre tabakası oluşturur. İki gruba ayrılmasına rağmen, GC'ler ve TC'ler çok sayıda alt tip içerir. GC'ler folikül içindeki konumlarına göre sınıflandırılır; Bazal membrana bitişik olanlara karşı oositi çevreleyen GC'ler sırasıyla ooforlu ve duvar GC'leri olarak tanımlanır ve bu alt tipler benzersiz transkriptomik imzalar gösterir. TC'lerin steroidojenik, metabolik ve yapısal destek sağlamak için işlev gören çok sayıda alt tipi vardır. Endotelyal, perivasküler ve immün hücreler normal over fizyolojisinin korunmasında merkezi bir rol oynar. Yumurtalık stroması sadece folikül büyümesi için bir substrat olarak hizmet etmekle kalmaz, aynı zamanda TC'lere yol açan bir progenitör kaynağı sağlar. Yumurtalık içindeki bu çok katmanlı hücresel alt tip kompleksi, hem endokrin hem de üreme organı olarak işlev görmesini sağlayan şeydir.

Bu yazıda antral foliküllerden granüloza, teka, stromal, endotel ve hematopoetik hücrelerin tanımlanması ve saflaştırılması için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolü, bu yumurtalık hücrelerini izole etmek ve bunları tek hücreli dizileme kullanarak analiz etmek, ardından farklı gelişim aşamalarındaki foliküllerde spesifik boyama yapmak için kullandık. Protokol, tekrarlanabilir ve yumurtalık fizyolojisinin ve patolojisinin yüksek çözünürlüklü analizini sağlayacak basit bir metodoloji sağlar.

Protokol

Fareleri içeren tüm prosedürler, Weill Cornell Medicine'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık dokusu kullanılarak yapılan tüm ksenotransplantasyon deneyleri, ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi. Her iki yumurtalık da radyo/kemoterapi öyküsü olmayan ve belgelenmiş endokrin veya üreme koşulları öyküsü olmayan 14 yaşındaki beyin ölümü gerçekleşmiş organ bağışçısından izole edildi. Weill Cornell Medicine'in kurumsal inceleme kurulu (IRB) Komitesi, doku toplanmasını onayladı ve doku kullanımıyla ilgili bilgilendirilmiş onamın ardından organ bağışçısının ailesinden onay alındı.

1. Yumurtalık dokusunun toplanması ve taşınması

1. Tüm yumurtalıkları ve ilgili dokuyu toplayın ve steril tuzlu su çözeltisinde durulayın.
2. Steril cımbız kullanarak yumurtalıkları steril bir kaba koyun. Steril, tamponlanmış, soğuk çözeltiyi (örneğin, Leibovitz'in L-15 ortamı) kabın içine dökün. Dokunun tamamen sıvı ile kaplandığından emin olun.
3. Kabı kapatın ve steril plastik torbalar kullanarak iki kez torbalayın. Kabı buz üzerinde izole edilmiş bir kutu içinde taşıyın (örneğin, Strafor). Örnekleri, yumurtalıkları mümkün olan en kısa sürede, tercihen 5 saat ^3,4'ü geçmeyen bir sürede işleyecek laboratuvara aktarın.

2. Yumurtalık dokusunun işlenmesi

NOT: İskemik aralığı mümkün olduğunca azaltmak için doku laboratuvara gelmeden önce tüm reaktiflerin ve aletlerin hazırlandığından emin olun. Tamponlar donmadan 1 hafta öncesine kadar hazırlanabilir ve kullanıma kadar soğutulabilir.

1. Yumurtalık işleme ve dondurma için preparatlar
   1. Doku işlemeye hazırlık için biyogüvenlik kabinine sterilize edilmiş cerrahi aletler yerleştirin: bir numara 21 neşter; bir numara 11 neşter; keskin ince kavisli makas; bir uzun forseps (~ 150 mm uzunluğunda); ve iki orta forseps (~ 110 mm uzunluğunda).
   2. 100 mL doku işleme ortamı hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız): Leibovitz'in antibiyotik-antimikotik çözelti içeren ve 0.2 μm filtre kullanılarak filtrelenen L-15 ortamı. Ortamı soğutulmuş halde tutun.
   3. Kriyovyalleri etiketleyin, her şişeye 1,5 mL dondurma çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 ° C'de saklayın.
   4. Kullanım için elinizde 6 delikli bir plaka bulundurun.
2. Dokunun varışında
   1. Kabı %70 etanol çözeltisi ile püskürtün, iyice silin ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
   2. Steril eldiven giyerek kabı açın. Yumurtalıkları steril bir Petri kabına yerleştirin ve dokuyu nemlendirmek için soğutulmuş ortamı (adım 2.1.2'den itibaren) dökün. Yumurtalığın ortama yarı batırılmış olduğundan emin olun.
   3. Herhangi bir dikişi veya başka bir materyali çıkarın ve kalan çevre dokuyu yumurtalıktan uzaklaştırın.

3. Antral foliküllerin izolasyonu

1. İzolasyon için bireysel folikülleri tanımlayın. Sağlıklı folikülleri seçerken, kan dolu, koyu veya simetrik olmayan folikülleri hariç tutun, çünkü bunların atretik olması muhtemeldir.
2. Seçilen antral folikülleri neşter kullanarak tüm yumurtalıktan izole edin, folikülü çevreleyen kortikal dokuyu eksize ederek antrumu sağlam tutun.
3. Eksize edilmiş her sağlam antral folikülü 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Tanımlayıcı amaçlar için gerekirse, folikül çapını belirlemek için çanağın altına yerleştirilmiş bir cetvel kullanın.
4. Bir neşter kullanarak, antral boşluğa erişmek için bozulmamış antral folikülü ikiye bölün ve 4 mL enzimatik hücre ayrılma ortamı ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
5. Gerektiğinde ek antral foliküllerin ekstraksiyonunu tekrarlayın.

4. Folikül yerleşik hücrelerinin izolasyonu

1. İnkübasyonu takiben,% 20 FBS içeren 4 mL kullanılabilir ortam ekleyin ve ortamın tekrarlanan, kuvvetli pipetlenmesiyle iki parçalı foliküller üzerinde bir P1.000 mikropipet ile yıkayın.
2. Ortamı toplayın ve 100 μm'lik bir filtreden geçirin.
3. Filtrelenmiş süpernatantı 300 × g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini (GC'lerle zenginleştirilmiş) etiketleme ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) için buz üzerinde ayırın.
4. Kalan dokuyu dengeli bir tuzlu su çözeltisi (örneğin, Hanks) içinde seyreltilmiş bir kollajenaz (100 U / mL) ve dispaz (1 U / mL) karışımına yerleştirin ve% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 10 dakika ve 20 dakika sonra iki kez tritürasyon ve kuvvetli pipetleme (yani, pipet ucundan 10-15 geçiş) ile dokuyu mekanik olarak bozar.
5. Dokuyu içeren ortamları geri kazanın, P1.000 mikropipet ucundan pipetle yıkayın ve 100 μm filtreden geçirin.
6. 3 dakika boyunca 300 × g ve 4 ° C'de santrifüj. Süpernatanı aspire edin ve etiketleme ve FACS için buz üzerindeki hücre peletini (TC'ler ve stroma hücreleri ile zenginleştirilmiş) bir kenara koyun.

5. Floresan ile aktive hücre sıralama

1. Hücre peletlerini bloke edici çözelti içinde (PBS +% 0.1 FBS) tekrar askıya alın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
2. 300 × g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin.
3. Hücre peletlerini doğrudan konjuge antikorlar içeren bloke edici çözeltide yeniden askıya alın (GC'leri ve TC'leri tanımlamak için uygun antikor kombinasyonları için Tablo 1'e bakınız) ve buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.
4. Hücreleri 300 × g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj edin. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve gating için florofor konjuge antikorların floresan yoğunluğunu kullanarak hücrelerin küçük bir popülasyonunu (500-1.000) yakalamak için hücre süspansiyonunu bir FACS cihazından geçirin.
5. Benzersiz alt popülasyonların tanımlanması için, aşağıdaki geçit stratejilerini kullanın:
   1. GC'lerin saflaştırılması için, CD45+ hücrelerinin etrafına bir kapı çizin (Şekil 1B) ve bu popülasyonu CD99⁺ popülasyonundan hariç tutun (Şekil 1A ve Şekil 1C); daha sonra, kalan CD99+ fraksiyonunu PVRL^+/- fraksiyonlarına bölün (Şekil 1A ve Şekil 1C).
   2. TC'lerin ve stromanın saflaştırılması için, CD34 + endotel fraksiyonunu (Şekil 1E) dışlamak ve steroidojenik (ANPEP +) ve steroidojenik olmayan (ANPEP^-) hücreleri ayırt etmek için toplam ENG + (Şekil 1A) veya CD55 ⁺ (Şekil 1D) popülasyonunu açın. Emisyon spektrumlarında yakın olan floroforlar arasındaki kanamayı telafi etmeye dikkat edin.
6. Sıralanmış hücre fraksiyonunun saflığını doğrulamak için, yakalanan toplam hacmin %5'ini FACS cihazı aracılığıyla çalıştırın ve hücrelerin beklenen kapıları doldurduğundan ve %>95 saflıkta bulunduğundan emin olun.

6. Yumurtalık kortikal dokusunun işlenmesi

1. Yumurtalığın geri kalanını ikiye bölün ve yumurtalık korteksine zarar vermemek için dikkatli olarak kavisli ince makas ve neşterler kullanarak medullayı eksize edin.
2. Minimal medulla kalana kadar yumurtalık korteksi hafifçe kazıyarak işlemeye ve inceltmeye devam edin. Gereken minimum kuvveti kullandığınızdan emin olun.
   NOT: Kortikal doku kalınlığı 1 mm ile 1,5 mm arasında olmalıdır.
3. Kortikal dokuyu yumurtalık uzunluğu boyunca 2-3 mm genişliğinde şeritlere bölün.

7. Yumurtalık dokusu yavaş donma

1. Donma için hazırlık
   1. Dondurma çözeltisi içeren her soğutulmuş kriyojenik şişeye bir kortikal şerit yerleştirin.
   2. Kortikal şeritleri içeren kriyojenik şişeleri dönen bir plaka üzerinde 4 ° C'de 20 dakika çalkalayın.
2. Yumurtalık dokusunun yavaş donması⁵
   1. Yumurtalık dokusu içeren kriyovyalleri 0 °C'de başlayacak şekilde programlanabilir bir dondurucuya yerleştirin.
   2. −7 °C'ye kadar 2 °C/dak hızında soğutun.
   3. Kriyovialları bu sıcaklıkta 10 dakika boyunca tutun.
   4. Her kriyoviyal sıvı azota (LN₂) kısa bir süre batırılmış bir pamuk ucu ile dokunarak buz kristali oluşumunu nüklee edin.
   5. Numune sıcaklığı −40°C'ye ulaşana kadar 0,3 °C/dak hızında soğutun.
   6. Numune sıcaklığı −140 °C'ye ulaşana kadar soğutma hızını 10 °C/dk'ya yükseltin.
   7. Kriyovyalleri LN_2'de depolamak için aktarın.

Sonuçlar

Folikülleri yumurtalık yüzeyinden izole ettik ve GC'lerin yanı sıra antral boşluğu çevreleyen theca ve stroma hücrelerini izole etmek için enzimatik olarak tedavi ettik. Hücreler toplandı ve hücre fraksiyonları antral foliküllerden (0.5 mm ile 4 mm arasında değişen çaplar) FACS tarafından% >95 saflığa kadar sıralandı (Şekil 1).

İnsan antral foliküllerindeki benzersiz hücresel fraksiyonları etiketlemek ve saflaştırmak için, enzimatik...

Tartışmalar

Yumurtalık foliküllerindeki hücresel çeşitliliğin daha iyi çözülmesi çeşitli nedenlerden dolayı klinik olarak önemlidir. Yukarıdaki protokolün antral evre foliküllerinde bulunan benzersiz fenotipik alt tiplerin izolasyonuna uygulanmasında, çeşitli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, antral folikülün türetildiği yumurtalık dokusunun sağlığı ve canlılığı, hücrelerin kalitesini ve aşağı akış uygulamalarının başarısını belirlemede kritik öneme sahiptir. Bu, ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss