Extraction, marquage et purification de cellules spécifiques à la lignée à partir de follicules antraux humains

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour l’identification et la purification des cellules ovariennes des follicules antraux. Nous développons des méthodes de traitement des ovaires entiers pour la cryoconservation des bandes corticales tout en récoltant des follicules antraux intacts qui sont traités enzymatiquement pour libérer plusieurs types de cellules résidentes du follicule, y compris la granulosa, la thèque, les cellules endothéliales, hématopoïétiques et stromales.

Résumé

L’activation, la croissance, le développement et la maturation des ovocytes est un processus complexe qui est coordonné non seulement entre plusieurs types de cellules de l’ovaire, mais aussi à travers plusieurs points de contrôle dans le circuit hypothalamique / hypophysaire / ovarien. Dans l’ovaire, plusieurs types de cellules spécialisées se développent en étroite association avec l’ovocyte dans les follicules ovariens. La biologie de ces cellules a été bien décrite aux stades ultérieurs, lorsqu’elles sont facilement récupérées en tant que sous-produits des traitements de procréation assistée. Cependant, l’analyse approfondie des petits follicules antraux isolés directement de l’ovaire n’est pas couramment effectuée en raison de la rareté du tissu ovarien humain et de l’accès limité à l’ovaire chez les patientes subissant des traitements de procréation assistée.

Ces méthodes de traitement des ovaires entiers pour la cryoconservation de bandelettes corticales avec l’identification/isolement simultané de cellules ovariennes résidentes permettent l’analyse à haute résolution des premiers stades du développement du follicule antral. Nous démontrons des protocoles pour isoler des types de cellules discrètes en traitant les follicules antraux par voie enzymatique et en séparant les cellules granulosa, thèques, endothéliales, hématopoïétiques et stromales. L’isolement des cellules des follicules antraux à différentes tailles et stades de développement permet l’analyse complète des mécanismes cellulaires et moléculaires qui entraînent la croissance des follicules et la physiologie ovarienne et fournit une source de cellules viables qui peuvent être cultivées in vitro pour récapituler le microenvironnement du follicule.

Introduction

Les principaux éléments fonctionnels de l’ovaire humain sont les follicules, qui régissent la croissance et le développement des ovocytes. Les protocoles d’isolement des cellules folliculaires ont été bien établis dans le contexte de la fécondation in vitro , mais ils ne sont appropriés que pour le prélèvement de cellules à partir de follicules lutéinisés au point de prélèvement ovocytaire¹. Nous avons développé un protocole qui permet d’isoler des populations cellulaires discrètes à partir de follicules antraux à différents stades de développement provenant d’ovaires natifs ou de tissu ovarien xénotransplanté². Bien qu’il existe un consensus sur le fait que les contributions des cellules résidentes du follicule à la culture de l’ovocyte sont très importantes, peu d’études ont identifié et extrait de manière prospective les sous-types phénotypiques uniques présents dans les follicules au stade antral. Une meilleure compréhension de la hiérarchie de différenciation et de la transduction du signal entre les cellules spécialisées au cours des différents stades de développement pourrait élargir notre compréhension de la physiologie ovarienne dans des conditions homéostatiques et pathologiques. De plus, la discrimination des sous-types cellulaires discrets et leurs contributions moléculaires à la croissance / maturation des follicules peuvent fournir un moyen de générer des substituts ex vivo qui reconstruisent la fonction ovarienne pour favoriser la maturation ovocytaire et / ou traiter le dysfonctionnement endocrinien.

Chaque type de cellule unique dans l’ovaire contribue à la fonction complexe du follicule, qui fonctionne efficacement comme un mini-organe discret pour favoriser la croissance et la maturation de l’ovocyte qu’il contient. L’ovocyte, la pièce maîtresse du follicule, est directement enveloppé par une couche continue de cellules de la granulosa (GC), les cellules thèques (TC) formant une couche secondaire de cellules qui se combinent avec l’ovocyte et les GC pour composer l’unité folliculaire. Bien que classés en deux groupes, les CG et les CT contiennent de nombreux sous-types. Les GC sont classés en fonction de leur position dans le follicule; Les GC qui entourent l’ovocyte par rapport à celles qui sont adjacentes à la membrane basale sont désignées comme des GC oophores et murales, respectivement, et ces sous-types présentent des signatures transcriptomiques uniques. Les CT ont de nombreux sous-types qui fonctionnent pour fournir un soutien stéroïdogène, métabolique et structurel. Les cellules endothéliales, périvasculaires et immunitaires jouent un rôle central dans le maintien d’une physiologie ovarienne normale. Le stroma ovarien sert non seulement de substrat pour la croissance des follicules, mais fournit également probablement une source de progéniteurs qui donnent lieu à des TC. Ce complexe multicouche de sous-types cellulaires dans l’ovaire est ce qui lui permet de fonctionner à la fois comme organe endocrinien et reproducteur.

Cet article présente un protocole pour l’identification et la purification des cellules granulosa, thèques, stromales, endothéliales et hématopoïétiques des follicules antraux. Nous avons utilisé ce protocole pour isoler ces cellules ovariennes et les analyser en utilisant le séquençage unicellulaire, suivi d’une coloration spécifique dans les follicules de différents stades de développement. Le protocole fournit une méthodologie simple qui est reproductible et permettra l’analyse à haute résolution de la physiologie et de la pathologie de l’ovaire.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Weill Cornell Medicine. Toutes les expériences de xénotransplantation utilisant du tissu ovarien ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Les deux ovaires ont été isolés à partir d’un donneur d’organes en état de mort cérébrale âgé de 14 ans sans antécédents de radiothérapie ou de chimiothérapie et sans antécédents documentés de troubles endocriniens ou reproductifs. Le comité du comité d’examen institutionnel (CISR) de Weill Cornell Medicine a approuvé le prélèvement de tissus, et l’approbation de la famille du donneur d’organes a été obtenue à la suite d’un consentement éclairé concernant l’utilisation de tissus.

1. Prélèvement et manipulation de tissus ovariens

1. Prélever les ovaires entiers et les tissus associés, et rincer dans une solution saline stérile.
2. À l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les ovaires dans un récipient stérile. Versez une solution froide stérile tamponnée (p. ex. milieu L-15 de Leibovitz) dans le contenant. Assurez-vous que le tissu est complètement recouvert du liquide.
3. Fermez le contenant et doublez-le à l’aide de sacs en plastique stériles. Transporter le contenant sur de la glace dans une boîte isolée (p. ex., polystyrène). Transférer les échantillons au laboratoire qui traitera les ovaires dès que possible, de préférence dans un délai n’excédant pas 5 h ^3,4.

2. Traitement du tissu ovarien

REMARQUE: Assurez-vous que tous les réactifs et outils sont préparés avant l’arrivée du tissu dans le laboratoire afin de réduire autant que possible l’intervalle ischémique. Les tampons peuvent être préparés jusqu’à 1 semaine avant la congélation et réfrigérés jusqu’à utilisation.

1. Préparations pour le traitement ovarien et la congélation
   1. Placez les outils chirurgicaux stérilisés dans l’armoire de biosécurité en préparation au traitement des tissus: un scalpel numéro 21; un scalpel numéro 11; ciseaux fins et tranchants incurvés; une pince longue (~150 mm de longueur); et deux pinces moyennes (~110 mm de longueur).
   2. Préparer 100 mL de milieu de traitement tissulaire (voir le tableau des matières) : milieu L-15 de Leibovitz contenant une solution antibiotique-antimycotique et filtré à l’aide d’un filtre de 0,2 μm. Gardez le milieu au frais.
   3. Étiqueter les cryovials, ajouter 1,5 mL de solution de congélation (voir le tableau des matières) à chaque flacon et le conserver à 4 °C.
   4. Ayez à portée de main une plaque de 6 puits.
2. À l’arrivée du tissu
   1. Vaporisez le récipient avec une solution d’éthanol à 70%, essuyez soigneusement et placez-le dans l’enceinte de biosécurité.
   2. En portant des gants stériles, ouvrez le récipient. Placez l’ovaire dans une boîte de Petri stérile et versez le milieu refroidi (à partir de l’étape 2.1.2) pour hydrater le tissu. Assurez-vous que l’ovaire est à moitié immergé dans le milieu.
   3. Retirez les sutures ou tout autre matériau et disséquez les tissus environnants résiduels loin de l’ovaire.

3. Isolement des follicules antraux

1. Identifier les follicules individuels pour l’isolement. En choisissant des follicules sains, excluez tous les follicules remplis de sang, sombres ou non symétriques, car ceux-ci sont susceptibles d’être atrétiques.
2. Isolez les follicules antraux choisis de l’ovaire entier à l’aide de scalpels, en gardant l’antre intact en excisant le tissu cortical englobant le follicule.
3. Placer chaque follicule antral intact excisé dans un puits de la plaque à 6 puits. Si nécessaire à des fins descriptives, utilisez une règle placée sous le plat pour déterminer le diamètre du follicule.
4. À l’aide d’un scalpel, couper en deux le follicule antral intact pour accéder à la cavité antrale et ajouter 4 mL de milieu de détachement cellulaire enzymatique. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ et 37 °C pendant 10 min.
5. Répétez l’extraction de follicules antraux supplémentaires au besoin.

4. Isolement des cellules résidentes du follicule

1. Après l’incubation, ajouter 4 mL de milieu disponible contenant 20 % de FBS et rincer le milieu à l’aide d’une micropipette P1 000 répétée et vigoureuse sur les follicules coupés en deux.
2. Recueillir le milieu et le faire passer à travers un filtre de 100 μm.
3. Centrifuger le surnageant filtré à 300 × g et 4 °C pendant 3 min. Aspirer le surnageant et réserver la pastille de cellule (enrichie en GC) sur de la glace pour le marquage et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
4. Placer le reste du tissu dans un mélange de collagénase (100 U/mL) et de dispase (1 U/mL) dilué dans une solution saline équilibrée (p. ex. Hanks) et incuber pendant 30 min à 5 % de CO₂ et 37 °C, en perturbant mécaniquement le tissu par trituration et pipetage vigoureux (c.-à-d. 10-15 passe à travers l’embout de la pipette) deux fois après 10 minutes et 20 minutes.
5. Récupérer le milieu contenant le tissu, rincer par pipetage à travers une pointe de micropipette P1,000 et filtrer à travers un filtre de 100 μm.
6. Centrifuger à 300 × g et 4 °C pendant 3 min. Aspirer le surnageant et mettre de côté la pastille cellulaire (enrichie en TC et cellules stroma) sur glace pour le marquage et le FACS.

5. Tri cellulaire activé par fluorescence

1. Resuspendre les pastilles cellulaires dans une solution de blocage (PBS + 0,1% FBS), et incuber pendant 10 min à 4 °C.
2. Centrifuger à 300 × g et 4 °C pendant 3 min, et aspirer le surnageant.
3. Resuspendre les pastilles cellulaires dans une solution de blocage contenant des anticorps directement conjugués (voir le tableau 1 pour les combinaisons d’anticorps appropriées pour identifier les GC et les CT) et incuber sur de la glace pendant 10 min.
4. Laver et centrifuger les cellules à 300 × g et 4 °C pendant 3 min. Resuspendre les cellules dans un tampon FACS contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et faire passer la suspension cellulaire à travers un instrument FACS pour capturer une petite population de cellules (500-1 000) en utilisant l’intensité de fluorescence des anticorps conjugués fluorophore pour le gating.
5. Pour identifier des sous-populations uniques, utilisez les stratégies de contrôle suivantes :
   1. Pour la purification des GC, dessiner une porte autour des cellules CD45+ (Figure 1B) et exclure cette population de la population CD99⁺ (Figure 1A et Figure 1C); ensuite, subdiviser davantage la fraction CD99+ restante en fractions PVRL^+/- (Figure 1A et Figure 1C).
   2. Pour la purification des CT et du stroma, porter la population totale d’ENG+ (Figure 1A) ou de CD55+ (Figure 1D) pour exclure la fraction endothéliale CD34+ (Figure 1E) et distinguer les cellules stéroïdogènes (^ANPEP+) et non stéroïdogènes (ANPEP^-). Veillez à compenser les saignements entre les fluorophores qui sont proches dans les spectres d’émission.
6. Pour valider la pureté de la fraction cellulaire triée, exécutez 5% du volume total capturé à travers l’instrument FACS et assurez-vous que les cellules remplissent les portes attendues et sont présentes à > 95% de pureté.

6. Traitement du tissu cortical ovarien

1. Couper en deux le reste de l’ovaire et exciser la moelle à l’aide de ciseaux fins et de scalpels incurvés, en prenant soin d’éviter d’endommager le cortex ovarien.
2. Continuez à traiter et à amincir le cortex ovarien en grattant doucement jusqu’à ce qu’il reste un minimum de moelle. Assurez-vous d’utiliser le minimum de force nécessaire.
   REMARQUE: L’épaisseur du tissu cortical doit être comprise entre 1 mm et 1,5 mm.
3. Divisez le tissu cortical en bandes de 2-3 mm de large le long de l’ovaire.

7. Congélation lente du tissu ovarien

1. Préparation à la congélation
   1. Placez une bandelette corticale dans chaque flacon cryogénique réfrigéré contenant une solution de congélation.
   2. Agiter les flacons cryogéniques contenant les bandes corticales sur une plaque rotative pendant 20 min à 4 °C.
2. Congélation lente du tissu ovarien⁵
   1. Placer les cryoflacons contenant du tissu ovarien dans un congélateur programmable réglé à 0 °C.
   2. Refroidir à une vitesse de 2 °C/min jusqu’à −7 °C.
   3. Maintenez les cryoflacons à cette température pendant 10 min.
   4. Nucléer la formation de cristaux de glace en touchant chaque cryovial avec une pointe en coton qui a été brièvement immergée dans de l’azote liquide (LN₂).
   5. Refroidir à une vitesse de 0,3 °C/min jusqu’à ce que la température de l’échantillon atteigne −40 °C.
   6. Augmenter la vitesse de refroidissement à 10 °C/min jusqu’à ce que la température de l’échantillon atteigne −140 °C.
   7. Transférer les cryoflacons pour les stocker dans LN₂.

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Résultats

Nous avons isolé les follicules de la surface de l’ovaire et les avons traités enzymatiquement pour isoler les GC ainsi que les cellules thèques et stroma entourant la cavité antrale. Les cellules ont été collectées et les fractions cellulaires ont été triées des follicules antraux (diamètres compris entre 0,5 mm et 4 mm) par FACS à >95% de pureté (Figure 1).

Pour marquer et purifier des fractions cellulaires uniques dans les follicules antraux huma...

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Discussion

Une meilleure résolution de la diversité cellulaire dans les follicules ovariens est cliniquement importante pour plusieurs raisons. Lors de l’application du protocole ci-dessus à l’isolement des sous-types phénotypiques uniques qui résident dans les follicules de stade antral, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Premièrement, la santé et la viabilité du tissu ovarien à partir duquel le follicule antral est dérivé sont essentielles pour déterminer la qualité des cellules et le succès des ap...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss