חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לזיהוי וטיהור תאי שחלה מזקיקים אנטראליים. אנו מרחיבים שיטות לעיבוד שחלות שלמות לשימור בהקפאה של רצועות קליפת המוח תוך קצירת זקיקים אנטראליים שלמים המטופלים באופן אנזימטי כדי לשחרר סוגים רבים של תאים שוכנים זקיקים, כולל גרנולוסה, תיקה, אנדותל, המטופויטים ותאי סטרומה.

Abstract

ההפעלה, הצמיחה, ההתפתחות וההבשלה של הביציות הוא תהליך מורכב המתואם לא רק בין סוגי תאים מרובים של השחלה, אלא גם על פני נקודות בקרה מרובות בתוך מעגל ההיפותלמוס/יותרת המוח/השחלות. בתוך השחלה, מספר סוגי תאים מיוחדים גדלים בקשר הדוק עם הביצית בתוך זקיקי השחלות. הביולוגיה של תאים אלה תוארה היטב בשלבים מאוחרים יותר, כאשר הם מתאוששים בקלות כתוצרי לוואי של טיפולי פוריות בסיוע. עם זאת, ניתוח מעמיק של זקיקים אנטראליים קטנים שבודדו ישירות מהשחלה אינו מתבצע בדרך כלל בשל המחסור ברקמת שחלה אנושית והגישה המוגבלת לשחלה בחולות העוברות טיפולי פוריות בסיוע.

שיטות אלה לעיבוד שחלות שלמות להקפאה של רצועות קליפת המוח עם זיהוי/בידוד מקביל של תאים שוכנים בשחלות מאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של השלבים המוקדמים של התפתחות זקיק אנטראלי. אנו מדגימים פרוטוקולים לבידוד סוגי תאים בדידים על ידי טיפול בזקיקים אנטראליים באופן אנזימטי והפרדת תאי גרנולוסה, תקה, אנדותל, המטופויטים וסטרומה. בידוד התאים מהזקיקים האנטרליים בגדלים שונים ובשלבי התפתחות שונים מאפשר ניתוח מקיף של המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים את צמיחת הזקיקים ואת הפיזיולוגיה השחלתית ומספק מקור לתאים בני קיימא שניתן לגדל בתרבית במבחנה כדי לשחזר את מיקרו-סביבת הזקיק.

Introduction

המרכיבים הפונקציונליים העיקריים של השחלה האנושית הם הזקיקים, השולטים בצמיחה ופיתוח של ביציות. פרוטוקולים לבידוד תאים פוליקולריים נקבעו היטב בהקשר של הפריה חוץ גופית , אך אלה מתאימים רק לאיסוף תאים מזקיקים לוטאין בנקודת שאיבת הביציות¹. פיתחנו פרוטוקול המאפשר בידוד אוכלוסיות תאים בדידות מזקיקים אנטראליים בשלבי התפתחות שונים הנובעים משחלות טבעיות או מרקמת שחלה מושתלת². למרות שקיים קונצנזוס כי תרומתם של תאים שושבי זקיקים לטיפוח הביצית חשובה ביותר, מחקרים מעטים זיהו וחילצו באופן פרוספקטיבי את תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים הקיימים בזקיקים בשלב האנטראלי. הבנה מעמיקה יותר של היררכיית ההתמיינות והעברת האותות בין תאים מתמחים בשלבי ההתפתחות השונים עשויה להרחיב את הבנתנו את הפיזיולוגיה של השחלות בתנאים הומיאוסטטיים ופתולוגיים. יתר על כן, ההבחנה בין תת-סוגים תאיים בדידים ותרומתם המולקולרית לגדילה/הבשלה של זקיקים עשויה לספק אמצעי ליצירת פונדקאיות ex vivo המשחזרות את תפקוד השחלות כדי לעודד הבשלת ביציות ו / או לטפל בתפקוד אנדוקריני.

כל סוג תא ייחודי בתוך השחלה תורם לתפקוד המורכב של הזקיק, המתפקד למעשה כמיני-איבר נפרד לטיפוח הצמיחה וההבשלה של הביצית שהוא מכיל. הביצית, החלק המרכזי של הזקיק, עטופה ישירות בשכבה רציפה של תאי גרנולוזה (GCs), כאשר תאי התקה (TC) יוצרים שכבה משנית של תאים המשתלבים עם הביצית וה-GCs כדי להרכיב את היחידה הפוליקולרית. למרות שהם מסווגים לשתי קבוצות, GCs ו- TCs מכילים תת-סוגים רבים. GCs מסווגים לפי מיקומם בתוך הזקיק; GCs המקיפים את הביצית לעומת אלה הסמוכים לקרום המרתף מוגדרים כ- GCs oophorous ו- mural בהתאמה, ותתי סוגים אלה מציגים חתימות שעתוק ייחודיות. ל-TCs יש תת-סוגים רבים שתפקידם לספק תמיכה סטרואידוגנית, מטבולית ומבנית. תאי אנדותל, כלי דם ומערכת החיסון ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של השחלות. סטרומה השחלתית משמשת לא רק כמצע לצמיחת זקיקים, אלא גם ככל הנראה מספקת מקור לאבות המולידים TC. קומפלקס רב-שכבתי זה של תת-סוגים תאיים בתוך השחלה הוא המאפשר את תפקודה הן כאיבר אנדוקריני והן כאיבר רבייה.

מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי וטיהור של גרנולוסה, תיקה, סטרומה, אנדותל ותאים המטופויטיים מזקיקים אנטראליים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד את תאי השחלות הללו ולנתח אותם באמצעות ריצוף של תא בודד, ולאחר מכן צביעה ספציפית בזקיקים בשלבי התפתחות שונים. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה פשוטה הניתנת לשכפול ותאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה הן של הפיזיולוגיה והן של הפתולוגיה של השחלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים המערבים עכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית החולים וייל קורנל. כל ניסויי השתלת הקסנו באמצעות רקמת שחלה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. שתי השחלות בודדו מתורם איברים בן 14 שמת מוות מוחי, ללא היסטוריה של רדיו/כימותרפיה וללא היסטוריה מתועדת של בעיות אנדוקריניות או פוריות. ועדת ועדת הביקורת המוסדית (IRB) של Weill Cornell Medicine אישרה את איסוף הרקמות, ואישור ממשפחת תורם האיברים התקבל לאחר הסכמה מדעת לגבי השימוש ברקמות.

1. איסוף רקמות שחלות וטיפול בהן

1. לאסוף את כל השחלות ואת הרקמה הקשורה, ולשטוף בתמיסת מלח סטרילית.
2. בעזרת פינצטה סטרילית, מניחים את השחלות במיכל סטרילי. יוצקים תמיסה סטרילית, חוצצת וקרה (למשל, מדיום L-15 של לייבוביץ') לתוך המיכל. ודא כי הרקמה מכוסה לחלוטין עם הנוזל.
3. סוגרים את המיכל ומכניסים אותו לשקית כפולה באמצעות שקיות ניילון סטריליות. העבירו את המיכל על קרח בתוך קופסה מבודדת (למשל, קלקר). להעביר את הדגימות למעבדה שתעבד את השחלות בהקדם האפשרי, רצוי בזמן שלא יעלה על 5 שעות ^3,4.

2. עיבוד רקמת השחלה

הערה: ודא שכל הריאגנטים והכלים מוכנים לפני שהרקמה מגיעה למעבדה כדי להפחית את המרווח האיסכמי ככל האפשר. ניתן להכין את המאגרים עד שבוע לפני ההקפאה ולשמור בקירור עד לשימוש.

1. הכנות לעיבוד השחלות והקפאה
   1. הגדר כלים כירורגיים מעוקרים בארון הבטיחות הביולוגית כהכנה לעיבוד רקמות: אזמל מספר 21; אזמל מספר 11; מספריים מעוקלים עדינים וחדים; מלקחיים ארוכים (~ 150 מ"מ אורך); ושני מלקחיים בינוניים (~ 110 מ"מ אורך).
   2. הכינו 100 מ"ל של מדיום עיבוד רקמות (ראו טבלת חומרים): מדיום L-15 של לייבוביץ המכיל תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית ומסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. שמור את המדיום מקורר.
   3. תייגו את ההקפאה, הוסיפו 1.5 מ"ל של תמיסת הקפאה (ראו טבלת חומרים) לכל בקבוקון, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
   4. יש זמין צלחת 6 בארות בהישג יד לשימוש.
2. עם הגעת הרקמה
   1. רססו את המיכל בתמיסת אתנול 70%, נגבו היטב והכניסו אותו לארון הבטיחות הביולוגית.
   2. לובשים כפפות סטריליות, פותחים את המיכל. מניחים את השחלה בצלחת פטרי סטרילית, ויוצקים מדיום צונן (משלב 2.1.2) כדי ללחלח את הרקמה. ודא כי השחלה שקועה למחצה בתווך.
   3. הסר את התפרים או חומר אחר ונתח את שאריות הרקמה שמסביב הרחק מהשחלה.

3. בידוד זקיקים אנטראליים

1. זהה זקיקים בודדים לבידוד. בבחירת זקיקים בריאים, אל תכלול זקיקים מלאים בדם, כהים או לא סימטריים, שכן אלה עשויים להיות אטרטיים.
2. בודד את הזקיקים האנטראליים שנבחרו מהשחלה כולה באמצעות אזמלים, תוך שמירה על האנטרום שלם על ידי כריתת רקמת קליפת המוח המקיפה את הזקיק.
3. מניחים כל זקיק אנטראלי שלם שנכרת בבאר אחת של צלחת 6 הקידוחים. במידת הצורך למטרות תיאוריות, השתמש בסרגל הממוקם מתחת לצלחת כדי לקבוע את קוטר הזקיק.
4. באמצעות אזמל, לחתוך את זקיק antral שלם כדי לקבל גישה לחלל antral, ולהוסיף 4 מ"ל של תווך ניתוק תאים אנזימטי. דגרו על הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 5%_CO2 ו-37°C למשך 10 דקות.
5. חזור על מיצוי זקיקים אנטראליים נוספים לפי הצורך.

4. בידוד תאים שושבי זקיק

1. לאחר הדגירה, יש להוסיף 4 מ"ל של תווך זמין המכיל 20% FBS, ולשטוף על ידי פיפטציה חוזרת ונמרצת של התווך מעל הזקיקים המפוצלים עם מיקרופיפטה P1,000.
2. אספו את המדיום, והעבירו אותו דרך מסנן של 100 מיקרומטר.
3. צנטריפוגה את supernatant מסונן ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט, ושמרו את גלולת התא (מועשרת ב-GCs) על קרח לצורך תיוג ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
4. מניחים את הרקמה הנותרת בתערובת של collagenase (100 U / mL) ו dispase (1 U / mL) מדולל בתמיסת מלח מאוזנת (למשל, Hanks), ולדגור במשך 30 דקות ב 5% CO₂ ו 37 ° C, משבש מכנית את הרקמה על ידי trituration ו pipetting נמרץ (כלומר, 10-15 עובר דרך קצה הפיפט) פעמיים לאחר 10 דקות ו 20 דקות.
5. יש לשחזר מדיה המכילה את הרקמה, לשטוף באמצעות פיפט דרך קצה מיקרופיפטה P1,000, ולסנן דרך מסנן של 100 מיקרומטר.
6. צנטריפוגה ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנטנט, והניחו בצד את גלולת התא (המועשרת בתאי TC וסטרומה) על קרח לצורך תיוג ו-FACS.

5. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

1. להשהות מחדש את כדורי התא בתמיסת חסימה (PBS + 0.1% FBS), ולדגור במשך 10 דקות ב 4 ° C.
2. צנטריפוגה ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות, ולשאוף את supernatant.
3. השהה מחדש את כדורי התא בתמיסת חסימה המכילה נוגדנים מצומדים ישירות (ראה טבלה 1 עבור שילובי נוגדנים מתאימים לזיהוי GCs ו- TC), ודגור על קרח במשך 10 דקות.
4. לשטוף ולצנוח את התאים ב 300 × גרם ו 4 ° C במשך 3 דקות. השהה מחדש את התאים במאגר FACS המכיל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), והפעל את תרחיף התא באמצעות מכשיר FACS כדי ללכוד אוכלוסייה קטנה של התאים (500-1,000) באמצעות עוצמת הפלואורסצנטיות של נוגדנים מצומדים פלואורופורים לגטינג.
5. לזיהוי תת-אוכלוסיות ייחודיות, השתמש באסטרטגיות ה-gating הבאות:
   1. לטיהור GCs, ציירו שער סביב תאי CD45+ (איור 1B), והוציאו את האוכלוסייה הזו מאוכלוסיית CD99⁺ (איור 1A ואיור 1C); לאחר מכן, חלקו עוד יותר את החלק הנותר של CD99+ לשברים ^PVRL+/- (איור 1A ואיור 1C).
   2. לטיהור TCs וסטרומה, שער את כלל אוכלוסיית ENG+ (איור 1A) או CD55+ (איור 1D) כך שלא תכלול את מקטע האנדותל CD34+ (איור 1E) ותבדיל בין התאים הסטרואידוגניים (ANPEP⁺) והלא סטרואידוגניים (ANPEP^-). היזהר לפצות על דימום בין פלואורופורים קרובים בספקטרום הפליטה.
6. כדי לאמת את טוהר מקטע התא המיון, הפעל 5% מהנפח הכולל שנלכד באמצעות מכשיר FACS, וודא שהתאים מאכלסים את השערים הצפויים ונמצאים בטוהר של >95%.

6. עיבוד רקמת קליפת המוח השחלתית

1. חותכים את שארית השחלה, ומוציאים את המדולה באמצעות מספריים ואזמלים עדינים מעוקלים, תוך זהירות כדי למנוע נזק לקליפת השחלות.
2. המשך עיבוד ודילול קליפת השחלות על ידי גירוד עדין עד שתישאר מדולה מינימלית. הקפד להשתמש בכוח המינימלי הדרוש.
   הערה: עובי רקמת קליפת המוח צריך להיות בין 1 מ"מ ל -1.5 מ"מ.
3. מחלקים את רקמת קליפת המוח לרצועות ברוחב 2-3 מ"מ לאורך השחלה.

7. רקמת השחלות הקפאה איטית

1. הכנה להקפאה
   1. הכניסו רצועה אחת מקליפת המוח לכל בקבוקון קריוגני צונן המכיל תמיסת הקפאה.
   2. נערו את הבקבוקונים הקריוגניים המכילים את רצועות קליפת המוח על צלחת מסתובבת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C.
2. הקפאה איטית של רקמת השחלה⁵
   1. הכניסו את הקריביאלים המכילים רקמת שחלה למקפיא הניתן לתכנות כך שיתחיל ב-0 מעלות צלזיוס.
   2. מצננים בקצב של 2°C/min עד 7°C-.
   3. שמור על cryovials בטמפרטורה זו במשך 10 דקות.
   4. היווצרות גבישי קרח גרעיניים על ידי נגיעה בכל קריוביאל עם קצה כותנה שהיה שקוע לזמן קצר בחנקן נוזלי (LN₂).
   5. מצננים בקצב של 0.3°C/min עד שטמפרטורת הדגימה מגיעה ל-40°C.
   6. הגדל את קצב הקירור ל -10 ° C / min עד שטמפרטורת הדגימה מגיעה ל -140 ° C.
   7. העבר את cryovials לאחסון LN₂.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בודדנו זקיקים מפני השטח של השחלה וטיפלנו בהם באופן אנזימטי כדי לבודד את תאי GCs כמו גם תאי תקה וסטרומה המקיפים את החלל האנטרלי. התאים נאספו, ושברי התאים מוינו מהזקיקים האנטראליים (קטרים הנעים בין 0.5 מ"מ ל-4 מ"מ) לפי FACS לטוהר של >95% (איור 1).

כדי לתייג ולטהר שברים תאי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פתרון טוב יותר של המגוון התאי בתוך זקיקי השחלות חשוב מבחינה קלינית מכמה סיבות. ביישום הפרוטוקול הנ"ל על בידוד תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים השוכנים בתוך זקיקי השלב האנטראלי יש לקחת בחשבון מספר גורמים. ראשית, בריאותה וכדאיותה של רקמת השחלה שממנה נגזר הזקיק האנטרלי היא קריטית לקביעת איכות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss