使用光片荧光显微镜对老化耳蜗进行成像

摘要

开发了一种光片显微镜来对整个耳蜗进行成像和数字化。

摘要

耳聋是最常见的感觉障碍，根据世界卫生组织1，全球约有5%或4.3亿人^{受到影响。}衰老或老年性聋是感音神经性听力损失的主要原因，其特征是毛细胞、螺旋神经节神经元 （SGN） 和血管纹受损。这些结构位于耳蜗内，耳蜗具有复杂的螺旋形膜组织解剖结构，悬浮在液体中并被骨包围。这些特性使得研究和量化组织病理学变化在技术上变得困难。为了满足这一需求，我们开发了一种光片显微镜（TSLIM），可以对整个耳蜗进行成像和数字化，以促进内耳结构 - 功能关系的研究。整个耳蜗对齐良好的连续切片会产生一堆图像，用于三维 （3D） 体积渲染和单个结构的分割，以进行 3D 可视化和定量分析（即长度、宽度、表面、体积和数量）。耳蜗需要最少的处理步骤（固定、脱钙、脱水、染色和光学清除），所有这些都与随后通过扫描和透射电子显微镜进行的高分辨率成像兼容。由于所有组织都存在于堆栈中，因此可以单独评估每个结构或相对于其他结构进行评估。此外，由于成像使用荧光探针，免疫组织化学和配体结合可用于识别特定结构及其在耳蜗内的3D体积或分布。在这里，我们使用TSLIM检查老年小鼠的耳蜗，以量化毛细胞和螺旋神经节神经元的损失。此外，高级分析（例如聚类分析）用于可视化罗森塔尔管中螺旋神经节神经元沿其3D体积的局部减少。这些方法证明了TSLIM显微镜量化耳蜗内部和耳蜗之间结构 - 功能关系的能力。

引言

耳蜗是哺乳动物听力的周围感觉器官。它具有重复的感觉和支持细胞的复杂螺旋解剖结构，这些细胞在解剖学上专门用于检测声音振动并将其传输到大脑以进行听觉感知。主要的感觉元素是内毛细胞和外毛细胞及其神经支配神经纤维，其细胞体构成螺旋神经节，位于罗森塔尔管内（图1）。这些感觉和神经结构按张力排列，使得高频声音在耳蜗基底转导，低频声音在耳蜗^顶点转导2。沿支撑基底膜螺旋长度的这种感觉细胞分布的解剖图称为细胞耳蜗^图3 ，可以与听力损失进行比较，听力图中显示的频率是函数。

耳蜗的膜性迷宫被致密的骨头包围，这使得一次检查多个耳蜗结构在技术上变得困难。因此，开发光片显微镜的基本原理是产生完整耳蜗的对齐良好的连续切片，以便在3D重建中可以相对检查所有耳蜗结构。Voie等^人4 和Voie和Spelman⁵ 设计了第一台光片显微镜，称为正交平面荧光光学切片（OPFOS）显微镜，用于光学切片整个耳蜗。然而，这种显微镜从未商业化开发;因此，我们的目标是构建一种称为薄片激光成像显微镜（TSLIM; 图2）。TSLIM的设计和施工细节之前已经公布了⁸。TSLI....

研究方案

所有程序和活体动物的使用均已由明尼苏达大学机构护理和使用委员会（IACUC）审查和批准（协议编号#2010-38573A），使用这些动物的研究人员在进入动物设施之前已经过研究动物资源（RAR）兽医的全面培训和测试。本研究均使用雄性和雌性小鼠。

1. 耳蜗去除固定和组织处理成像

1. 使用CO₂ 吸入对小鼠实施安乐死。用剪刀将小鼠斩首，并通过大脑做一个背腹切口以使头骨半切。切除大脑，识别颅骨基底腹侧的圆形大疱，用圆疱打开大疱，观察并去除耳蜗。
2. 固定：在通风橱下并使用解剖显微镜以5倍放大倍率执行此过程。戴手套和防护服。刺破椭圆形窗户并用锋利的镐取下镫骨。将镐插入圆窗以刺穿膜。
3. 用连接到装有 2 mL 福尔马林的 1 mL 注射器的输液器的切口盖住打开的圆形窗口。在2分钟内通过耳蜗的外淋巴间隙缓慢注入福尔马林，注意福尔马林通过打开的椭圆形窗口 离开 耳蜗。修剪耳蜗上多余的组织，浸入含有10%福尔马林的瓶子中，然后放在旋转器上过夜。
4. 脱钙：将耳蜗在PBS 3x中冲洗5分钟，然后浸入含有10%乙二胺四乙酸二钠溶液（EDTA）的瓶中旋转4天，每天更换溶液。
5. 脱水：用PBS 3x灌注耳蜗，并在两次更换之间浸泡15分钟。用乙醇升序浓度10%，50%，70%，95%，95%，100%，100%使耳蜗脱水;每种浓度30分钟。

结果

由于本期特刊的主题是成像耳蜗衰老的影响，因此将以年轻（3个月大，HS2479，CBA菌株小鼠）和老年（23个月大，HS2521，C57品系小鼠）耳蜗为例。应该注意的是，TSLIM能够对各种标本进行成像，包括来自人类，哺乳动物，其他啮齿动物和鱼类以及其他器官（例如大脑）的耳蜗。

^{Johnson等人13}发表了一篇关于使用TSLIM在年轻（3周龄）CBA小鼠中加入SGN的文章。在五只.......

讨论

通过光片显微镜进行光学切片以检查耳蜗结构不像其他更传统的组织学方法那样具有机械破坏性，并且它提供了耳蜗结构相对于彼此的完整数字视图。以前的方法，如Corti¹⁴ 器官的表面制备提供了沿基底膜长度的毛细胞损失图，但无法评估SGN损失，因为组织已被解剖以揭示Corti的器官。或者，耳蜗的中模态切片切片仅提供整个罗森塔尔管长度的SGN状况的非常小样本。使用TSLIM，所?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423