Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Riepilogo

È stato sviluppato un microscopio a foglio di luce per visualizzare e digitalizzare l'intera coclea.

Abstract

La sordità è la menomazione sensoriale più comune, che colpisce circa il 5% o 430 milioni di persone in tutto il mondo secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità¹. L'invecchiamento o presbiacusia è una causa primaria di perdita dell'udito neurosensoriale ed è caratterizzata da danni alle cellule ciliate, ai neuroni gangliari spiralati (SGN) e alla stria vascolare. Queste strutture risiedono all'interno della coclea, che ha una complessa anatomia a forma di spirale di tessuti membranosi sospesi nel fluido e circondati da osso. Queste proprietà rendono tecnicamente difficile indagare e quantificare i cambiamenti istopatologici. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un microscopio a foglio luminoso (TSLIM) in grado di visualizzare e digitalizzare l'intera coclea per facilitare lo studio delle relazioni struttura-funzione nell'orecchio interno. Le sezioni seriali ben allineate dell'intera coclea si traducono in una pila di immagini per il rendering tridimensionale (3D) del volume e la segmentazione delle singole strutture per la visualizzazione 3D e l'analisi quantitativa (cioè lunghezza, larghezza, superficie, volume e numero). Le coclee richiedono passaggi di elaborazione minimi (fissazione, decalcificazione, disidratazione, colorazione e pulizia ottica), tutti compatibili con la successiva imaging ad alta risoluzione mediante scansione e microscopia elettronica a trasmissione. Poiché tutti i tessuti sono presenti nelle pile, ogni struttura può essere valutata singolarmente o in relazione ad altre strutture. Inoltre, poiché l'imaging utilizza sonde fluorescenti, l'immunoistochimica e il legame del ligando possono essere utilizzati per identificare strutture specifiche e il loro volume o distribuzione 3D all'interno della coclea. Qui abbiamo usato TSLIM per esaminare le coclee di topi anziani per quantificare la perdita di cellule ciliate e neuroni gangliari a spirale. Inoltre, sono state utilizzate analisi avanzate (ad esempio, analisi dei cluster) per visualizzare le riduzioni locali dei neuroni ganglio spirale nel canale di Rosenthal lungo il suo volume 3D. Questi approcci dimostrano la capacità della microscopia TSLIM di quantificare le relazioni struttura-funzione all'interno e tra le coclee.

Introduzione

La coclea è l'organo sensoriale periferico per l'udito nei mammiferi. Ha una complessa anatomia a spirale di cellule sensoriali e di supporto ripetute che sono anatomicamente specializzate per rilevare le vibrazioni sonore e trasmetterle al cervello per la percezione dell'udito. I principali elementi sensoriali sono le cellule ciliate interne ed esterne e le loro fibre nervose innervanti i cui corpi cellulari compongono il ganglio a spirale, che risiede all'interno del canale di Rosenthal (Figura 1). Queste strutture sensoriali e neurali sono disposte tonotopicamente in modo tale che i suoni ad alta frequenza siano trasdotti nella base cocleare e i suoni a bassa frequenza siano trasdotti nell'apice² della coclea. Una mappa anatomica di questa distribuzione cellulare sensoriale lungo la lunghezza della spirale della membrana basilare di supporto è chiamata citococleogramma³ e può essere confrontata con la perdita dell'udito in funzione della frequenza come raffigurato in un audiogramma.

Il labirinto membranoso della coclea, che è circondato da ossa dense, rende tecnicamente difficile esaminare più di una struttura cocleare alla volta. Pertanto, la logica per lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce è quella di produrre sezioni seriali ben allineate della coclea completa in modo che tutte le strutture cocleari possano essere esaminate l'una rispetto all'altra nelle ricostruzioni 3D. Voie et ^al.4 e Voie e Spelman⁵ progettarono il primo microscopio a foglio di luce, chiamato microscopio OPFOS (orthogonal plane fluorescence optical sectioning), per sezionare otticamente l'intera coclea. Tuttavia, questo microscopio non è mai stato sviluppato commercialmente; quindi, il nostro obiettivo era quello di costruire un microscopio a foglio leggero chiamato microscopio laser a foglio sottile (TSLIM; Figura 2). I dettagli di progettazione e costruzione di TSLIM sono stati precedentemente pubblicati⁸. TSLIM ha apportato diversi miglioramenti rispetto all'OPFOS, tra cui l'utilizzo di una fotocamera digitale a bassa illuminazione rispetto a una telecamera CCD per la raccolta di immagini, microposizionatori codificati otticamente per un movimento accurato e riproducibile del campione attraverso il foglio luminoso, l'uso di una camera del campione otticamente trasparente disponibile in commercio e la colorazione della rodamina in etanolo piuttosto che nella soluzione di compensazione per prevenire la precipitazione delle macchie all'interno del tessuto. Lo sviluppo commerciale di microscopi a foglio di luce come SPIM⁶ si è concentrato sull'imaging ad alta risoluzione di piccoli campioni trasparenti vivi, ma non sono adatti per l'imaging cocleare intero in quanto mancano di un'adeguata distanza di lavoro. Una rassegna dello sviluppo di altri microscopi a foglio di luce è stata pubblicata da Santi⁷. Il vantaggio principale di TSLIM rispetto ad altri metodi istologici per esaminare la coclea è quello di sezionare otticamente i tessuti per la ricostruzione 3D preservando l'integrità del campione in modo che possa essere utilizzato da altri metodi istologici. Un altro vantaggio dell'imaging TSLIM è che solo un sottile foglio di luce prodotto da un laser viene esposto al tessuto, rispetto all'esposizione all'intero spessore del tessuto al laser come nella microscopia confocale. La pulizia del tessuto per ridurre al minimo la dispersione della luce e il fatto che solo una piccola parte del tessuto sia esposta al laser si traduce in uno sbiadimento minimo del fluorocromo (fotosbiancamento) con l'imaging laser a foglio di luce. Tuttavia, il processo di fissazione, disidratazione e compensazione altera la morfologia delle strutture cocleari e provoca il restringimento dei tessuti rispetto al tessuto vivente. La quantità effettiva di restringimento tissutale che si verifica non è stata determinata.

TSLIM è stato sviluppato da Shane Johnson e otto studenti tedeschi di ingegneria ottica (vedi Riconoscimenti). I dettagli costruttivi di TSLIM sono stati forniti da Santi et ^al.8 e una versione di scansione (sTSLIM) da Schröter et ^al.9. TSLIM funziona come microtomo non distruttivo per i campioni a sezione ottica e come microscopio per raccogliere sezioni seriali 2D attraverso l'intera larghezza e spessore della coclea. TSLIM può visualizzare campioni piccoli (mm) e grandi (cm) di spessore. Le lenti sono montate ad aria per consentire lunghe distanze di lavoro con obiettivi di raccolta di 1x e 2x su un microscopio a dissezione. Il microscopio a dissezione ha anche un'ottica zoom che consente a TSLIM di risolvere le strutture subcellulari e sinaptiche sulle cellule. TSLIM è dotato di un laser blu (473 nm) e verde (532 nm) per l'illuminazione che consente di utilizzare una varietà di sonde fluorescenti per l'imaging. L'obiettivo di TSLIM è quello di produrre sezioni ottiche 2D ben allineate attraverso un'intera coclea per una ricostruzione digitale completa dei tessuti cocleari. Poiché si tratta di un metodo fluorescente, i ligandi e l'immunoistochimica possono anche essere utilizzati per identificare specifiche strutture cocleari.

Inizialmente, una lente cilindrica è stata utilizzata per produrre due fogli di luce gaussiani opposti, ma ha prodotto artefatti di imaging di assorbimento. A causa del lavoro di Keller et ^al.10, la lente cilindrica fissa è stata sostituita da uno specchio galvanometrico a scansione per produrre il foglio luminoso⁹. Inoltre, poiché il centro del foglio luminoso è il più sottile alla vita del fascio, le immagini 2D di sTSLIM vengono prodotte raccogliendo un composito di colonne di dati sull'asse X attraverso la larghezza del campione (Figura 3). Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Buytaert e Dircks¹¹. Il software personalizzato TSLIM per guidare e raccogliere immagini è stato sviluppato utilizzando un programma grafico per il controllo dello strumento. Il foglio luminoso viaggia attraverso il campione e illumina un piano fluorescente all'interno del tessuto. Questo piano fluorescente viene proiettato ortogonalmente attraverso il campione trasparente e viene raccolto da un microscopio a dissezione. I microposizionatori codificati otticamente consentono di scansionare attraverso la vita del fascio nell'asse X per raccogliere una singola immagine 2D composita e, successivamente, il microposizionatore dell'asse Z sposta il campione su un piano più profondo all'interno del tessuto per ottenere una pila di immagini 2D sezionate seriali (Video 1, Figura 4). Una pila di immagini traslazionali viene raccolta attraverso l'intera larghezza, spessore e lunghezza della coclea e non è richiesta la cucitura delle immagini (Video 2). Lo stack di immagini viene trasferito su un altro computer e caricato in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D. Le pile di immagini contengono tutte le informazioni digitali sulla morfologia di una coclea alla risoluzione del microscopio. Tuttavia, se è richiesta una risoluzione più elevata, la coclea intatta può essere ulteriormente elaborata con metodi istologici distruttivi come il sezionamento del microtomo, la scansione e la microscopia elettronica a trasmissione.

Il programma di rendering 3D viene utilizzato per segmentare diverse strutture cocleari per il rendering 3D e l'analisi quantitativa. Per la segmentazione, ogni struttura in ogni immagine 2D della pila viene tracciata utilizzando un colore diverso da una tavoletta grafica e una penna (Figura 5). Ad oggi, sono state segmentate 20 diverse strutture cocleari (Figura 6). Dopo la segmentazione, è possibile eseguire una varietà di analisi 3D. Ad esempio, il software di rendering 3D può virtualmente resezionare la coclea in qualsiasi piano lungo il centroide della struttura. Il video 3 mostra il sezionamento tangenziale all'organo di Corti, che rivela le cellule ciliate lungo la lunghezza della membrana basilare. Questo processo richiede innanzitutto la segmentazione manuale della struttura di interesse. Successivamente, il centroide della struttura viene calcolato in base all'adattamento dei minimi quadrati dei punti spline posizionati lungo il centro della struttura dalla sua base al suo apice, consentendo così un'approssimazione della lunghezza della struttura (Video 4). Un processo simile chiamato scheletratura può essere utilizzato per visualizzare la larghezza radiale della struttura lungo la sua lunghezza utilizzando una mappa a colori (Video 4). Il volume totale di ogni struttura viene calcolato dal programma dopo la segmentazione, ma le distanze relative possono anche essere quantificate e visualizzate con mappe a colori in un software di rendering 3D (Figura 7). Le strutture segmentate possono anche essere esportate per produrre rendering di modelli in plastica solida ingranditi (Figura 8). Inoltre, il conteggio semi-automatico delle celle può essere eseguito anche utilizzando il software di rendering 3D (Figura 9). L'immunoistochimica e il legame del ligando possono essere utilizzati per colorare specifiche strutture cocleari e queste strutture possono essere isolate da altre strutture cocleari per la valutazione morfometrica come la produzione di un citococleogramma (Figura 10). Lunghezza, larghezza, superficie, volume e numero di tutte le strutture cocleari possono essere determinati dai modelli 3D, rendendo questo approccio ideale per mappare i danni cocleari alle menomazioni funzionali. In particolare, i danni cocleari dovuti all'invecchiamento, traumi indotti dal rumore o altri insulti possono essere mostrati e quantificati in ricostruzioni cocleari 3D da sezioni ottiche 2D. Una volta che una coclea è stata digitalizzata ci sono numerosi algoritmi di imaging che possono essere utilizzati per valutare il danno cocleare di qualsiasi tessuto all'interno della coclea nel registro anatomico ad altri tessuti cocleari.

Protocollo

Tutte le procedure e l'uso di animali vivi sono stati esaminati e approvati (ID protocollo # 2010-38573A) dal Comitato istituzionale di cura e uso dell'Università del Minnesota (IACUC) e gli investigatori che utilizzano questi animali sono stati accuratamente addestrati e testati dai veterinari delle risorse animali di ricerca (RAR) prima di avere accesso alle strutture per animali. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine.

1. Rimozione della coclea per la fissazione e l'elaborazione dei tessuti per l'imaging

1. Eutanasia di un topo usando l'inalazione di CO₂ . Decapitare il topo con le forbici e fare un'incisione dorsale-ventrale attraverso il cervello per emisecare il cranio. Rimuovere il cervello, identificare la bulla rotonda nella parte baso-ventrale del cranio, aprire la bulla con rongeurs e visualizzare e rimuovere la coclea.
2. Fissaggio: eseguire questa procedura sotto una cappa aspirante e utilizzando un microscopio a dissezione con ingrandimento 5x. Indossare guanti e indumenti protettivi. Forare la finestra ovale e rimuovere le staffe con un plettro affilato. Inserire un plettro nella finestra rotonda per forare la membrana.
3. Coprire la finestra rotonda aperta con la punta tagliata di un set per infusione attaccato a una siringa da 1 mL riempita con 2 mL di formalina. Infondere lentamente formalina attraverso gli spazi perilinfatici della coclea per un periodo di 2 minuti, notando che la formalina sta uscendo dalla coclea attraverso la finestra ovale aperta. Tagliare il tessuto in eccesso dalla coclea e immergere in una bottiglia contenente il 10% di formalina e posizionare su un rotatore durante la notte.
4. Decalcificazione: Risciacquare la coclea in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno e immergerla in un flacone contenente una soluzione al 10% di acido disodico etilendiamminotetraacetico (EDTA) con rotazione per 4 giorni, cambiando la soluzione ogni giorno.
5. Disidratazione: perfondere la coclea con PBS 3x e immergere per 15 minuti tra un cambio e l'altro. Disidratare la coclea con concentrazioni crescenti di etanolo 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; per 30 minuti in ogni concentrazione.
   NOTA: È importante rimuovere tutto l'EDTA prima della disidratazione poiché l'EDTA precipita nell'etanolo. Inoltre, le coclee possono essere lasciate in qualsiasi concentrazione di etanolo superiore al 70% durante la notte.
6. Colorazione: Colorare l'intera coclea per immersione in una soluzione di isotiocinato di Rhodamina B (5 μg/ml in etanolo al 100%) durante la notte con rotazione. Rimuovere il colorante in eccesso dalla coclea con due cambiamenti di etanolo al 100%, 5 minuti ciascuno.
7. Pulizia: Trasferire la coclea colorata in due cambi di soluzione di Spalteholz¹² (5:3 metil salicilato:benzil benzoato), 30 minuti ogni cambio e lasciare per una notte nella soluzione di compensazione con rotazione. Le coclee possono essere lasciate in soluzione di Spalteholz indefinitamente.

2. Imaging delle coclee

1. Attaccare le coclee a un'asta del campione all'estremità ovale e rotonda della membrana della finestra in modo che la soluzione di compensazione rimanga all'interno della coclea e non si formino bolle (Figura 2). Bisogna fare attenzione a non lasciare che si formino bolle all'interno della coclea in quanto sono difficili da rimuovere e se lasciate nel tessuto, causeranno artefatti di imaging.
2. Utilizzare una colla attivante UV per fissare la coclea bagnata all'asta del campione asciutto (Figura 2). Attaccare la coclea alle estremità ovali e rotonde della finestra. Polimerizzare la colla UV per 10 secondi spostandosi intorno alla coclea con la luce UV.
   NOTA: Un attacco allentato della coclea all'asta del campione causerà difetti di imaging. Questa asta è prodotta appositamente per questo protocollo (vedi Santi et ^al.8 per i dettagli) ed è specifica per il nostro microscopio a foglio di luce.
3. Sospendere la coclea nella camera di imaging riempita con la soluzione di Spalteholz per l'imaging. La camera del campione è una cella fluorometrica al quarzo otticamente trasparente (Video 1).
4. Fissare l'asta del campione a un supporto rotante anch'esso collegato allo stadio di traslazione XZ. La maggior parte delle pile sono ottenute traslando il campione nei piani XZ, ma è anche possibile ottenere pile rotazionali.
5. Sezionamento ottico TSLIM: utilizzare un laser blu o verde per l'eccitazione a seconda del tipo di colorazione al fluorocromo. Posizionare il foglio luminoso al centro del tessuto per la messa a fuoco e determinare l'ingrandimento che verrà utilizzato per illuminare l'intera larghezza della coclea. Quindi, utilizzare un programma progettato su misura per spostare il campione attraverso il foglio luminoso attraverso il campione sull'asse X (cucendo l'immagine) e in passi Z per creare una pila di immagini 2D in tutta la coclea.
6. Per la prima immagine, la vita del fascio del foglio luminoso è posizionata sul bordo del campione e il programma scansiona l'intera larghezza del campione raccogliendo colonne di dati (vedi cucitura dell'immagine; Santi et ^al.8) che sono la larghezza del parametro confocale (Figura 3) per produrre un'immagine 2D composita di massima risoluzione su tutta la larghezza del campione. Il programma automatizza la cucitura delle immagini per ogni Z-step fino a quando il campione non è completamente ripreso.
7. Elaborazione delle immagini: trasferire lo stack di immagini su un altro computer e caricarlo in un programma di rendering 3D per la ricostruzione e la quantificazione 3D.

Risultati

Poiché il tema di questo numero speciale è l'imaging degli effetti dell'invecchiamento nella coclea, verranno utilizzate come esempi una coclea giovane (3 mesi, HS2479, topo ceppo CBA) e di età (23 mesi, HS2521, topo ceppo C57). Va notato che TSLIM è in grado di visualizzare una varietà di campioni, tra cui coclee di esseri umani, mammiferi, altri roditori e pesci, nonché altri organi come il cervello.

Johnson et al. ¹³ hanno pubblicato un articolo sugli SGN in to...

Discussione

Il sezionamento ottico mediante microscopia a foglio di luce per l'esame delle strutture cocleari non è meccanicamente distruttivo come altri metodi istologici più tradizionali e fornisce una visione digitale completa delle strutture cocleari l'una rispetto all'altra. Metodi precedenti come i preparati superficiali dell'organo di Corti¹⁴ hanno fornito una mappa della perdita di cellule ciliate lungo la lunghezza della membrana basilare, ma la perdita di SGN non poteva essere valutata poiché il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423