Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Özet

Tüm kokleayı görüntülemek ve dijitalleştirmek için bir ışık tabakası mikroskobu geliştirilmiştir.

Özet

Sağırlık, Dünya Sağlık Örgütü^1'e göre dünya çapında yaklaşık% 5 veya 430 milyon insanı etkileyen en yaygın duyusal bozukluktur. Yaşlanma veya presbycusis, sensörinöral işitme kaybının birincil nedenidir ve saç hücrelerine, spiral ganglion nöronlarına (SGN'ler) ve stria vascularis'e verilen hasar ile karakterizedir. Bu yapılar, sıvı içinde asılı duran ve kemikle çevrili membranöz dokuların karmaşık, spiral şekilli bir anatomisine sahip olan kokleanın içinde bulunur. Bu özellikler, histopatolojik değişikliklerin araştırılmasını ve ölçülmesini teknik olarak zorlaştırmaktadır. Bu ihtiyacı karşılamak için, iç kulaktaki yapı-fonksiyon ilişkilerinin incelenmesini kolaylaştırmak için tüm kokleayı görüntüleyebilen ve dijitalleştirebilen bir ışık tabakası mikroskobu (TSLIM) geliştirdik. Tüm kokleanın iyi hizalanmış seri bölümleri, üç boyutlu (3B) hacim oluşturma ve 3B görselleştirme ve nicel analiz (yani uzunluk, genişlik, yüzey, hacim ve sayı) için ayrı ayrı yapıların segmentasyonu için bir görüntü yığını oluşturur. Kokleae, minimum işlem adımlarına (fiksasyon, kireç giderme, dehidrasyon, boyama ve optik temizleme) ihtiyaç duyar ve bunların hepsi tarama ve iletim elektron mikroskobu ile sonraki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumludur. Tüm dokular yığınlarda bulunduğundan, her yapı ayrı ayrı veya diğer yapılara göre değerlendirilebilir. Ek olarak, görüntüleme floresan problar kullandığından, immünohistokimya ve ligand bağlama, spesifik yapıları ve bunların koklea içindeki 3D hacmini veya dağılımını tanımlamak için kullanılabilir. Burada, saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöronlarının kaybını ölçmek için yaşlı farelerden kokleaları incelemek için TSLIM'i kullandık. Ek olarak, Rosenthal kanalındaki spiral ganglion nöronlarının 3D hacmi boyunca lokal olarak azalmalarını görselleştirmek için gelişmiş analizler (örneğin, küme analizi) kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, TSLIM mikroskopisinin koklea içindeki ve arasındaki yapı-fonksiyon ilişkilerini ölçme yeteneğini göstermektedir.

Giriş

Koklea, memelilerde işitme için periferik duyu organıdır. Ses titreşimlerini tespit etmek ve işitme algısı için beyne iletmek için anatomik olarak uzmanlaşmış tekrarlayan duyusal ve destekleyici hücrelerin karmaşık bir spiral anatomisine sahiptir. Ana duyusal elementler, Rosenthal kanalında bulunan spiral ganglionu oluşturan hücre gövdeleri olan iç ve dış kıl hücreleri ve bunların sinir bozucu sinir lifleridir (Şekil 1). Bu duyusal ve nöral yapılar, yüksek frekanslı seslerin koklear tabanda ve düşük frekanslı seslerin koklea tepe^2'de dönüştürüleceği şekilde tonotopik olarak düzenlenmiştir. Destekleyici baziler memb....

Protokol

Tüm prosedürler ve canlı hayvanların kullanımı, Minnesota Üniversitesi Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol Kimliği #2010-38573A) ve bu hayvanları kullanan araştırmacılar, hayvan tesislerine erişmeden önce Araştırma Hayvan Kaynakları (RAR) Veteriner Hekimleri tarafından kapsamlı bir şekilde eğitilmiş ve test edilmiştir. Bu çalışmada hem erkek hem de dişi fareler kullanılmıştır.

1. Fiksasyon için koklea çıkarılması ve görüntüleme için doku işleme

1. CO₂ inhalasyonunu kullanarak bir fareyi ötenazi yapın. Farenin kafasını makasla kesin ve kafatası....

Sonuçlar

Bu özel sayının teması kokleade yaşlanmanın etkilerini görüntülemek olduğundan, genç (3 aylık, HS2479, CBA suş faresi) ve yaşlı (23 aylık, HS2521, C57 suşlu fare) koklealar örnek olarak kullanılacaktır. TSLIM'in insanlardan, memelilerden, diğer kemirgenlerden ve balıklardan kokleaların yanı sıra beyin gibi diğer organlardan gelen koklealar da dahil olmak üzere çeşitli örnekleri görüntüleyebildiği belirtilmelidir.

Johnson ve ark. ¹³ , TM.......

Tartışmalar

Koklear yapıların incelenmesi için ışık tabakası mikroskobu ile optik kesitleme, diğer geleneksel histolojik yöntemler gibi mekanik olarak yıkıcı değildir ve koklear yapıların birbirine göre tam bir dijital görünümünü sağlar. Corti¹⁴ organının yüzey preparatları gibi önceki yöntemler, baziler zarın uzunluğu boyunca saç hücresi kaybının bir haritasını sağladı, ancak doku Corti organını ortaya çıkarmak için diseke edildiğinden SGN kaybı değerlendirilemed.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira 3D Rendering Software	ThermoFisher Scientific		Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzyl benzoate (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Ethanol 95% and 100%	University of Minnesota		Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
LabVIEW graphical program and Vision	National Instruments		Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
methyl salicylate (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Olympus MVX10 dissection microscope	Olympus Corp		Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Rhodamine B isothiocynate, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Starna Flurometer Cell (3-G-20)	Starna Cells		Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423