小鼠结肠隐窝三维培养离体研究肠道干细胞功能

摘要

本协议描述了建立鼠结肠类器官系统以研究claudin-7敲除模型中结肠干细胞的活性和功能。

摘要

肠上皮每5-7天再生一次，并由位于隐窝区域底部的肠上皮干细胞（IESC）群控制。IESC包括活性干细胞，其自我更新并分化为各种上皮细胞类型，以及静止干细胞，在受伤的情况下作为储备干细胞。肠上皮的再生由这些活性IESC的自我更新和分化能力控制。此外，隐窝干细胞群的平衡和干细胞生态位的维持对于肠道再生至关重要。类器官培养是研究调节干细胞存活和功能的蛋白质、信号分子和环境线索的一种重要且有吸引力的方法。该模型比动物模型更便宜，耗时更少，并且更易于操作。类器官还模仿组织微环境，提供 体内 相关性。本协议描述了结肠隐窝的分离，将这些分离的隐窝细胞嵌入到三维凝胶基质系统中并培养隐窝细胞以形成能够自组织，增殖，自我更新和分化的结肠类器官。该模型允许人们操纵环境 - 敲除特定的蛋白质，如claudin-7，激活/停用信号通路等 - 研究这些效应如何影响结肠干细胞的功能。具体而言，研究了紧密连接蛋白claudin-7在结肠干细胞功能中的作用。Claudin-7对于维持肠道稳态和屏障功能和完整性至关重要。在小鼠中敲除claudin-7诱导炎症性肠病样表型，表现出肠道炎症，上皮增生，体重减轻，粘膜溃疡，上皮细胞脱落和腺瘤。此前，据报道，claudin-7是小肠肠上皮干细胞功能所必需的。在该协议中，建立了结肠类器官培养系统以研究claudin-7在大肠中的作用。

引言

肠道类器官培养是一种三维（3D）离体系统，其中干细胞从原代组织的肠隐窝中分离并接种到凝胶基质^中1^，2。这些干细胞能够自我更新，自我组织和器官功能²。类器官模拟组织微环境，与二维（2D）体外细胞培养模型更类似于体内模型，尽管可操作性不如细胞^3，4。该模型消除了2D模型中遇到的障碍，例如缺乏适当的细胞-细胞粘附，细胞-基质相互作用和同质群体，并且还减少了动物模型的局限性，包括高成本和长时间^5。肠道类器官 - 也称为结肠类器官，用于从结肠隐窝来源的干细胞生长的类结肠 - 本质上是包含上皮的微型器官，包括体内存在的所有细胞类型以及腔。该模型允许操纵系统来研究肠道的许多方面，例如干细胞生态位、肠道生理学、病理生理学和肠道形态发生³，^5，6。它还为药物发现、研究炎症性肠病 （IBD） 和结直肠癌等人类肠道疾病、患者特异性个性化治疗开发以及研究组织再生⁴，⁷，^8，9 提供了一个很好的模型。此外，类器官系统还可用于研究细胞通讯、药物代谢、活力、增殖和对刺激的反应7^，8。虽然动物模型可用于测试肠道病理状况的潜在治疗方法，但它们非常有限，因为同时研究多种药物是一项挑战。体内混杂变量较多，相关成本和时间分别高而长。另一方面，类器官培养系统允许在较短的时间内一次筛选多种治疗方法，并且还允许通过使用患者来源的类^{器官培养物}进行个性化治疗4^，8。结肠类器官模仿组织组织、微环境和功能的能力也使它们成为研究再生和组织修复的优秀模型⁹。本实验室建立了小肠类器官培养系统，研究claudin-7对小肠干细胞功能的影响¹⁰。在这项研究中，建立了一个大型肠道类器官培养系统来研究干细胞在条件claudin-7敲除（cKO）模型中自我更新，分化和增殖的能力或缺乏能力。

Claudin-7是一种非常重要的紧密连接（TJ）蛋白，在肠道中高度表达，对于维持TJ功能和完整性至关重要¹¹。cKO小鼠患有IBD样表型，表现出严重的炎症，溃疡，上皮细胞脱落，腺瘤和细胞因子水平升高^11，12。虽然人们普遍认为克劳迪斯对上皮屏障功能至关重要，但克劳迪斯的新角色正在出现;它们参与增殖、迁移、癌症进展和干细胞功能¹⁰，^12，13，^14，15，^16，17。目前尚不清楚claudin-7如何影响结肠干细胞的干细胞生态位和功能。由于肠道大约每5-7天快速自我更新一次，因此维持干细胞生态位和活性干细胞的正常功能至关重要¹⁸。在这里，建立了一个系统来检查claudin-7对结肠干细胞生态位的潜在调节作用。

研究方案

所有动物实验和程序均由东卡罗来纳大学（ECU）动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照美国国立卫生研究院和ECU关于实验动物护理和使用指南进行。通过将C57BL6claudin-7-flox转基因小鼠与Villin-CreERT2小鼠杂交产生诱导的肠特异性claudin-7基因敲除小鼠¹⁹。本研究使用3个月大的雄性和雌性小鼠。

1. 试剂/设备准备

1. 在开始相关实验之前冷却以下试剂/设备:磷酸盐缓冲盐水（PBS），用于在隐窝分离期间清洗结肠组织;摇臂/旋转器（置于4°C冰箱中）用于与上皮解离培养基孵育。
   1. 从-20°C中取出凝胶基质（参见 材料表），并在电镀前在冰上解冻。
   2. 将离心机预冷至4°C，然后再旋转地下室进行电镀。
   3. 冷却0.1%柠檬酸钠缓冲液（见 材料表），并在 原位 细胞死亡检测之前保持在冰上。
2. 在开始相关实验之前加热以下试剂:96孔培养板在接种前24小时;L-WRN培养基（见 材料表）在添加到电镀地穴之前和每个介质更换之前。
   1. 染色前将水浴加热至94°C。

2.鼠结肠隐窝隔离

1. 按照以下步骤准备必要的介质。
   注意:此处计算两只小鼠结肠组织的培养基体积。
   1. 制备上皮解离培养基:30 mL 1x PBS + 400 μL 0.5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632 二盐酸盐（参见 材料表）。在冰上保持使用。
   2. 制备隐窝解离培养基:10 mL 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 二盐酸盐。在冰上保持使用。
   3. 补充 L-WRN 培养基:50 mL L-WRN 培养基 + 47.5 mL DMEM 高葡萄糖与 L-谷氨酰胺 + 500 μL L-谷氨酰胺 + 500 μL 青霉素/链霉素 + 1，000 μL B-27 添加剂 （50x） + 500 μL N2 添加剂 （100x） + 50 μL HEPES （1 M） 缓冲溶液（参见 材料表）。
   4. 过滤完整的（补充的）L-WRN培养基和等分试样，以便在-20°C下储存长达3个月。
      注意:解冻的培养基在4°C下稳定长达2周。
2. 执行地穴隔离。
   1. 对于全身麻醉，在棉花中加入1mL异氟醚，并将其放入0.09立方英尺麻醉室内的塑料盒内（见 材料表）。将鼠标置于麻醉室中，直到呼吸停止（约3-5分钟），然后进行颈椎脱位²⁰。
   2. 沿着鼠标的中线做一个大约 2 的切口，固定背部皮肤以露出腹部。通过从近端切开盲肠下方和从远端切开直肠上方来分离结肠²¹。
   3. 使用镊子去除附着在结肠上的脂肪组织。利用镊子的平端轻轻地将粪便推出，并纵向切开组织。
   4. 使用镊子用冷的 1x PBS 清洗纸巾 10-15 次，在两次洗涤之间在 PBS 中"旋转"纸巾。
   5. 使用干净、锋利的剪刀，将组织切成小块，大小约为 3-5 毫米。
   6. 对第二只小鼠重复该过程，并将组织碎片合并到含有冷上皮解离培养基的50 mL管中（步骤2.1.1）。
   7. 将结肠组织碎片在上皮解离培养基中在4°C下轻轻摇动孵育90分钟。
   8. 让组织碎片沉入管底部，然后小心地丢弃上皮解离介质而不破坏组织。用冷的1x PBS洗涤纸巾10-15次时重复此过程。在最后一次洗涤期间尽可能多地丢弃PBS。
   9. 将隐窝解离培养基（步骤2.1.2）加入含有结肠组织碎片的50mL管中，并用手连续摇动5-10分钟。
      注:介质必须从分离的地穴中变得浑浊。
   10. 在细胞培养罩下，用70μm尼龙细胞过滤器（参见 材料表）将组织和培养基过滤到新鲜的50 mL管中。
   11. 在室温下以200× g 离心10分钟，弃去上清液而不干扰含有隐窝的沉淀。
       注意:根据设备的不同，可以将过滤的培养基转移到 15 mL 管中进行离心。
   12. 将沉淀重悬于~3-4mL冷的1x PBS中。
   13. 在显微镜载玻片上将 10 μL 分离的隐窝移液成一条线。在显微镜下，计算完整、长的隐窝数量，以估计每 10 μL 的隐窝浓度。
   14. 计算要旋转的适当体积的隐窝，以便在 96 孔板中接种 10 个隐窝/μL。

3. 隐窝电镀

1. 在1.5mL微量离心管中以200× g 在4°C下离心适当体积的分离隐窝5分钟。
2. 使用 1，000 μL 移液器小心地去除上清液，而不会破坏沉淀的隐窝。
3. 向沉淀的隐窝中加入 100 μL 凝胶基质（足够 9 个孔），并小心移液以避免引入气泡。
   注意:有关如何混合凝胶基质和隐窝的详细说明，请参阅讨论部分。通常，100 μL 足以容纳 9 个孔。
4. 让凝胶基质部分凝固（~1-2分钟）。
5. 板 10 μL 凝胶基质与预热的 96 孔培养板的每个孔中的隐窝混合以形成圆顶形状。
   注意:将圆顶放在井的中心。小心不要让凝胶基质扩散到孔的两侧。有关凝固和电镀的详细说明，请参阅讨论部分。
6. 让凝胶基质在37°C的培养箱中用5%CO₂完全凝固10-20分钟。
7. 准备L-WRN介质的最终工作溶液。
   1. 将 100 μL 喷尼西林/链霉素加入 10 mL 等分试样的 L-WRN 培养基中（参见步骤 2.1.3）（在 4 °C 下稳定 2 周）。
   2. 将补充剂添加到 900 μL 含有青霉素/链霉素的 L-WRN 培养基中:0.9 μL 1 mg/mL EGF + 0.9 μL 10 mM Y-27632 二盐酸盐。
      注:体积基于九口井。Y-27632二盐酸盐仅在第0天（电镀时）添加。
8. 向每个孔中加入 100 μL 培养基。小心不要破坏圆顶。
9. 在37°C下用5%CO₂ 孵育24小时。

4. 在培养中创造克劳丁-7敲除

1. 让地穴在培养物中正常生长24小时后。
2. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 2.7 μL 1 mmol/L 4-羟基他莫昔芬（4OH-他莫昔芬）加入 900 μL L-WRN 培养基（终浓度为 3 μmol/L）+ 0.9 μL 1 mg/mL EGF。
   注意:4OH-他莫昔芬的储备溶液是通过将粉末状的4OH-他莫昔芬（见 材料表）与1x PBS混合至浓度为1mmol/L来制备的。
3. 通过真空抽吸 从 孔中取出旧介质。
4. 向每个孔中加入 100 μL 含 4OH-他莫昔芬的培养基，并将其标记为 claudin-7 cKO/4OH-TAM。
   注意:需要将DMSO添加到对照孔中。必须每 2 天添加新鲜的含 4OH-他莫昔芬的培养基。
5. 在37°C孵育直至下一次培养基更换（~2-3天）。

5. 结肠类器官维护

注:介质必须每 2-3 天更换一次。培养长达12天。

1. 准备 L-WRN 培养基的新鲜最终工作溶液:900 μL L-WRN 培养基 + 0.9 μL 1 mg/mL EGF。
2. 通过真空抽吸 从 孔中取出旧介质。向孔中加入新鲜培养基。
   注意:注意不要破坏圆顶。
3. 在37°C下孵育，直到下一次培养基更换。
   注意:培养物可以在实验所需的持续时间内保持和传代。本研究的培养物通常维持9-12天，但可能希望继续15或20天。

6. 收获和包埋结肠类器官

1. 通过真空抽吸 从 孔中取出旧介质。
2. 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定类器官1小时。
   注意:PFA是一种有毒物质。使用本试剂时要注意注意事项。
3. 通过真空抽吸 从 孔中除去4%PFA，并在4°C下加入30%蔗糖24小时。
4. 标记塑料模具，并用最佳切割温度（OCT）化合物将其填充至90%（见 材料表）。
5. 通过真空抽吸 从 孔中除去30%的蔗糖。向每个孔中加入 10 μL 的 1x PBS。
6. 用移液器吸头轻轻刮擦孔底部以解离含有类器官的圆顶。
7. 用移液管取出含有解离类器官的PBS，然后将液体装入含有OCT的模具中。
   注意:避免将气泡引入OCT化合物。
8. 继续此过程，直到从所有孔中去除所有类器官。
9. 在不锈钢杜瓦瓶中，加入干冰颗粒和2-甲基丁烷（足以覆盖干冰颗粒）（见 材料表）。
10. 将含有类器官的OCT块稳定地保持在2-甲基丁烷以上以快速冷冻。
11. 将含有类器官的OCT块储存在-80°C，直到准备切片（可储存长达1年）。

7. 免疫荧光

1. 在-20°C下使用低温恒温器（参见 材料表）以5μm厚度切片含有类器官的OCT块。
2. 对于每个切片，在显微镜下检查以确保捕获类器官。切片完成后，将载玻片储存在-80°C直至准备染色（可保存长达6个月）。
3. 在94°C下在10mM柠檬酸钠缓冲液中加热载玻片10分钟。
   注意:缓冲液是通过将柠檬酸钠溶解在去离子水中制成的。用盐酸将pH值调节至6。
4. 让载玻片在工作台上冷却 20 分钟。用蒸馏水冲洗5分钟。
5. 用0.2%Triton X-100将载玻片组装在染色架（参见 材料表）中，并与100mM甘氨酸孵育15分钟。
6. 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭45分钟。
7. 与claudin-7抗鼠兔一抗²² （在1%BSA中稀释）在4°C孵育过夜。 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次 10 分钟。
8. 在室温下与Cy3抗兔二抗²³ （在1%BSA中稀释）孵育1小时。用 1x PBS 冲洗 3 次，每次 10 分钟。
9. 使用DAPI使用适当的安装介质（参见 材料表）安装载玻片，并添加盖玻片。

8. 细胞死亡检测

1. 在室温下用4%多聚甲醛固定孔内的类器官1小时。用 1x PBS 冲洗 5 分钟。
2. 将培养板在冰上与0.1%Triton X-100在冷的0.1%柠檬酸钠缓冲液中孵育2分钟。用 1x PBS 冲洗两次，每次冲洗 5 分钟。
3. 使用原位细胞死亡检测试剂盒TMR Red制备TUNEL反应^24，25（参见材料表）。向每个孔中加入 50 μL TUNEL 反应试剂。
4. 在黑暗中在37°C的潮湿气氛中孵育1小时。
   注意:所有剩余步骤必须在黑暗中完成。
5. 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。用1:2，500 Hoechst（在1x PBS中稀释，参见 材料表）孵育3分钟。
6. 用 1x PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。利用TRITC滤光片在荧光显微镜上可视化图像（见 材料表）。

结果

为了检查claudin-7对结肠干细胞的调节作用，如上所述从鼠结肠组织中分离结肠隐窝，如图 1A所示。从原代组织中分离出隐窝后，将它们接种在96孔板中的3D基质中以生长11天（图1）。正常健康的隐窝将在第2天关闭管腔并变成球状体，并最终在大约第5天开始出芽并形成各种上皮细胞类型（图1B）。允许结肠类生长到第11天，然后收获...

讨论

类器官培养是研究干细胞功能、肠道生理学、药物发现、人类肠道疾病以及组织再生和修复的优秀模型⁷，⁸，⁹，¹⁰，^11，26。虽然它有很多优点，但建立起来可能具有挑战性。在整个协议的所有步骤中都必须小心，但最重要的是在电镀阶段。将分离的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator	United States Plastic Corp	78564	anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
15 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco	14190-144
2-methylbutane	Sigma	277258
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)	Sigma	579002
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm nylon cell strainer	Corning	352350
96 well culture plate	Greiner Bio-One	655180
B-27 Supplement (50x)	Gibco	12587-010
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody	Immuno-Biological Laboratories	18875
Cover glass (24 x 50-1.5)	Fisher Scientific	12544E
Cryomolds	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02	gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody	Jackson Immunoresearch	111-165-003
Dewar Flask	Thomas Scientific	1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine	ATCC	30-2002
EVOS FLoid Imaging System	ThermoFisher	4477136
Fluoro-Gel II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Glycine	JT Baker	4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
In situ cell death detection kit, TMR Red	Roche	12156792910
Isoflurane	Pivetal	07-893-8440
L-WRN Media	Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core	N/A
Mouse surgical kit	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific	AGR1180
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Sequenza Rack	vwr	10129-584
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S-279
Sucrose	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate)	Corning	430769
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254