Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Resumo

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Resumo

O epitélio intestinal se regenera a cada 5-7 dias e é controlado pela população de células-tronco epiteliais intestinais (IESC) localizada na parte inferior da região da cripta. Os IESCs incluem células-tronco ativas, que se auto-renovam e se diferenciam em vários tipos de células epiteliais, e células-tronco quiescentes, que servem como células-tronco de reserva em caso de lesão. A regeneração do epitélio intestinal é controlada pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação dessas IESCs ativas. Além disso, o equilíbrio da população de células-tronco criptas e a manutenção do nicho de células-tronco são essenciais para a regeneração intestinal. A cultura organoide é uma abordagem importante e atraente para estudar proteínas, moléculas de sinalização e pistas ambientais que regulam a sobrevivência e as funções das células-tronco. Este modelo é menos caro, menos demorado e mais manipulável do que os modelos animais. Os organoides também imitam o microambiente tecidual, proporcionando relevância in vivo. O presente protocolo descreve o isolamento de criptas colônicas, incorporando essas células de cripta isoladas em um sistema de matriz de gel tridimensional e cultivando células de cripta para formar organoides colônicos capazes de auto-organização, proliferação, auto-renovação e diferenciação. Este modelo permite manipular o ambiente - nocauteando proteínas específicas, como a claudina-7, ativando/desativando vias de sinalização, etc. - para estudar como esses efeitos influenciam o funcionamento das células-tronco colônicas. Especificamente, o papel da proteína claudina-7 de junção apertada na função das células-tronco colônicas foi examinado. Claudin-7 é vital para manter a homeostase intestinal e função de barreira e integridade. O knockout da claudina-7 em camundongos induz um fenótipo semelhante à doença inflamatória intestinal, exibindo inflamação intestinal, hiperplasia epitelial, perda de peso, ulcerações mucosas, descamação de células epiteliais e adenomas. Anteriormente, foi relatado que a claudina-7 é necessária para as funções das células-tronco epiteliais intestinais no intestino delgado. Neste protocolo, um sistema de cultura organoide colônica é estabelecido para estudar o papel da claudina-7 no intestino grosso.

Introdução

A cultura organoide intestinal é um sistema tridimensional (3D) ex vivo no qual as células-tronco são isoladas das criptas intestinais do tecido primário e plaqueadas em uma matriz de gel ^1,2. Essas células-tronco são capazes de auto-renovação, auto-organização e funcionalidade de órgãos². Os organoides imitam o microambiente tecidual e são mais semelhantes aos modelos in vivo do que os modelos de cultura celular in vitro bidimensionais (2D), embora menos manipuláveis que as células ^3,4. Esse modelo elimina obstáculos encontrados em modelos 2D, como a falta de aderências célula-célula adequadas, interações célula-matriz e populações homogêneas, e também reduz as limitações dos modelos animais, incluindo altos custos e longos períodos de tempo⁵. Os organoides intestinais - também conhecidos como colonóides para aqueles cultivados a partir de células-tronco derivadas de criptas colônicas - são essencialmente mini-órgãos que contêm um epitélio, incluindo todos os tipos de células que estariam presentes in vivo, bem como um lúmen. Esse modelo permite a manipulação do sistema para estudar diversos aspectos do intestino, como o nicho de células-tronco, a fisiologia intestinal, a fisiopatologia e a morfogênese intestinal ^3,5,6. Também fornece um ótimo modelo para a descoberta de medicamentos, estudando distúrbios intestinais humanos, como doença inflamatória intestinal (DII) e câncer colorretal, desenvolvimento de tratamento personalizado específico do paciente e estudo da regeneração tecidual 4,7,8,9. Além disso, o sistema organoide também pode ser utilizado para estudar a comunicação celular, o metabolismo de fármacos, a viabilidade, a proliferação e a resposta a estímulos ^7,8. Embora os modelos animais possam ser usados para testar potenciais terapêuticas para condições patológicas intestinais, eles são bastante limitados, pois o estudo de várias drogas ao mesmo tempo representa um desafio. Há mais variáveis de confusão in vivo, e o custo e o tempo associados são altos e longos, respectivamente. Por outro lado, o sistema de cultura de organoides permite a triagem de muitas terapêuticas de uma só vez em um período de tempo mais curto e também permite o tratamento personalizado por meio do uso de cultura organoide derivada do paciente ^4,8. A capacidade dos organoides colônicos de imitar a organização, o microambiente e a funcionalidade dos tecidos também os torna um excelente modelo para o estudo da regeneração e do reparo tecidual⁹. Nosso laboratório estabeleceu um sistema de cultura organoide do intestino delgado para estudar o efeito da claudina-7 nas funções das células-tronco do intestino delgado¹⁰. Neste estudo, um sistema de cultura de organoides do intestino grosso é estabelecido para estudar a capacidade, ou a falta de habilidade, das células-tronco de se auto-renovarem, diferenciarem e proliferarem em um modelo condicional de nocaute de claudina-7 (cKO).

A Claudin-7 é uma proteína de junção apertada (TJ) muito importante, altamente expressa no intestino e essencial para a manutenção da função e integridade do TJ¹¹. Camundongos cKO sofrem de fenótipo semelhante ao da DII, exibindo inflamação grave, ulcerações, descamação de células epiteliais, adenomas e aumento dos níveis de citocinas^11,12. Embora seja amplamente aceito que os claudins são vitais para a função de barreira epitelial, novos papéis para os claudins estão surgindo; estão envolvidos na proliferação, migração, progressão do câncer e função das células-tronco 10,12,13,14,15,16,17. Atualmente, não se sabe como a claudina-7 afeta o nicho de células-tronco e a função das células-tronco colônicas. Como o intestino se auto-renova rapidamente aproximadamente a cada 5-7 dias, a manutenção do nicho de células-tronco e o bom funcionamento das células-tronco ativas são vitais¹⁸. Aqui, um sistema é estabelecido para examinar os potenciais efeitos regulatórios da claudina-7 no nicho de células-tronco colônicas.

Protocolo

Todos os experimentos e procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da East Carolina University (ECU) e conduzidos em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e ECU sobre cuidados e uso de animais de laboratório. Camundongos knockout induzíveis e específicos do intestino foram gerados pelo cruzamento de camundongos transgênicos C57BL6 claudin-7-flox com camundongos Villin-CreERT2¹⁹. Camundongos machos e fêmeas com idade de 3 meses foram utilizados neste estudo.

1. Preparação do reagente/equipamento

1. Arrefecer os seguintes reagentes/equipamentos antes de iniciar as suas experiências associadas: solução salina tamponada com fosfato (PBS) para lavagem do tecido do cólon durante o isolamento da cripta; um balancim/rotador (colocado num frigorífico de 4 °C) para incubação com meio de dissociação epitelial.
   1. Remover a matriz de gel (ver Tabela de Materiais) de -20 °C e descongelar no gelo antes do revestimento.
   2. Pré-arrefecer a centrífuga a 4 °C antes de girar criptas para revestimento.
   3. Arrefecer o tampão de citrato de sódio a 0,1% (ver Tabela de Materiais) e manter no gelo antes da deteção da morte celular in situ .
2. Aquecer os seguintes reagentes antes de iniciar seus experimentos associados: uma placa de cultura de 96 poços por 24 h antes do revestimento; Mídia L-WRN (consulte Tabela de Materiais) antes de adicionar às criptas chapeadas e antes de cada alteração de mídia.
   1. Aqueça o banho-maria a 94 °C antes de colorir.

2. Isolamento de cripta colônica murina

1. Prepare a mídia necessária seguindo os passos abaixo.
   NOTA: Os volumes de mídia são calculados aqui para o tecido colônico de dois camundongos.
   1. Preparar meios de dissociação epitelial: 30 mL de 1x PBS + 400 μL de 0,5 M EDTA + 50 μL de 10 mM de dicloridrato Y-27632 de 10 mM (ver Tabela de Materiais). Mantenha no gelo até o uso.
   2. Preparar meios de dissociação de cripta: 10 mL de 1x PBS + 10 μL de 10 mM de dicloridrato Y-27632. Mantenha no gelo até o uso.
   3. Suplemento L-WRN meio: 50 mL de L-WRN meio + 47,5 mL de DMEM glicose elevada com L-Glutamina + 500 μL de L-glutamina + 500 μL de pennicilina/estreptomicina + 1.000 μL de suplemento B-27 (50x) + 500 μL de suplemento N2 (100x) + 50 μL de solução tampão HEPES (1 M) (ver Tabela de Materiais).
   4. Filtrar o meio L-WRN completo (suplementado) e a alíquota para armazenamento a -20 °C por até 3 meses.
      NOTA: O meio descongelado é estável a 4 °C até 2 semanas.
2. Execute o isolamento da cripta.
   1. Para anestesia geral, adicione 1 mL de isoflurano ao algodão e coloque-o dentro de um de plástico dentro de uma câmara de anestesia de 0,09 pés cúbicos (ver Tabela de Materiais). Coloque o rato na câmara de anestesia até que a respiração pare (aproximadamente 3-5 min) e, em seguida, realize a luxação cervical²⁰.
   2. Faça uma incisão de aproximadamente 2 na linha média do rato, prendendo a pele das costas para expor o abdômen. Isolar o cólon cortando logo abaixo do ceco do lado proximal e acima do reto do lado distal²¹.
   3. Usando fórceps, remova o tecido adiposo ligado ao cólon. Empurre suavemente as fezes para fora utilizando a extremidade plana da pinça e corte o tecido aberto longitudinalmente.
   4. Lave o tecido 10-15 vezes com PBS frio 1x usando pinça para "girar" o tecido em torno de PBS entre as lavagens.
   5. Usando uma tesoura limpa e afiada, corte o tecido em pequenos pedaços, com aproximadamente 3-5 mm de tamanho.
   6. Repetir o processo para o segundo ratinho e combinar os pedaços de tecido num tubo de 50 ml contendo meios de dissociação epitelial fria (passo 2.1.1).
   7. Incubar os pedaços de tecido do cólon em meio de dissociação epitelial por 90 min a 4 °C com balanço suave.
   8. Permita que os fragmentos de tecido afundem no fundo do tubo e, em seguida, descarte cuidadosamente o meio de dissociação epitelial sem interromper o tecido. Repita este processo ao lavar o tecido 10-15 vezes com PBS frio 1x. Descarte o máximo de PBS possível durante a lavagem final.
   9. Adicionar meio de dissociação de cripta (passo 2.1.2) ao tubo de 50 ml contendo pedaços de tecido do cólon e agitar continuamente durante 5-10 min à mão.
      NOTA: A mídia deve ficar turva das criptas dissociadas.
   10. Sob o exaustor de cultura celular, filtre o tecido e o meio com um filtro de células de nylon de 70 μm (ver Tabela de Materiais) em um tubo fresco de 50 mL.
   11. Centrifugar a 200 x g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante sem perturbar o pellet que contém cripta.
       NOTA: Dependendo do equipamento, pode-se transferir o meio tenso para um tubo de 15 mL para centrifugação.
   12. Ressuscite o pellet em ~3-4 mL de PBS frio 1x.
   13. Pipeta 10 μL das criptas isoladas em uma linha em uma lâmina de microscópio. Sob o microscópio, conte o número de criptas longas e cheias para estimar a concentração de criptas por 10 μL.
   14. Calcule o volume apropriado de criptas para girar para baixo, a fim de chapar 10 criptas / μL em uma placa de 96 poços.

3. Revestimento de criptas

1. Centrifugar um volume apropriado de criptas isoladas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 200 x g por 5 min a 4 °C.
2. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de 1.000 μL sem interromper as criptas peletizadas.
3. Adicione 100 μL de matriz de gel (o suficiente para nove poços) às criptas e pipetas peletizadas cuidadosamente para evitar a introdução de bolhas de ar.
   NOTA: Consulte a seção Discussão para obter uma descrição detalhada de como misturar a matriz de gel e criptas. Normalmente, 100 μL são suficientes para nove poços.
4. Deixe a matriz de gel solidificar parcialmente (~1-2 min).
5. Placa de 10 μL da matriz de gel misturada com as criptas em cada poço de uma placa de cultura pré-aquecida de 96 poços para formar uma forma de cúpula.
   NOTA: Coloque a cúpula no centro do poço. Tenha cuidado para não permitir que a matriz de gel se espalhe para os lados do poço. Consulte a seção Discussão para obter uma descrição detalhada sobre solidificação e chapeamento.
6. Deixe a matriz de gel ser totalmente ajustada por 10-20 min em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
7. Preparar a solução de trabalho final da mídia L-WRN.
   1. Adicionar 100 μL de penniilina/estreptomicina a uma alíquota de 10 ml de L-WRN (ver passo 2.1.3) (estável durante 2 semanas a 4 °C).
   2. Adicionar suplementos a 900 μL de L-WRN com pennicilina/estreptomicina: 0,9 μL de 1 mg/mL de EGF + 0,9 μL de 10 mM de dicloridrato Y-27632.
      NOTA: Os volumes são baseados em nove poços. O dicloridrato Y-27632 só é adicionado no dia 0 (no momento do chapeamento).
8. Adicione 100 μL de mídia a cada poço. Tenha cuidado para não atrapalhar a cúpula.
9. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ durante 24 h.

4. Criando nocaute de claudin-7 na cultura

1. Permita que as criptas cresçam normalmente em cultura por 24 horas após o revestimento.
2. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 2,7 μL de 4-hidroxitamoxifeno (4OH-Tamoxifeno) a 900 μL de meio L-WRN (concentração final de 3 μmol/L) + 0,9 μL de EGF de 1 mg/mL.
   NOTA: A solução-mãe de 4OH-Tamoxifeno é preparada misturando 4OH-Tamoxifeno em pó (ver Tabela de Materiais) com 1x PBS a uma concentração de 1 mmol / L.
3. Remova os meios antigos dos poços através de sucção a vácuo.
4. Adicionar 100 μL de meios contendo 4OH-tamoxifeno a cada alvéolo e rotulá-los como claudina-7 cKO/4OH-TAM.
   NOTA: DMSO precisa ser adicionado aos poços de controle. Meios frescos contendo 4OH-tamoxifeno devem ser adicionados a cada 2 dias.
5. Incubar a 37 °C até à próxima mudança do meio (~2-3 dias).

5. Manutenção de organoides colônicos

NOTA: A mídia deve ser alterada a cada 2-3 dias. Cultura até 12 dias.

1. Preparar uma nova solução de trabalho final de meio L-WRN: 900 μL de meio L-WRN + 0,9 μL de 1 mg/mL de EGF.
2. Remova os meios antigos dos poços através de sucção a vácuo. Adicione mídia fresca aos poços.
   NOTA: Tenha cuidado para não interromper a cúpula.
3. Incubar a 37 °C até à próxima mudança do meio.
   NOTA: As culturas podem ser mantidas e passadas durante a duração desejada para o experimento. As culturas para o presente estudo foram tipicamente mantidas entre 9-12 dias, mas pode-se desejar continuar por mais tempo, por 15 ou 20 dias.

6. Colheita e incorporação de organoides colônicos

1. Remova os meios antigos dos poços através de sucção a vácuo.
2. Fixar os organoides com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 1 h à temperatura ambiente.
   NOTA: O PFA é um material tóxico. Tome precauções ao usar este reagente.
3. Retirar 4% de PFA dos poços por sucção a vácuo e adicionar 30% de sacarose por 24 h a 4 °C.
4. Rotule um molde de plástico e encha-o a 90% com composto de temperatura de corte ideal (OCT) (consulte Tabela de Materiais).
5. Remova 30% de sacarose dos poços através de sucção a vácuo. Adicione 10 μL de 1x PBS a cada poço.
6. Com uma ponta de pipeta, risque suavemente o fundo do poço para dissociar a cúpula que contém organoides.
7. Com uma pipeta, remova o PBS que contém os organoides dissociados e carregue o líquido no molde contendo OCT.
   NOTA: Evite introduzir bolhas no composto OCT.
8. Continue este processo até que todos os organoides tenham sido removidos de todos os poços.
9. Num balão Dewar de aço inoxidável, adicionar pellets de gelo seco e 2-metilbutano (suficiente para cobrir os pellets de gelo seco) (ver Tabela de Materiais).
10. Segure firmemente o bloco OCT contendo organoides acima do 2-metilbutano para congelar rapidamente.
11. Conservar o bloco OCT contendo organoides a -80 °C até estar pronto para a secção (pode ser conservado até 1 ano).

7. Imunofluorescência

1. Secção do bloco OCT contendo organoides a uma espessura de 5 μm utilizando um criostato (ver Tabela de Materiais) a -20 °C.
2. Para cada seção, verifique sob o microscópio para garantir que um organoide foi capturado. Quando o corte estiver concluído, armazene as lâminas a -80 °C até que estejam prontas para manchar (podem ser armazenadas por até 6 meses).
3. Aquecer as lâminas em tampão de citrato de sódio a 10 mM durante 10 minutos a 94 °C.
   NOTA: O tampão é feito pela dissolução do citrato de sódio em água deionizada. Ajuste o pH para 6 com ácido clorídrico.
4. Deixe os slides esfriarem na bancada por 20 minutos. Enxaguar com água destilada por 5 min.
5. Monte as lâminas em um rack de coloração (ver Tabela de Materiais) com Triton X-100 a 0,2% e incube com glicina 100 mM por 15 min.
6. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 5 min cada. Bloco com albumina sérica bovina (BSA) a 5% por 45 min à temperatura ambiente.
7. Incubar com claudina-7 anticorpo primário²² anti-coelho murino (diluído em 1% de BSA) durante a noite a 4 °C. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 10 min cada.
8. Incubar com o anticorpo secundário Cy3 anti-coelho²³ (diluído em 1% de BSA) durante 1 h à temperatura ambiente. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 10 min cada.
9. Monte as lâminas com um meio de montagem apropriado (consulte Tabela de materiais) com DAPI e adicione uma folha de cobertura.

8. Detecção de morte celular

1. Fixe os organoides dentro dos poços com paraformaldeído a 4% por 1 h à temperatura ambiente. Enxaguar com 1x PBS por 5 min.
2. Incubar a placa de cultura sobre gelo com Triton X-100 a 0,1% em tampão frio de citrato de sódio a 0,1% por 2 min. Enxaguar duas vezes com 1x PBS por 5 min cada.
3. Preparar a reação TUNEL^24,25 utilizando TMR Red^, um kit de deteção de morte celular in situ(ver Tabela de Materiais). Adicionar 50 μL de reagentes de reação TUNEL a cada poço.
4. Incubar numa atmosfera humidificada durante 1 h a 37 °C no escuro.
   NOTA: Todas as etapas restantes devem ser concluídas no escuro.
5. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 5 min cada. Incubar com 1:2.500 Hoechst (diluído em 1x PBS, ver Tabela de Materiais) durante 3 min.
6. Enxaguar três vezes com 1x PBS por 5 min cada. Utilize o filtro TRITC para visualizar imagens em um microscópio fluorescente (consulte Tabela de materiais).

Resultados

A fim de examinar os efeitos regulatórios da claudina-7 sobre as células-tronco do cólon, criptas colônicas foram isoladas do tecido do cólon murino, conforme descrito acima e mostrado na Figura 1A. Uma vez que as criptas foram isoladas do tecido primário, elas foram revestidas em uma matriz 3D em uma placa de 96 poços para crescer por 11 dias (Figura 1). Criptas saudáveis normais fecharão o lúmen e se tornarão esferoides no dia 2 e, eventualmente, co...

Discussão

A cultura organoide é um excelente modelo para o estudo da função das células-tronco, fisiologia intestinal, descoberta de medicamentos, doenças intestinais humanas e regeneração e reparo tecidual ^{7,8,9,10,11,26}. Embora tenha muitas vantagens, pode ser um desafio estabelecer. Deve-se ter cuidado em todas as etapas ao l...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator	United States Plastic Corp	78564	anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
15 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco	14190-144
2-methylbutane	Sigma	277258
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)	Sigma	579002
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm nylon cell strainer	Corning	352350
96 well culture plate	Greiner Bio-One	655180
B-27 Supplement (50x)	Gibco	12587-010
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody	Immuno-Biological Laboratories	18875
Cover glass (24 x 50-1.5)	Fisher Scientific	12544E
Cryomolds	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02	gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody	Jackson Immunoresearch	111-165-003
Dewar Flask	Thomas Scientific	1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine	ATCC	30-2002
EVOS FLoid Imaging System	ThermoFisher	4477136
Fluoro-Gel II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Glycine	JT Baker	4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
In situ cell death detection kit, TMR Red	Roche	12156792910
Isoflurane	Pivetal	07-893-8440
L-WRN Media	Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core	N/A
Mouse surgical kit	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific	AGR1180
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Sequenza Rack	vwr	10129-584
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S-279
Sucrose	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate)	Corning	430769
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254