Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

Résumé

Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.

Résumé

L’épithélium intestinal se régénère tous les 5 à 7 jours et est contrôlé par la population de cellules souches épithéliales intestinales (IESC) située au fond de la région de la crypte. Les CSEI comprennent les cellules souches actives, qui s’auto-renouvellent et se différencient en divers types de cellules épithéliales, et les cellules souches quiescentes, qui servent de cellules souches de réserve en cas de blessure. La régénération de l’épithélium intestinal est contrôlée par les capacités d’auto-renouvellement et de différenciation de ces IESC actifs. De plus, l’équilibre de la population de cellules souches cryptiques et le maintien de la niche des cellules souches sont essentiels à la régénération intestinale. La culture organoïde est une approche importante et attrayante pour étudier les protéines, les molécules de signalisation et les signaux environnementaux qui régulent la survie et les fonctions des cellules souches. Ce modèle est moins cher, moins long et plus manipulable que les modèles animaux. Les organoïdes imitent également le microenvironnement tissulaire, fournissant une pertinence in vivo . Le présent protocole décrit l’isolement des cryptes du côlon, l’intégration de ces cellules cryptiques isolées dans un système de matrice de gel tridimensionnel et la culture de cellules cryptiques pour former des organoïdes du côlon capables d’auto-organisation, de prolifération, d’auto-renouvellement et de différenciation. Ce modèle permet de manipuler l’environnement - éliminer des protéines spécifiques telles que la claudine 7, activer / désactiver les voies de signalisation, etc. - pour étudier comment ces effets influencent le fonctionnement des cellules souches du côlon. Plus précisément, le rôle de la protéine de jonction serrée claudin-7 dans la fonction des cellules souches du côlon a été examiné. Claudin-7 est vital pour maintenir l’homéostasie intestinale et la fonction et l’intégrité de la barrière. L’élimination de la claudine-7 chez la souris induit un phénotype semblable à une maladie inflammatoire de l’intestin présentant une inflammation intestinale, une hyperplasie épithéliale, une perte de poids, des ulcérations des muqueuses, une desquamation des cellules épithéliales et des adénomes. Auparavant, il a été rapporté que la claudine-7 est nécessaire pour les fonctions des cellules souches épithéliales intestinales dans l’intestin grêle. Dans ce protocole, un système de culture organoïde du côlon est établi pour étudier le rôle de la claudine-7 dans le gros intestin.

Introduction

La culture organoïde intestinale est un système ex vivo tridimensionnel (3D) dans lequel les cellules souches sont isolées des cryptes intestinales du tissu primaire et plaquées dans une matrice de gel ^1,2. Ces cellules souches sont capables d’auto-renouvellement, d’auto-organisation et de fonctionnalité des organes². Les organoïdes imitent le microenvironnement tissulaire et sont plus semblables aux modèles in vivo qu’aux modèles de culture cellulaire in vitro bidimensionnels (2D), bien que moins manipulables que les cellules ^3,4. Ce modèle élimine les obstacles rencontrés dans les modèles 2D, tels que le manque d’adhérences cellule-cellule appropriées, les interactions cellule-matrice et les populations homogènes, et réduit également les limites des modèles animaux, y compris les coûts élevés et les longues périodes de temps⁵. Les organoïdes intestinaux - également appelés colonoïdes pour ceux cultivés à partir de cellules souches dérivées de cryptes du côlon - sont essentiellement des mini-organes qui contiennent un épithélium comprenant tous les types de cellules qui seraient présentes in vivo, ainsi qu’une lumière. Ce modèle permet de manipuler le système pour étudier de nombreux aspects de l’intestin, tels que la niche des cellules souches, la physiologie intestinale, la physiopathologie et la morphogenèse intestinale ^3,5,6. Il fournit également un excellent modèle pour la découverte de médicaments, l’étude des troubles intestinaux humains tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et le cancer colorectal, le développement de traitements personnalisés spécifiques au patient et l’étude de la régénération tissulaire 4,7,8,9. En outre, le système organoïde peut également être utilisé pour étudier la communication cellulaire, le métabolisme des médicaments, la viabilité, la prolifération et la réponse aux stimuli ^7,8. Bien que des modèles animaux puissent être utilisés pour tester des traitements potentiels pour les affections pathologiques intestinales, ils sont assez limités, car l’étude de plusieurs médicaments à la fois pose un défi. Il y a plus de variables confondantes in vivo, et le coût et le temps associés sont respectivement élevés et longs. D’autre part, le système de culture organoïde permet le criblage de nombreux produits thérapeutiques à la fois dans un laps de temps plus court et permet également un traitement personnalisé grâce à l’utilisation de cultures organoïdes dérivées du patient ^4,8. La capacité des organoïdes du côlon à imiter l’organisation, le microenvironnement et la fonctionnalité des tissus en fait également un excellent modèle pour étudier la régénération et la réparation des tissus⁹. Notre laboratoire a mis en place un système de culture organoïde de l’intestin grêle pour étudier l’effet de la claudine-7 sur les fonctions des cellules souches de l’intestin grêle¹⁰. Dans cette étude, un système de culture organoïde intestinal de grande taille est établi pour étudier la capacité, ou l’absence de capacité, des cellules souches à s’auto-renouveler, à se différencier et à proliférer dans un modèle conditionnel de claudin-7 knockout (cKO).

La claudine-7 est une protéine de jonction serrée (TJ) très importante qui est fortement exprimée dans l’intestin et est essentielle au maintien de la fonction et de l’intégrité de TJ¹¹. Les souris cKO souffrent d’un phénotype de type MII, présentant une inflammation sévère, des ulcérations, une desquamation des cellules épithéliales, des adénomes et une augmentation des taux de cytokines^11,12. Bien qu’il soit largement admis que les claudines sont vitales pour la fonction de barrière épithéliale, de nouveaux rôles pour les claudines émergent; Ils sont impliqués dans la prolifération, la migration, la progression du cancer et la fonction des cellules souches 10,12,13,14,15,16,17. On ignore actuellement comment la claudine-7 affecte la niche des cellules souches et la fonction des cellules souches du côlon. Comme l’intestin s’auto-renouvelle rapidement environ tous les 5 à 7 jours, le maintien de la niche des cellules souches et le bon fonctionnement des cellules souches actives sont essentiels¹⁸. Ici, un système est établi pour examiner les effets régulateurs potentiels de la claudine-7 sur la niche des cellules souches du côlon.

Protocole

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline de l’Est (ECU) et menées conformément aux directives des National Institutes of Health et de l’ECU sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris knockout claudin-7 inductibles et intestinales spécifiques ont été générées en croisant des souris transgéniques claudin-7-flox C57BL6 avec des souris Villin-CreERT2¹⁹. Des souris mâles et femelles âgées de 3 mois ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation du réactif/équipement

1. Refroidir les réactifs/équipements suivants avant de commencer leurs expériences associées : solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour laver les tissus du côlon pendant l’isolement de la crypte; une bascule/rotateur (placer dans un réfrigérateur à 4 °C) pour l’incubation avec un milieu de dissociation épithéliale.
   1. Retirer la matrice de gel (voir le tableau des matières) à -20 °C et décongeler sur la glace avant le placage.
   2. Prérefroidissez la centrifugeuse à 4 °C avant de faire tourner les cryptes pour le placage.
   3. Refroidir le tampon de citrate de sodium à 0,1 % (voir le tableau des matières) et le conserver sur la glace avant la détection in situ de la mort cellulaire.
2. Réchauffer les réactifs suivants avant de commencer leurs expériences associées : une plaque de culture de 96 puits pendant 24 h avant le placage ; Supports L-WRN (voir Tableau des matériaux) avant d’ajouter aux cryptes plaquées et avant chaque changement de support.
   1. Chauffer le bain-marie à 94 °C avant de le colorer.

2. Isolement de la crypte colique murine

1. Préparez le support nécessaire en suivant les étapes ci-dessous.
   REMARQUE: Les volumes de milieux sont calculés ici pour le tissu colique de deux souris.
   1. Préparer les milieux de dissociation épithéliale : 30 mL de 1x PBS + 400 μL de 0,5 M EDTA + 50 μL de 10 mM de chlorhydrate Y-27632 (voir le tableau des matières). Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
   2. Préparer les milieux de dissociation cryptique : 10 mL de 1x PBS + 10 μL de 10 mM de chlorhydrate Y-27632. Conserver sur la glace jusqu’à utilisation.
   3. Supplément L-WRN : 50 mL de milieu L-WRN + 47,5 mL de DMEM à haute teneur en glucose avec de la L-glutamine + 500 μL de L-glutamine + 500 μL de penniciline/streptomycine + 1 000 μL de supplément de B-27 (50x) + 500 μL de supplément de N2 (100x) + 50 μL de solution tampon HEPES (1 M) (voir Tableau des matières).
   4. Filtrer le milieu L-WRN complet (supplémenté) et l’aliquote pour le stockage à -20 °C pendant 3 mois maximum.
      REMARQUE: Les milieux décongelés sont stables à 4 ° C jusqu’à 2 semaines.
2. Effectuez l’isolation de crypte.
   1. Pour l’anesthésie générale, ajouter 1 mL d’isoflurane au coton et le placer dans une cassette en plastique dans une chambre d’anesthésie de 0,09 pied cube (voir Tableau des matériaux). Placez la souris dans la chambre d’anesthésie jusqu’à ce que la respiration s’arrête (environ 3-5 minutes), puis effectuez une luxation cervicale²⁰.
   2. Faites une incision d’environ 2 pouces le long de la ligne médiane de la souris, en épinglant la peau du dos pour exposer l’abdomen. Isoler le côlon en coupant juste en dessous du caecum du côté proximal et au-dessus du rectum du côté distal²¹.
   3. À l’aide d’une pince, retirez le tissu adipeux attaché au côlon. Poussez doucement les matières fécales à l’aide de l’extrémité plate de la pince et coupez le tissu ouvert longitudinalement.
   4. Lavez le mouchoir 10-15 fois avec 1x PBS froid en utilisant des forceps pour « tourbillonner » le tissu dans PBS entre les lavages.
   5. À l’aide de ciseaux propres et tranchants, coupez le tissu en petits morceaux d’environ 3 à 5 mm.
   6. Répéter le processus pour la deuxième souris et combiner les morceaux de tissu dans un tube de 50 mL contenant un milieu de dissociation épithéliale froid (étape 2.1.1).
   7. Incuber les morceaux de tissu du côlon dans un milieu de dissociation épithéliale pendant 90 min à 4 °C en berçant doucement.
   8. Laissez les fragments de tissu couler au fond du tube, puis jetez soigneusement le milieu de dissociation épithéliale sans perturber le tissu. Répétez ce processus lors du lavage du mouchoir 10-15 fois avec froid 1x PBS. Jetez autant de PBS que possible pendant le lavage final.
   9. Ajouter le milieu de dissociation cryptique (étape 2.1.2) au tube de 50 mL contenant des morceaux de tissu du côlon et agiter continuellement pendant 5 à 10 minutes à la main.
      REMARQUE: Les médias doivent devenir nuageux à partir des cryptes dissociées.
   10. Sous la hotte de culture cellulaire, filtrer les tissus et le milieu à l’aide d’une crépine à cellules en nylon de 70 μm (voir le tableau des matériaux) dans un nouveau tube de 50 ml.
   11. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant sans perturber la pastille contenant la crypte.
       REMARQUE: Selon l’équipement, on peut transférer le fluide filtré dans un tube de 15 mL pour centrifugation.
   12. Remettez la pastille en suspension dans ~3-4 mL de 1x PBS froid.
   13. Pipette 10 μL des cryptes isolées dans une ligne sur une lame de microscope. Au microscope, comptez le nombre de cryptes longues et pleines pour estimer la concentration de cryptes par 10 μL.
   14. Calculez le volume approprié de cryptes à faire tourner afin de plaquer 10 cryptes/μL dans une plaque de 96 puits.

3. Cryptage

1. Centrifuger un volume approprié de cryptes isolées dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
2. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 μL sans perturber les cryptes granulées.
3. Ajouter 100 μL de matrice de gel (assez pour neuf puits) aux cryptes granulées et pipette soigneusement pour éviter d’introduire des bulles d’air.
   REMARQUE: Voir la section Discussion pour une description détaillée de la façon de mélanger la matrice de gel et les cryptes. En règle générale, 100 μL est suffisant pour neuf puits.
4. Laisser la matrice de gel se solidifier partiellement (~1-2 min).
5. Plaque 10 μL de la matrice de gel mélangée aux cryptes dans chaque puits d’une plaque de culture préchauffée de 96 puits pour former une forme de dôme.
   REMARQUE: Placez le dôme au centre du puits. Veillez à ne pas laisser la matrice de gel se propager sur les côtés du puits. Voir la section Discussion pour une description détaillée de la solidification et du placage.
6. Laisser la matrice de gel être complètement réglée pendant 10-20 min dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂.
7. Préparer la solution de travail finale du média L-WRN.
   1. Ajouter 100 μL de penniciline/streptomycine à une partie aliquote de 10 mL de milieu L-WRN (voir étape 2.1.3) (stable pendant 2 semaines à 4 °C).
   2. Ajouter des suppléments à 900 μL de milieu L-WRN avec de la péniciline/streptomycine : 0,9 μL de 1 mg/mL d’EGF + 0,9 μL de 10 mM de dichlorhydrate Y-27632.
      NOTE: Les volumes sont basés sur neuf puits. Le dichlorhydrate Y-27632 n’est ajouté que le jour 0 (au moment du placage).
8. Ajouter 100 μL de média à chaque puits. Veillez à ne pas perturber le dôme.
9. Incuber à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 24 h.

4. Créer Claudin-7 knockout dans la culture

1. Laissez les cryptes pousser normalement en culture pendant 24 h après le placage.
2. Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, ajouter 2,7 μL de 1 mmol/L de 4-hydroxytamoxifène (4OH-tamoxifène) à 900 μL de milieu L-WRN (concentration finale de 3 μmol/L) + 0,9 μL de 1 mg/mL d’EGF.
   NOTE: La solution mère de 4OH-Tamoxifène est préparée en mélangeant du 4OH-Tamoxifène en poudre (voir le tableau des matières) avec 1x PBS à une concentration de 1 mmol/L.
3. Retirez les vieux supports des puits par aspiration sous vide.
4. Ajouter 100 μL de milieu contenant du 4OH-tamoxifène à chaque puits et étiqueter comme claudin-7 cKO/4OH-TAM.
   REMARQUE: DMSO doit être ajouté aux puits de contrôle. Des milieux frais contenant du 4OH-tamoxifène doivent être ajoutés tous les 2 jours.
5. Incuber à 37 °C jusqu’au prochain changement de média (~2-3 jours).

5. Entretien organoïde du côlon

REMARQUE: Le support doit être changé tous les 2-3 jours. Culture jusqu’à 12 jours.

1. Préparer une nouvelle solution de travail finale de milieu L-WRN : 900 μL de milieu L-WRN + 0,9 μL de 1 mg/mL d’EGF.
2. Retirez les vieux supports des puits par aspiration sous vide. Ajouter des produits frais aux puits.
   REMARQUE: Veillez à ne pas perturber le dôme.
3. Incuber à 37 °C jusqu’au prochain changement de média.
   NOTE: Les cultures peuvent être maintenues et passées pendant la durée souhaitée pour l’expérience. Les cultures pour la présente étude ont généralement été maintenues entre 9 et 12 jours, mais on peut souhaiter continuer plus loin, pendant 15 ou 20 jours.

6. Récolte et intégration des organoïdes du côlon

1. Retirez les vieux supports des puits par aspiration sous vide.
2. Fixer les organoïdes avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 h à température ambiante.
   REMARQUE : Le PFA est une matière toxique. Prenez des précautions lors de l’utilisation de ce réactif.
3. Retirer 4 % de PFA des puits par aspiration sous vide et ajouter 30 % de saccharose pendant 24 h à 4 °C.
4. Étiquetez un moule en plastique et remplissez-le à 90 % avec un composé à température de coupe optimale (OCT) (voir le tableau des matériaux).
5. Retirer 30% de saccharose des puits par aspiration sous vide. Ajouter 10 μL de 1x PBS à chaque puits.
6. À l’aide d’une pointe de pipette, gratter délicatement le fond du puits pour dissocier le dôme contenant les organoïdes.
7. À l’aide d’une pipette, retirez le PBS contenant les organoïdes dissociés et chargez le liquide dans le moule contenant de l’OCT.
   REMARQUE: Évitez d’introduire des bulles dans le composé OCT.
8. Continuez ce processus jusqu’à ce que tous les organoïdes aient été retirés de tous les puits.
9. Dans une fiole Dewar en acier inoxydable, ajouter des pastilles de glace carbonique et du 2-méthylbutane (assez pour couvrir les pastilles de glace carbonique) (voir le tableau des matières).
10. Maintenez régulièrement le bloc OCT contenant des organoïdes au-dessus du 2-méthylbutane pour qu’il soit congelé.
11. Conserver le bloc OCT contenant des organoïdes à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être sectionné (peut être conservé jusqu’à 1 an).

7. Immunofluorescence

1. Couper le bloc OCT contenant des organoïdes à une épaisseur de 5 μm à l’aide d’un cryostat (voir tableau des matières) à -20 °C.
2. Pour chaque section, vérifier au microscope pour s’assurer qu’un organoïde a été capturé. Lorsque la section est terminée, conserver les lames à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être tachées (peuvent être conservées jusqu’à 6 mois).
3. Chauffer les lames dans un tampon de citrate de sodium de 10 mM pendant 10 min à 94 °C.
   NOTE: Le tampon est fabriqué en dissolvant le citrate de sodium dans de l’eau désionisée. Ajuster le pH à 6 avec de l’acide chlorhydrique.
4. Laissez les toboggans refroidir sur la paillasse pendant 20 min. Rincer à l’eau distillée pendant 5 min.
5. Assembler les lames dans une grille de coloration (voir tableau des matériaux) avec 0,2% de Triton X-100 et incuber avec 100 mM de glycine pendant 15 min.
6. Rincer trois fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun. Bloquer avec 5% d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 45 min à température ambiante.
7. Incuber avec l’anticorps primaire 22 antimurin²² de lapin claudin-7 (dilué dans 1% BSA) pendant une nuit à 4 °C. Rincer trois fois avec 1x PBS pendant 10 min chacun.
8. Incuber avec l’anticorps secondaire anti-lapin^{Cy3 23} (dilué dans 1% BSA) pendant 1 h à température ambiante. Rincer trois fois avec 1x PBS pendant 10 min chacun.
9. Montez les glissières avec un support de montage approprié (voir Tableau des matériaux) avec DAPI et ajoutez une lamelle de couverture.

8. Détection de la mort cellulaire

1. Fixer les organoïdes à l’intérieur des puits avec 4% de paraformaldéhyde pendant 1 h à température ambiante. Rincer avec 1x PBS pendant 5 min.
2. Incuber la plaque de culture sur glace avec du Triton X-100 à 0,1 % dans un tampon froid de citrate de sodium à 0,1 % pendant 2 min. Rincer deux fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun.
3. Préparer la réaction TUNEL^24,25 à l’aide de TMR Red^, un kit de détection de la mort cellulaire in situ(voir le tableau des matériaux). Ajouter 50 μL de réactifs réactionnels TUNEL à chaque puits.
4. Incuber dans une atmosphère humidifiée pendant 1 h à 37 °C dans l’obscurité.
   REMARQUE: Toutes les étapes restantes doivent être effectuées dans l’obscurité.
5. Rincer trois fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun. Incuber avec 1:2 500 Hoechst (dilué dans 1x PBS, voir le tableau des matériaux) pendant 3 min.
6. Rincer trois fois avec 1x PBS pendant 5 min chacun. Utilisez le filtre TRITC pour visualiser des images sur un microscope fluorescent (voir Tableau des matériaux).

Résultats

Afin d’examiner les effets régulateurs de la claudine-7 sur les cellules souches du côlon, des cryptes du côlon ont été isolées à partir de tissu murin du côlon, comme décrit ci-dessus et illustré à la figure 1A. Une fois les cryptes isolées du tissu primaire, elles ont été plaquées dans une matrice 3D dans une plaque de 96 puits pour croître pendant 11 jours (Figure 1). Les cryptes saines normales fermeront la lumière et deviendront des sphé...

Discussion

La culture organoïde est un excellent modèle pour étudier la fonction des cellules souches, la physiologie intestinale, la découverte de médicaments, les maladies intestinales humaines et la régénération et la réparation des tissus 7,8,9,10,11,26. Bien qu’il présente de nombreux avantages, il peut être difficile ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator	United States Plastic Corp	78564	anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
15 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco	14190-144
2-methylbutane	Sigma	277258
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)	Sigma	579002
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm nylon cell strainer	Corning	352350
96 well culture plate	Greiner Bio-One	655180
B-27 Supplement (50x)	Gibco	12587-010
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody	Immuno-Biological Laboratories	18875
Cover glass (24 x 50-1.5)	Fisher Scientific	12544E
Cryomolds	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02	gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody	Jackson Immunoresearch	111-165-003
Dewar Flask	Thomas Scientific	1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine	ATCC	30-2002
EVOS FLoid Imaging System	ThermoFisher	4477136
Fluoro-Gel II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Glycine	JT Baker	4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
In situ cell death detection kit, TMR Red	Roche	12156792910
Isoflurane	Pivetal	07-893-8440
L-WRN Media	Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core	N/A
Mouse surgical kit	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific	AGR1180
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Sequenza Rack	vwr	10129-584
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S-279
Sucrose	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate)	Corning	430769
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254