Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

Résumé

Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.

Résumé

L’épithélium intestinal se régénère tous les 5 à 7 jours et est contrôlé par la population de cellules souches épithéliales intestinales (IESC) située au fond de la région de la crypte. Les CSEI comprennent les cellules souches actives, qui s’auto-renouvellent et se différencient en divers types de cellules épithéliales, et les cellules souches quiescentes, qui servent de cellules souches de réserve en cas de blessure. La régénération de l’épithélium intestinal est contrôlée par les capacités d’auto-renouvellement et de différenciation de ces IESC actifs. De plus, l’équilibre de la population de cellules souches cryptiques et le maintien de la niche des cellules souches sont essentiels à la régénération intestinale. La culture organoïde est une approche importante et attrayante pour étudier les protéines, les molécules de signalisation et les signaux environnementaux qui régulent la survie et les fonctions des cellules souches. Ce modèle est moins cher, moins long et plus manipulable que les modèles animaux. Les organoïdes imitent également le microenvironnement tissulaire, fournissant une pertinence in vivo . Le présent protocole décrit l’isolement des cryptes du côlon, l’intégration de ces cellules cryptiques isolées dans un système de matrice de gel tridimensionnel et la culture de cellules cryptiques pour former des organoïdes du côlon capables d’auto-organisation, de prolifération, d’auto-renouvellement et de différenciation. Ce modèle permet de manipuler l’environnement - éliminer des protéines spécifiques telles que la claudine 7, activer / désactiver les voies de signalisation, etc. - pour étudier comment ces effets influencent le fonctionnement des cellules souches du côlon. Plus précisément, le rôle de la protéine de jonction serrée claudin-7 dans la fonction des cellules souches du côlon a été examiné. Claudin-7 est vital pour maintenir l’homéostasie intestinale et la fonction et l’intégrité de la barrière. L’élimination de la claudine-7 chez la souris induit un phénotype semblable à une maladie inflammatoire de l’intestin présentant une inflammation intestinale, une hyperplasie épithéliale, une perte de poids, des ulcérations des muqueuses, une desquamation des cellules épithéliales et des adénomes. Auparavant, il a été rapporté que la claudine-7 est nécessaire pour les fonctions des cellules souches épithéliales intestinales dans l’intestin grêle. Dans ce protocole, un système de culture organoïde du côlon est établi pour étudier le rôle de la claudine-7 dans le gros intestin.

Introduction

La culture organoïde intestinale est un système ex vivo tridimensionnel (3D) dans lequel les cellules souches sont isolées des cryptes intestinales du tissu primaire et plaquées dans une matrice de gel ^1,2. Ces cellules souches sont capables d’auto-renouvellement, d’auto-organisation et de fonctionnalité des organes². Les organoïdes imitent le microenvironnement tissulaire et sont plus semblables aux modèles in vivo qu’aux modèles de culture cellulaire in vitro bidimensionnels (2D), bien que moins manipulables que les cellules ^3,4<....

Protocole

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline de l’Est (ECU) et menées conformément aux directives des National Institutes of Health et de l’ECU sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris knockout claudin-7 inductibles et intestinales spécifiques ont été générées en croisant des souris transgéniques claudin-7-flox C57BL6 avec des souris Villin-CreERT2¹⁹. Des souris mâles et femelles âgées de 3 mois ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation du réactif/équipement

Résultats

Afin d’examiner les effets régulateurs de la claudine-7 sur les cellules souches du côlon, des cryptes du côlon ont été isolées à partir de tissu murin du côlon, comme décrit ci-dessus et illustré à la figure 1A. Une fois les cryptes isolées du tissu primaire, elles ont été plaquées dans une matrice 3D dans une plaque de 96 puits pour croître pendant 11 jours (Figure 1). Les cryptes saines normales fermeront la lumière et deviendront des sphé.......

Discussion

La culture organoïde est un excellent modèle pour étudier la fonction des cellules souches, la physiologie intestinale, la découverte de médicaments, les maladies intestinales humaines et la régénération et la réparation des tissus 7,8,9,10,11,26. Bien qu’il présente de nombreux avantages, il peut être difficile .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator	United States Plastic Corp	78564	anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
15 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco	14190-144
2-methylbutane	Sigma	277258
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)	Sigma	579002
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm nylon cell strainer	Corning	352350
96 well culture plate	Greiner Bio-One	655180
B-27 Supplement (50x)	Gibco	12587-010
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody	Immuno-Biological Laboratories	18875
Cover glass (24 x 50-1.5)	Fisher Scientific	12544E
Cryomolds	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02	gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody	Jackson Immunoresearch	111-165-003
Dewar Flask	Thomas Scientific	1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine	ATCC	30-2002
EVOS FLoid Imaging System	ThermoFisher	4477136
Fluoro-Gel II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Glycine	JT Baker	4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
In situ cell death detection kit, TMR Red	Roche	12156792910
Isoflurane	Pivetal	07-893-8440
L-WRN Media	Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core	N/A
Mouse surgical kit	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific	AGR1180
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Sequenza Rack	vwr	10129-584
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S-279
Sucrose	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate)	Corning	430769
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254