心内注射人前列腺癌细胞以创建骨转移异种移植小鼠模型

摘要

在这里，我们提出了一种用于心内注射人前列腺癌细胞的方案，以生成具有骨转移病变的小鼠模型。

摘要

作为最常见的男性恶性肿瘤，前列腺癌（PC）的死亡率排名第二，主要是由于65%-75%的骨转移率。因此，了解前列腺癌骨转移的过程和相关机制对于开发新的治疗方法至关重要。为此，骨转移的动物模型是必不可少的工具。在这里，我们报告了通过心内注射前列腺癌细胞 来 生成骨转移小鼠模型的详细程序。生物发光成像系统可以确定前列腺癌细胞是否已准确注射到心脏中并监测癌细胞转移，因为它在监测转移性病变发展方面具有很大的优势。该模型复制播散癌细胞的自然发育，在骨骼中形成微转移，并模仿前列腺癌骨转移的病理过程。为进一步探索本病的分子机制和 体内 治疗效果提供了有效的工具。

引言

前列腺癌是112个国家中男性最常见的癌症，在人类发展指数^{较高的国家中}排名第二1^，2。前列腺癌患者的死亡大多是由转移引起的，约65%-75%的病例会发生骨转移^3，4。因此，迫切需要预防和治疗前列腺癌骨转移，以改善前列腺癌患者的临床结果。骨转移动物模型是探索前列腺癌骨转移各阶段涉及的多阶段过程和分子机制，从而确定治疗靶点和开发新疗法不可或缺^{的工具5。}

生成前列腺癌骨转移实验动物模型的最常见方法包括原位、骨干内（如胫骨内）和心内注射前列腺癌细胞。原位注射的骨转移模型是通过将前列腺癌细胞直接注射^到小鼠的前列腺中而生成的6^，7。该实验动物模型与前列腺癌骨转移具有非常相似的临床特征。然而，转移主要发生在腋窝淋巴结和肺，^{而不是骨8，9}。前列腺癌的胫内注射模型直接将前列腺癌细胞注射到胫骨中，骨（胫骨）肿瘤形成率高^10，

研究方案

6至8周龄雄性BALB / c无胸腺小鼠（n = 10）在12小时光照/黑暗循环条件下，在无特异性（SPF）动物室中单独通风的小鼠笼子（5只小鼠/笼）中，自由获得SPF饲料和无菌水。小鼠在实验前适应性喂养一周。所有动物实验均经上海中医药大学动物福利委员会批准。

1. 细胞制备

1. 在前列腺癌细胞注射当天，用预冷无菌PBS（pH 7.4）洗涤在10cm细胞培养皿中培养的80%-90%汇合荧光素酶标记的PC-3细胞（PC-3-荧光素酶）。用 1.5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶胰蛋白酶消化 3 分钟，并在用含有 10% 血清的 6 mL F-12 培养基淬灭胰蛋白酶后将细胞收集到 15 mL 离心管中。
   注意：PC-3-荧光素酶细胞系在转染pLV-荧光素酶载体¹⁵后来源于PC-3细胞系。
2. 使用自动细胞计数仪，通过将20μL细胞悬液转移到细胞计数板上来计算细胞浓度（参见 材料表）。
3. 在室温（RT）下以800× g 离心细胞5分钟。
4. 使用移液管弃去上清液并将细胞沉淀重悬于F-12培养基中（参见 材料表），最终细胞密度为1 x 10⁷ 个细胞/ mL。
5. 始终将细胞保持在冰上，直到注射。
....

结果

生物发光成像在监测心内注射模型的转移性病变发展方面具有巨大的优势。癌细胞注射后不久（24小时内），使用生物发光成像来可视化进入一般循环的癌细胞（图3A）。当癌细胞被正确注射到动脉循环中时，全身都会看到明显的生物发光信号。来自仅在注射部位（心脏）显示生物发光信号的小鼠数据应从最终数据收集中排除。细胞注射后2周观察到后肢的转移性病变（

讨论

心内注射人前列腺癌细胞产生骨转移是探索前列腺癌骨转移的功能和机制以及评价治疗效果的理想小鼠模型。研究表明，骨损伤最有可能发生在胫骨近端和股骨远端¹⁷，这可能是由于它们的高血管化和代谢活性。

由于骨转移是乳腺癌患者中经常观察到的转移性病变，因此通过心内注射乳腺癌细胞产生的骨转移模型也常用于乳腺癌研究^18?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes and needles	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	For counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning
EDTA solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1105	For decalcification of bone tissure
F-12 medium	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	21700075, GIBCO	Cell culture medium
Formalin solution	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	BL539A	For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	For anesthesia
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027, Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	TCHu 158	Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid for transfection
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80	Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd	Scanco Medical AG,Switzerland	For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.