Внутрисердечная инъекция клеток рака предстательной железы человека для создания мышиной модели ксенотрансплантата с метастазами в кости

Резюме

Здесь мы представляем протокол внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы человека для создания мышиной модели с поражениями метастазов в кости.

Аннотация

Как наиболее распространенное мужское злокачественное новообразование, рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место по смертности, в первую очередь из-за частоты метастазирования в кости 65-75%. Поэтому важно понимать процесс и связанные с ним механизмы метастазирования рака предстательной железы в кости для разработки новых терапевтических средств. Для этого животная модель метастазирования в кости является важным инструментом. Здесь мы сообщаем о подробных процедурах создания модели мышей с метастазами в кости с помощью внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы. Система биолюминесцентной визуализации может определить, были ли клетки рака предстательной железы точно введены в сердце, и контролировать метастазирование раковых клеток, поскольку она имеет большие преимущества в мониторинге развития метастатического поражения. Эта модель воспроизводит естественное развитие диссеминированных раковых клеток с образованием микрометастазов в кости и имитирует патологический процесс метастазирования рака предстательной железы в кости. Он предоставляет эффективный инструмент для дальнейшего изучения молекулярных механизмов и терапевтических эффектов этого заболевания in vivo .

Введение

Рак предстательной железы является наиболее частым онкологическим заболеванием у мужчин в 112 странах и занимает второе место по смертности в странах с более высоким индексом человеческого развития ^1,2. Большинство смертей у пациентов с раком предстательной железы вызваны метастазированием, и примерно в 65-75% случаев развиваются метастазы в кости ^3,4. Поэтому профилактика и лечение метастазов рака предстательной железы в кости крайне необходимы для улучшения клинического исхода пациентов с раком предстательной железы. Животная модель метастазирования в кости является незаменимым инструментом для изучения многоступенчатого процесса и молекулярных механизмов, участвующих в каждой стадии метастазирования в кости рака предстательной железы, что позволяет определить терапевтические цели и разработать новые терапевтические средства⁵.

Наиболее распространенные методы создания экспериментальных животных моделей метастазов рака предстательной железы в кости включают ортотопические, внутридиафизионные (например, внутрибольшеберцовые) и внутрисердечные инъекции клеток рака предстательной железы. Модель метастазирования в кости с ортотопической инъекцией генерируется путем прямой инъекции клеток рака предстательной железы в предстательную железу мыши ^6,7. Эта экспериментальная модель на животных имеет очень похожие клинические характеристики на метастазы в кости рака предстательной железы. Однако метастазирование в основном происходит в подмышечных лимфатических узлах и легких, а не в кости ^8,9. Модель внутрибольшеберцовой инъекции при раке предстательной железы непосредственно вводит клетки рака предстательной железы в большеберцовую кость с высокой скоростью образования опухоли в кости (большеберцовой кости)^10,11; Однако кора костей и полость костного мозга легко повреждаются. Кроме того, метод инъекции большеберцовой кости не может стимулировать патологический процесс метастазирования рака предстательной железы в кости, при котором раковые клетки колонизируют кость через кровообращение. Для исследования кровообращения, сосудистой экстравазации и отдаленных метастазов с более высокой скоростью метастазирования раковых клеток в кости была разработана техника внутрисердечной инъекции путем прямого введения клеток рака предстательной железы в левый желудочек мыши 8,12,13. Это делает его ценной моделью на животных для исследования метастазов^{в кости 8}. Метод внутрисердечной инъекции показывает частоту метастазирования в кости около 75%^9,14, что намного выше, чем метод ортотопической инъекции. Таким образом, внутрисердечная инъекция является идеальным методом создания животной модели с метастазами рака предстательной железы в кости.

Эта работа направлена на описание процесса создания мышиной модели метастазов рака предстательной железы в кости, позволяя читателям визуализировать создание модели. Текущая работа содержит подробные процессы, меры предосторожности и иллюстративные изображения для создания модели ксенотрансплантата метастазов в кости с помощью внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы человека у мышей с атимией. Этот метод является эффективным инструментом для дальнейшего изучения молекулярных механизмов и терапевтических эффектов метастазов рака предстательной железы в кости in vivo .

протокол

Шести-восьминедельные самцы атимических мышей BALB/c (n = 10) были размещены в индивидуально вентилируемых клетках для мышей (5 мышей/клетка) в помещении для животных без специфических патогенов (SPF) в условиях 12-часового цикла свет/темнота, со свободным доступом к корму SPF и стерильной воде. Мышей адаптивно кормили в течение недели перед экспериментами. Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по благополучию животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины.

1. Подготовка клеток

1. В день инъекции клеток рака предстательной железы дважды вымойте 80%-90% сливающиеся клетки PC-3, меченные люциферазой (PC-3-люциферазой), культивируемые в 10-сантиметровой чашке для культивирования клеток с предварительно холодным стерильным PBS (pH 7,4). Трипсинизировать в течение 3 мин с 1,5 мл 0,25% трипсина и собрать клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл после гашения трипсина 6 мл среды F-12, содержащей 10% сыворотки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия PC-3-люциферазы получена из клеточной линии PC-3 после трансфицирования вектором pLV-люциферазы¹⁵.
2. Используйте автоматический счетчик ячеек и рассчитайте концентрацию клеток, перенеся 20 мкл клеточной суспензии на планшет для подсчета клеток (см. Таблицу материалов).
3. Центрифугируйте клетки при 800 x g при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
4. С помощью пипетки откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде F-12 (см. Таблицу материалов) до конечной плотности клеток 1 x 10,7 клеток/мл.
5. Держите клетки на льду все время до инъекции.
6. Принесите клетки в операционную и завершите инъекцию клеток в течение 2 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дополнительные клеточные суспензии (обычно удвоенные объемы по мере необходимости), чтобы обеспечить точные дозы инъекций (например, чтобы избежать мертвых зон внутри шприцев).

2. Операция по внутрисердечной инъекции клеток рака предстательной железы человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический аппарат, используемый для внутрисердечной инъекции, представляет собой шприц объемом 1 мл (рис. 1). Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры до тех пор, пока животное не оправится от анестезии.

1. Держите мышь в комнате для животных с SPF. Выполняйте все процедуры с помощью стерилизованных аппаратов в асептическом шкафу.
2. Анестезируйте мышей, используя 2% изофлурана с 98% кислородом при скорости потока кислорода 2 л / мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите небольшое количество офтальмологической мази на глаза мыши, чтобы избежать сухости во время анестезии. Выполняйте всю операцию в хорошо проветриваемом помещении. Убедитесь, что мышь находится под глубоким наркозом, ущипнув пальцы мыши перед инъекцией клеток. Если реакция (например, рывок или подергивание) остается, подождите дополнительное время, пока анестезия подействует.
3. Поместите мышь в положение супона и обездвижите обе верхние конечности, перпендикулярно вытянутые от средней линии (рис. 2А).
4. Иммобилизуйте мышь от живота вниз хирургическим скотчем. Избегайте сильного надавливания и смещения внутренних органов (рис. 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание топографической анатомии (т.е. фиксация клейкой лентой) имеет важное значение, поскольку внутрисердечная инъекция слепа (т.е. точное место инъекции на сердце невидимо невооруженным глазом).
5. Продезинфицируйте кожу грудной клетки с помощью тампона с 70% этанолом.
6. Определите мечевидный отросток мыши в углублении на самом нижнем конце средней грудины, пальпируя середину передней грудной стенки. Определите яремную выемку мыши в центральном углублении на верхней границе манубриума, пальпируя вверх от середины передней грудной стенки.
7. Отметьте маркером самую нижнюю точку мечевидного отростка и яремную выемку (рис. 2А). Сделайте третью отметку посередине этих двух ориентиров и немного правее (слева от животного) прямо над сердцем в третьем межреберье.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Место инъекции находится в 1-2 мм слева от средней линии, а точка инъекции находится между третьим и четвертым ребрами мыши (рис. 2A).
8. Загрузите 200 мкл клеточной суспензии в шприц объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пузырь воздуха в шприце, как показано на рисунке 2C, чтобы убедиться, что кровь пульсирует. Клеточную суспензию перед загрузкой необходимо тщательно перемешать.
9. Вертикально введите иглу 26 G через место инъекции (рис. 2D).
10. Держите руку, держащую шприц, устойчиво на столе, или используйте другую руку, чтобы удерживать его устойчиво. Убедитесь, что длинная ось шприца перпендикулярна месту инъекции, и вставьте шприц примерно на 2 мм подкожно.
11. Ярко-красная пульсация крови видна в игольчатой втулке и/или клеточной суспензии, когда кончик иглы правильно введен в левый желудочек. Если пульсация крови незаметна, кончик иглы находится не в сердце. Втяните и замените иглу (в случае, если свертывание крови внутри иглы останавливает пульсацию крови). Вставьте иглу еще раз.
12. Вводите клетки. Вводите клеточную суспензию (100 мкл) очень медленно в течение 40-60 с и все время держите руку, держащую шприц, устойчивой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за клеточной суспензией в шприце и не вводите пузырь воздуха внутри шприца в сердце.
13. Надавите на место инъекции сухим ватным тампоном в течение 15 с, чтобы обеспечить гемостаз при втягивании иглы.
14. Верните мышь в чистую клетку и следите за животным до тех пор, пока оно полностью не оправится от наркоза.
15. Сфотографируйте мышь с помощью биолюминесцентной системы in vivo в течение 24 часов после инъекции, чтобы убедиться, что раковые клетки попали в системный кровоток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно введенные раковые клетки попадают в артериальное кровообращение через левый желудочек сердца, что видно по биолюминесцентной сигнализации, видимой по всему телу (например, см. рис. 3A).
16. Выполняйте биолюминесцентную визуализацию in vivo .
    1. Включите прибор и компьютер. Откройте программное обеспечение, когда индикатор питания на приборе и компьютере загорится, а затем откройте окно «Получение изображения ».
    2. Определите систему визуализации in vivo , подключенную к компьютеру, на панели устройства. Поместите мышь для получения изображения в камеру визуализации в положении лежа на спине. Затем закройте дверцу камеры визуализации.
    3. Задайте параметры на панели « Настройка » в окне «Получение изображения ».
       1. Установите параметры с помощью объектива > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 и Lens > Iris > F 2.8 , чтобы сделать изображения четкими.
       2. Установите канал съемки в поле «Фильтр и свет»: «Фильтр и свет» > «Фильтр > люминесценции», «Фильтр и свет > свет» > «Выкл.» и «Фильтр и свет» > интенсивности света > середине.
       3. Установите тип изображения, которое будет сделано: Image > Type > Single-Frame, Imaging > Exposure Time > 500 ms, Imaging > HDR Mode > Low GainMode. Нажмите кнопку «Получить », чтобы получить изображение.
17. Визуализируйте рост метастатического рака с помощью биолюминесценции in vivo .
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый момент времени визуализации внутрибрюшинно вводите 200 мкл субстрата люциферина мышке весом 20 г (150 мг / кг) и подождите 15 минут перед анестезией (2% изофлуран, смешанный с 98% кислородом в индукционной камере). Поместите мышь на платформу системы биолюминесцентной визуализации. Поддерживают анестезию через назальную маску с 2% изофлураном.

3. Патологоанатомическое исследование

1. Через четыре недели после инъекции клеток пожертвуйте мышь ингаляцией CO₂ , а затем вывихом шейки матки.
2. Обездвижите мышь в положении лежа на спине. Сделайте вертикальный разрез (около 6 см) от живота до грудной клетки хирургическими ножницами, чтобы обнажить и грубо исследовать все органы брюшной полости и грудной клетки на наличие раковых поражений и/или патологических изменений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутрисердечного исследования инъекции раковых клеток раковые поражения в средостении, прилегающем к сердцу, предполагают неправильно введенные раковые клетки (клетки, не введенные в левый желудочек сердца); Поэтому эти мыши не включаются в окончательный сбор данных.
3. Иссекают метастатические опухоли ножницами. Измерьте длинные диаметры (a) и короткие диаметры (b) опухоли с помощью штангенциркуля, чтобы рассчитать объем опухоли (V) по формуле V = 1/2 × a × b², и взвесьте опухоль с помощью электронных весов.
4. Фиксируют опухолевые ткани в 10% растворе формалина с последующим заделыванием в парафин. В качестве альтернативы можно заморозить опухоли в жидком азоте.
5. Иссекают кости (задние конечности, позвонки и/или ребра) с метастатическими поражениями. Зафиксируйте образец каждой мыши в пробирке объемом 50 мл, содержащей 20 мл 10% раствора формалина, в течение 24 ч после удаления кожи и мышц с последующей декальцификацией в течение 14 дней в 10% растворе ЭДТА с частой сменой буфера (каждые 3 дня).
6. Поместите образец в парафин и разделите образцы для рутинного гистологического исследования¹⁶.

Результаты

Биолюминесцентная визуализация дает огромные преимущества в мониторинге развития метастатического поражения для внутрисердечной инъекционной модели. Вскоре после инъекции раковых клеток (в течение 24 часов) биолюминесцентная визуализация использовалась для визуализации раковых кл...

Обсуждение

Внутрисердечная инъекция клеток рака предстательной железы человека для получения метастазов в кости является идеальной моделью мыши для изучения функций и механизмов метастазирования рака предстательной железы в кости и оценки терапевтической эффективности. Исследования показал?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes and needles	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	For counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning
EDTA solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1105	For decalcification of bone tissure
F-12 medium	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	21700075, GIBCO	Cell culture medium
Formalin solution	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	BL539A	For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	For anesthesia
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027, Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	TCHu 158	Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid for transfection
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80	Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd	Scanco Medical AG,Switzerland	For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.