Iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata umane per creare un modello murino di xenotrapianto di metastasi ossee

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'iniezione intra-cardiaca di cellule tumorali della prostata umane per generare un modello murino con lesioni da metastasi ossee.

Abstract

Come la neoplasia maschile più comune, il cancro alla prostata (PC) è al secondo posto nella mortalità, principalmente a causa di un tasso di metastasi ossee del 65% -75%. Pertanto, è essenziale comprendere il processo e i relativi meccanismi delle metastasi ossee del cancro alla prostata per lo sviluppo di nuove terapie. Per questo, un modello animale di metastasi ossee è uno strumento essenziale. Qui, riportiamo procedure dettagliate per generare un modello murino di metastasi ossee tramite iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata. Un sistema di imaging a bioluminescenza può determinare se le cellule tumorali della prostata sono state accuratamente iniettate nel cuore e monitorare le metastasi delle cellule tumorali poiché ha grandi vantaggi nel monitoraggio dello sviluppo della lesione metastatica. Questo modello replica lo sviluppo naturale delle cellule tumorali disseminate per formare micro-metastasi nell'osso e imita il processo patologico delle metastasi ossee del cancro alla prostata. Fornisce uno strumento efficace per ulteriori esplorazioni dei meccanismi molecolari e degli effetti terapeutici in vivo di questa malattia.

Introduzione

Il cancro alla prostata è il tumore più frequente negli uomini in 112 paesi e si colloca al secondo posto per mortalità nei paesi con un indice di sviluppo umano più elevato ^1,2. La maggior parte dei decessi nei pazienti con cancro alla prostata sono causati da metastasi e circa il 65% -75% dei casi svilupperà metastasi ossee ^3,4. Pertanto, la prevenzione e il trattamento delle metastasi ossee del cancro alla prostata sono urgentemente necessari per migliorare l'esito clinico dei pazienti con cancro alla prostata. Il modello animale di metastasi ossee è uno strumento indispensabile per esplorare il processo multistadio e i meccanismi molecolari coinvolti in ogni stadio delle metastasi ossee del cancro alla prostata, identificando così bersagli terapeutici e sviluppando nuove terapie⁵.

I metodi più comuni per generare modelli animali sperimentali di metastasi ossee del cancro alla prostata includono l'ortotopica, l'intra-diafisi (come l'iniezione intra-tibiale) e intra-cardiaca delle cellule tumorali della prostata. Il modello di metastasi ossea con iniezione ortotopica viene generato iniettando direttamente cellule tumorali della prostata nella prostata di un topo ^6,7. Questo modello animale sperimentale ha caratteristiche cliniche molto simili alle metastasi ossee del cancro alla prostata. Tuttavia, le metastasi avvengono principalmente nel linfonodo ascellare e nel polmone piuttosto che nell'osso ^8,9. Il modello di iniezione intratibiale per il cancro alla prostata inietta direttamente cellule tumorali della prostata nella tibia con un alto tasso di formazione tumorale nell'osso (tibia)^10,11; Tuttavia, la corteccia ossea e la cavità del midollo osseo sono facilmente danneggiate. Inoltre, il metodo di iniezione tibiale non può stimolare il processo patologico delle metastasi ossee del cancro alla prostata in cui le cellule tumorali colonizzano l'osso attraverso la circolazione. Per studiare la circolazione, lo stravaso vascolare e le metastasi a distanza con un più alto tasso di metastasi ossee delle cellule tumorali, è stata sviluppata una tecnica di iniezione intracardiaca iniettando direttamente le cellule tumorali della prostata nel ventricolo sinistro del topo 8,12,13. Questo lo rende un valido modello animale per la ricerca sulle metastasi ossee⁸. Il metodo di iniezione intracardiaca mostra un tasso di metastasi ossee di circa il 75%^9,14, molto più alto rispetto al metodo di iniezione ortotopica. Pertanto, l'iniezione intracardiaca è un metodo ideale per generare un modello animale con metastasi ossee del cancro alla prostata.

Questo lavoro mira a descrivere il processo di creazione di un modello murino di metastasi ossee del cancro alla prostata, consentendo ai lettori di visualizzare l'istituzione del modello. Il lavoro attuale fornisce processi dettagliati, precauzioni e immagini illustrative per generare un modello di xenotrapianto di metastasi ossee tramite iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata umane in topi atimici. Questo metodo fornisce uno strumento efficace per esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari e gli effetti terapeutici in vivo delle metastasi ossee del cancro alla prostata.

Protocollo

Topi atimici maschi BALB/c di sei-otto settimane (n = 10) sono stati alloggiati in gabbie di topi ventilate individualmente (5 topi/gabbia) in una stanza per animali priva di agenti patogeni specifici (SPF) nelle condizioni di 12 ore di ciclo luce/buio, con libero accesso al mangime SPF e all'acqua sterile. I topi sono stati nutriti in modo adattivo per una settimana prima degli esperimenti. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato per il benessere degli animali dell'Università di Shanghai di medicina tradizionale cinese.

1. Preparazione delle cellule

1. Il giorno dell'iniezione di cellule tumorali della prostata, lavare due volte l'80% -90% di cellule PC-3 marcate con luciferasi confluente (PC-3-luciferasi) coltivate in un piatto di coltura cellulare da 10 cm con PBS sterile pre-freddo (pH 7,4). Tripsinizzare per 3 minuti con 1,5 ml di tripsina allo 0,25% e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml dopo aver spento la tripsina con 6 ml di terreno F-12 contenente il 10% di siero.
   NOTA: La linea cellulare PC-3-luciferasi è derivata dalla linea cellulare PC-3 dopo essere stata trasfettata con il vettore pLV-luciferasi¹⁵.
2. Utilizzare un contatore automatico delle celle e calcolare la concentrazione della cella trasferendo 20 μL della sospensione cellulare alla piastra di conteggio delle celle (vedere Tabella dei materiali).
3. Centrifugare le celle a 800 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
4. Utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo F-12 (vedere Tabella dei materiali) fino a una densità cella finale di 1 x 10⁷ cellule/ml.
5. Tenere le cellule sempre ghiacciate fino all'iniezione.
6. Portare le cellule nella sala operatoria e terminare l'iniezione cellulare entro 2 ore.
   NOTA: Preparare sospensioni cellulari aggiuntive (di solito volumi raddoppiati secondo necessità) per garantire dosi di iniezione accurate (ad esempio, per evitare gli spazi morti all'interno delle siringhe).

2. Chirurgia per iniezione intracardiaca delle cellule tumorali della prostata umana

NOTA: L'apparato chirurgico utilizzato per l'iniezione intracardiaca è una siringa da 1 mL (Figura 1). Fornire supporto termico durante tutta la procedura fino al recupero dell'animale dall'anestesia.

1. Tieni il mouse nella stanza degli animali SPF. Eseguire tutte le procedure con apparecchi sterilizzati all'interno di un armadio asettico.
2. Anestetizzare il topo usando isoflurano al 2% con ossigeno al 98% sotto una portata di ossigeno di 2 L/min.
   NOTA: Spalmare una piccola quantità di unguento oftalmico sugli occhi del topo per evitare secchezza durante l'anestesia. Eseguire l'intero intervento chirurgico in un'area ben ventilata. Assicurarsi che il topo sia profondamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi del topo prima dell'iniezione cellulare. Se le risposte (ad esempio, uno scatto o una contrazione) rimangono, attendere ulteriore tempo affinché l'anestesia abbia effetto.
3. Posizionare il topo in posizione supone e immobilizzare entrambi gli arti superiori perpendicolarmente distesi lontano dalla linea mediana (Figura 2A).
4. Immobilizzare il mouse dall'addome in giù con nastro adesivo chirurgico. Evitare di premere con forza e spostare gli organi interni (Figura 2B).
   NOTA: Mantenere l'anatomia topografica (cioè il fissaggio con nastro adesivo) è essenziale poiché l'iniezione intracardiaca è cieca (cioè, il sito di iniezione accurato sul cuore è invisibile ad occhio nudo).
5. Disinfettare la pelle del torace con un tampone etanolo al 70%.
6. Identificare il processo xifoideo del topo nella depressione all'estremità più bassa dello sterno medio palpando lungo il centro della parete toracica anteriore. Identificare la tacca giugulare del topo nella depressione centrale sul bordo superiore del manubrio palpando dal centro della parete toracica anteriore.
7. Etichettare il punto più inferiore del processo xifoideo e la tacca giugulare con un pennarello (Figura 2A). Fai un terzo segno nel mezzo di questi due punti di riferimento e leggermente a destra (a sinistra dell'animale) appena sopra il cuore nel terzo spazio intercostale.
   NOTA: Il sito di iniezione si trova a sinistra di 1-2 mm rispetto alla linea mediana e il punto di iniezione si trova tra la terza e la quarta costola del topo (Figura 2A).
8. Caricare 200 μL della sospensione cellulare in una siringa da 1 ml.
   NOTA: Tenere una bolla d'aria nella siringa, come mostrato nella Figura 2C, per assicurarsi che il sangue pulsi. La sospensione cellulare deve essere accuratamente miscelata prima del caricamento.
9. Inserire verticalmente un ago da 26 G attraverso il sito di iniezione (Figura 2D).
10. Tenere la mano che tiene la siringa stabile sul tavolo, o usare l'altra mano per tenerla stabile. Assicurarsi che l'asse lungo della siringa sia perpendicolare al sito di iniezione e inserire la siringa di circa 2 mm per via sottocutanea.
11. La pulsazione del sangue rosso vivo è visibile nel mozzo dell'ago e/o nella sospensione cellulare quando la punta dell'ago viene inserita correttamente nel ventricolo sinistro. Se la pulsazione del sangue è invisibile, la punta dell'ago non è nel cuore. Ritrarre e sostituire l'ago (nel caso in cui la coagulazione del sangue all'interno dell'ago interrompa la pulsazione del sangue). Inserire nuovamente l'ago.
12. Iniettare le cellule. Iniettare la sospensione cellulare (100 μL) molto lentamente nell'arco di 40-60 s e mantenere la mano che tiene la siringa stabile per tutto il tempo.
    NOTA: Tenere d'occhio la sospensione cellulare nella siringa e non iniettare la bolla d'aria all'interno della siringa nel cuore.
13. Applicare pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone asciutto per 15 s per garantire l'emostasi quando l'ago è retratto.
14. Riportare il mouse nella gabbia pulita e monitorare l'animale fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia.
15. Immagina il topo con un sistema di bioluminescenza in vivo entro 24 ore dall'iniezione per garantire che le cellule tumorali siano entrate nella circolazione sistemica.
    NOTA: Le cellule tumorali correttamente iniettate entrano nella circolazione arteriosa attraverso il ventricolo cardiaco sinistro, che è visibile dalla segnalazione di bioluminescenza visibile su tutto il corpo (ad esempio, vedere Figura 3A).
16. Eseguire l'imaging a bioluminescenza in vivo.
    1. Accendere lo strumento e il computer. Aprire il software quando l'indicatore di alimentazione dello strumento e del computer si illumina, quindi aprire la finestra Acquisizione immagini .
    2. Identificare il sistema di imaging in vivo collegato al computer nel riquadro dei dispositivi. Posizionare il mouse da visualizzare nella camera di imaging in posizione supina. Quindi chiudere lo sportello della camera di imaging.
    3. Impostare i parametri nel riquadro Impostazioni fornito nella finestra Acquisizione immagini .
       1. Imposta i parametri con Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 e Lens > Iris > F 2.8 per rendere chiare le immagini.
       2. Impostare il canale di ripresa in Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF e Filter&Light > Light Intensity > Middle.
       3. Impostare il tipo di immagine da scattare: Imaging > Type > Single-Frame, Imaging > Tempo di esposizione > 500 ms, Imaging > HDR Mode > Low GainMode. Fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire l'immagine.
17. Visualizza la crescita metastatica del cancro con bioluminescenza in vivo .
    NOTA: In ogni punto temporale della visualizzazione, iniettare per via intraperitoneale 200 μL del substrato di luciferina in un topo da 20 g (150 mg/kg) e attendere 15 minuti prima dell'anestesia (isoflurano al 2% miscelato con ossigeno al 98% in una camera di induzione). Posizionare il mouse sulla piattaforma del sistema di imaging a bioluminescenza. Mantenere l'anestesia attraverso una maschera nasale con isoflurano al 2%.

3. Indagine patologica

1. Quattro settimane dopo l'iniezione cellulare, sacrificare il topo per inalazione di CO₂ e poi dislocazione cervicale.
2. Immobilizzare il mouse in posizione supina. Fare un'incisione verticale (circa 6 cm) dall'addome al torace con forbici chirurgiche per esporre ed esaminare grossolanamente tutti gli organi dell'addome e del torace per lesioni cancerose e / o alterazioni patologiche.
   NOTA: Per uno studio di iniezione intra-cardiaca di cellule tumorali, le lesioni tumorali nel mediastino adiacente al cuore suggeriscono cellule tumorali iniettate in modo errato (cellule non iniettate nel ventricolo cardiaco sinistro); Pertanto, questi topi non sono inclusi nella raccolta dati finale.
3. Eliminare i tumori metastatici con le forbici. Misurare i diametri lunghi (a) e i diametri corti (b) del tumore usando calibri per calcolare il volume del tumore (V) usando la formula V = 1/2 × a × b² e pesare il tumore usando una bilancia elettronica.
4. Fissare i tessuti tumorali in una soluzione di formalina al 10% seguita dall'incorporazione in paraffina. In alternativa, congelare i tumori in azoto liquido.
5. Asportare le ossa (arti posteriori, vertebre e/o costole) con lesioni metastatiche. Fissare il campione di ciascun topo in una provetta da 50 mL contenente 20 ml di soluzione di formalina al 10% per 24 ore dopo aver rimosso la pelle e i muscoli, seguita da decalcificazione per 14 giorni in soluzione di EDTA al 10% con frequenti cambi di tampone (ogni 3 giorni).
6. Incorporare il campione in paraffina e sezionare i campioni per l'esame istologico di routine¹⁶.

Risultati

L'imaging a bioluminescenza offre enormi vantaggi nel monitoraggio dello sviluppo della lesione metastatica per un modello di iniezione intracardiaca. Subito dopo l'iniezione di cellule tumorali (entro 24 ore), è stata utilizzata la bioluminescenza per visualizzare le cellule tumorali che entrano nella circolazione generale (Figura 3A). L'evidente segnalazione di bioluminescenza su tutto il corpo sarà visibile quando le cellule tumorali vengono iniettate correttamente nella circolazione ar...

Discussione

L'iniezione intracardiaca di cellule tumorali della prostata umane per generare metastasi ossee è un modello murino ideale per esplorare le funzioni e i meccanismi delle metastasi ossee del cancro alla prostata e valutare l'efficacia terapeutica. Gli studi hanno dimostrato che il danno osseo si verifica molto probabilmente nella tibia prossimale e nel femore distale¹⁷, che può essere dovuto alla loro elevata vascolarizzazione e attività metabolica.

Poiché la metasta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes and needles	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	For counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning
EDTA solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1105	For decalcification of bone tissure
F-12 medium	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	21700075, GIBCO	Cell culture medium
Formalin solution	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	BL539A	For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	For anesthesia
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027, Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	TCHu 158	Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid for transfection
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80	Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd	Scanco Medical AG,Switzerland	For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.