인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 통해 뼈 전이 이종이식 마우스 모델 생성

요약

여기서, 본 발명자들은 골전이 병변이 있는 마우스 모델을 생성하기 위해 인간 전립선암 세포의 심장내 주사를 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

가장 흔한 남성 악성 종양인 전립선암(PC)은 주로 65%-75%의 뼈 전이율로 인해 사망률 2위를 차지합니다. 따라서 새로운 치료제 개발을 위해서는 전립선암 골전이의 과정 및 관련 기전을 이해하는 것이 필수적이다. 이를 위해서는 뼈 전이의 동물 모델이 필수적인 도구입니다. 여기에서는 전립선암 세포의 심장 내 주사를 통해 뼈 전이 마우스 모델을 생성하는 자세한 절차를 보고합니다. 생물발광 이미징 시스템은 전립선암 세포가 심장에 정확하게 주입되었는지 여부를 확인하고 전이성 병변 발달을 모니터링하는 데 큰 이점이 있기 때문에 암세포 전이를 모니터링할 수 있습니다. 이 모델은 파종된 암세포의 자연적 발달을 복제하여 뼈에 미세 전이를 형성하고 전립선암 뼈 전이의 병리학적 과정을 모방합니다. 그것은 이 질병의 분자 메커니즘과 생체 내 치료 효과에 대한 추가 탐색을 위한 효과적인 도구를 제공합니다.

서문

전립선 암은 112 국가에서 남성에게 가장 흔한 암이며 인간 발달 지수가 높은 국가 ^1,2에서 사망률 ² 위를 차지했습니다. 전립선암 환자의 대부분의 사망은 전이에 의해 발생하며, 사례의 약 65%-75%는 뼈 전이가 발생합니다 ^3,4. 따라서 전립선암 환자의 임상 결과를 개선하기 위해서는 전립선암 골 전이의 예방 및 치료가 시급하다. 뼈 전이의 동물 모델은 전립선암 뼈 전이의 각 단계에 관여하는 다단계 과정과 분자 메커니즘을 탐색하여 치료 표적을 식별하고 새로운 치료법을 개발하는 데 없어서는 안될 도구입니다⁵.

전립선암 골 전이의 실험 동물 모델을 생성하는 가장 일반적인 방법은 전립선암 세포의 동소, 골내 (예: 경골내) 및 심장내 주사를 포함한다. 동소 주사를 이용한 골 전이 모델은 전립선암 세포를 마우스의 전립선에 직접 주입함으로써 생성된다 ^6,7. 이 실험 동물 모델은 전립선암 뼈 전이와 매우 유사한 임상적 특징을 가지고 있습니다. 그러나 전이는 주로 뼈보다는 겨드랑이 림프절과 폐에서 발생합니다 ^8,9. 전립선암에 대한 경골내 주사 모델은 뼈(경골)의 종양 형성률이 높은 전립선암 세포를 경골에 직접 주입합니다^10,11; 그러나 뼈 피질과 골수강은 쉽게 손상됩니다. 또한, 경골 주사 방법은 암세포가 순환을 통해 뼈를 식민지화하는 전립선암 뼈 전이의 병리학적 과정을 자극할 수 없습니다. 암세포의 골전이율이 높은 순환순환, 혈관혈관외유출, 원격전이를 조사하기 위해 전립선암세포를 마우스의 좌심실에 직접 주입하는 심장내 주사기법이 개발되었다 8,12,13. 이것은 뼈 전이 연구를 위한 귀중한 동물 모델이 된다⁸. 심장 내 주사 방법은 약 75^%의 골 전이율을 보이며^9,14 동소 주사 방법보다 훨씬 높습니다. 따라서, 심장내 주사는 전립선암 동물모델을 생성하는데 이상적인 방법이다.

이 작업은 전립선암 뼈 전이의 마우스 모델을 구축하는 과정을 설명하여 독자가 모델 설정을 시각화할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 현재 작업은 무흉선 마우스에서 인간 전립선암 세포의 심장 내 주입을 통해 뼈 전이 이종 이식 모델을 생성하기 위한 자세한 프로세스, 예방 조치 및 예시 사진을 제공합니다. 이 방법은 전립선암 골 전이의 분자 메커니즘 및 생체 내 치료 효과를 추가로 탐색하기 위한 효과적인 도구를 제공합니다.

프로토콜

6주령에서 8주령의 수컷 BALB/c 무흉선 마우스(n = 10)는 12시간 명암기 조건에서 특정 병원체가 없는(SPF) 동물실에서 개별적으로 환기되는 마우스 케이지(5마리/케이지)에 수용되었으며, SPF 사료 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있습니다. 마우스는 실험 전에 일주일 동안 적응적으로 먹이를 주었다. 모든 동물 실험은 상하이 중의과 대학 동물 복지위원회의 승인을 받았습니다.

1. 세포 준비

1. 전립선암 세포 주사 당일, 10cm 세포 배양 접시에서 배양된 80%-90% 융합성 루시페라아제 표지 PC-3 세포(PC-3-luciferase)를 사전 저온 멸균 PBS(pH 7.4)로 두 번 세척합니다. 1.5mL의 0.25% 트립신으로 3분 동안 트립신화하고, 10% 혈청을 함유한 6mL의 F-12 배지로 트립신을 퀀칭한 후 세포를 15mL 원심분리기 튜브에 수집합니다.
   참고: PC-3-루시페라아제 세포주는 pLV-루시페라아제 벡터¹⁵로 형질감염된 후 PC-3 세포주에서 유래됩니다.
2. 자동 세포 계수기를 사용하고 20μL의 세포 현탁액을 세포 계수 플레이트에 옮겨 세포 농도를 계산합니다( 재료 표 참조).
3. 실온(RT)에서 800 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
4. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 F-12 배지( 재료 표 참조)에서 세포 펠릿을 1 x 10⁷ cells/mL의 최종 세포 밀도로 재현탁합니다.
5. 주사 할 때까지 세포를 항상 얼음 위에 보관하십시오.
6. 세포를 수술실로 가져와 2시간 이내에 세포 주입을 마칩니다.
   참고: 정확한 주사 용량을 보장하기 위해 추가 세포 현탁액(일반적으로 필요에 따라 부피를 두 배로 늘림)을 준비합니다(예:ample, 주사기 내부의 데드 스페이스를 피하기 위해).

2. 인간 전립선암 세포의 심장내 주사 수술

참고: 심장 내 주사에 사용되는 수술 장치는 1mL 주사기입니다(그림 1). 동물이 마취에서 회복 될 때까지 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공하십시오.

1. 마우스를 SPF 동물 방에 보관하십시오. 무균 캐비닛 내에서 멸균 된 장치로 모든 절차를 수행하십시오.
2. 2L/min 산소 유량에서 98% 산소와 함께 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다.
   참고: 마취 중 건조를 피하기 위해 소량의 안과용 연고를 마우스의 눈에 바르십시오. 환기가 잘되는 곳에서 전체 수술을 수행하십시오. 세포 주입 전에 마우스의 발가락을 꼬집어 마우스가 깊게 마취되었는지 확인하십시오. 반응(예: 경련 또는 경련)이 남아 있으면 마취가 효과를 발휘할 때까지 추가 시간을 기다리십시오.
3. 마우스를 상부 위치에 놓고 정중선에서 수직으로 뻗은 양쪽 상지를 고정시킵니다(그림 2A).
4. 수술용 접착 테이프로 복부에서 아래로 마우스를 고정합니다. 세게 누르거나 내부 장기를 옮기지 마십시오(그림 2B).
   참고: 심장 내 주사는 블라인드(즉, 심장의 정확한 주사 부위가 육안으로 보이지 않음)이기 때문에 지형 해부학적 구조를 유지하는 것(즉, 접착 테이프로 고정)이 필수적입니다.
5. 70 % 에탄올 면봉으로 흉부의 피부를 소독하십시오.
6. 전방 흉벽의 중앙을 촉지하여 흉골 중간의 가장 낮은 끝에 있는 함몰부에서 마우스 검상돌기 과정을 식별합니다. 전방 흉벽의 중앙에서 위로 촉진하여 manubrium의 위쪽 경계에 있는 중앙 함몰부에 있는 마우스 경정맥 노치를 식별합니다.
7. xiphoid process와 jugular notch의 가장 열등한 지점을 마커 펜으로 표시하십시오 (그림 2A). 이 두 랜드 마크의 중간에 세 번째 표시를 만들고 세 번째 늑간 공간에서 심장 바로 위에 약간 오른쪽 (동물의 왼쪽)을 만듭니다.
   참고: 주사 부위는 정중선에서 1-2mm 왼쪽에 있고 주사 지점은 마우스의 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이에 있습니다(그림 2A).
8. 세포 현탁액 200μL를 1mL 주사기에 넣습니다.
   알림: 그림 2C와 같이 주사기에 기포를 유지하여 혈액이 맥동하는지 확인합니다. 로딩 전에 세포 현탁액을 완전히 혼합해야 합니다.
9. 주사 부위를 통해 26G 바늘을 수직으로 삽입합니다(그림 2D).
10. 주사기를 잡고 있는 손을 테이블 위에 안정적으로 유지하거나 다른 손으로 안정적으로 잡습니다. 주사기의 장축이 주사 부위에 수직인지 확인하고 주사기를 약 2mm 피하에 삽입합니다.
11. 바늘 끝이 좌심실에 올바르게 삽입되면 바늘 허브 및/또는 세포 현탁액에서 밝은 적혈구 맥동을 볼 수 있습니다. 혈액 맥동이 보이지 않으면 바늘 끝이 심장에 있지 않습니다. 바늘을 집어 넣고 교체하십시오 (바늘 내부의 혈액 응고가 혈액 맥동을 멈추는 경우). 바늘을 다시 한 번 삽입하십시오.
12. 세포를 주입하십시오. 세포 현탁액(100μL)을 40-60초에 걸쳐 매우 천천히 주입하고 주사기를 잡고 있는 손을 항상 안정적으로 유지합니다.
    알림: 주사기의 세포 현탁액을 면밀히 주시하고 주사기 내부의 기포를 심장에 주입하지 마십시오.
13. 마른 면봉으로 주사 부위에 15초 동안 압력을 가하여 바늘을 집어넣을 때 지혈을 보장합니다.
14. 마우스를 깨끗한 케이지로 돌려 보내고 마취에서 완전히 회복 될 때까지 동물을 모니터링하십시오.
15. 암세포가 전신 순환계에 들어갔는지 확인하기 위해 주사 후 24시간 이내에 생체 내 생물발광 시스템으로 마우스를 이미지화합니다.
    참고: 올바르게 주입된 암세포는 좌심실을 통해 동맥 순환으로 들어가며, 이는 몸 전체에서 볼 수 있는 생체발광 신호로 볼 수 있습니다(예:ample, 그림 3A 참조).
16. 생체 내 생물발광 이미징을 수행합니다.
    1. 악기와 컴퓨터를 켭니다. 측량기와 컴퓨터의 전원 표시등이 밝아지면 소프트웨어를 열고 이미지 획득 창을 엽니다.
    2. 장치 창에서 컴퓨터에 연결된 생체 내 이미징 시스템을 식별합니다. 이미징할 마우스를 앙와위 자세로 이미징 챔버에 놓습니다. 그런 다음 이미징 챔버의 문을 닫습니다.
    3. Image Acquisition 창에 제공된 Setting 창에서 파라미터를 설정합니다.
       1. 렌즈 > 줌 > 1x, 렌즈 > 초점 > 108, 렌즈 > 아이리스 > F 2.8 로 매개변수를 설정하여 이미지를 선명하게 만듭니다.
       2. Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF, Filter&Light > Light Intensity > Middle에서 촬영 채널을 설정합니다.
       3. 촬영할 이미지 유형을 설정합니다: 이미징 > 유형 > 단일 프레임, 이미징 > 노출 시간 > 500ms, 이미징 > HDR 모드 > 낮은 게인 모드. 획득 버튼을 클릭하여 이미지를 획득합니다.
17. 생체 내 생물발광으로 전이성 암 성장을 시각화합니다.
    참고: 시각화의 각 시점에서 200μL의 루시페린 기질을 20g 마우스(150mg/kg)에 복강내 주입하고 마취 전에 15분 동안 기다립니다(유도 챔버에서 2% 산소와 혼합된 98% 이소플루란). 생물발광 이미징 시스템 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 2 % isoflurane이 함유 된 비강 마스크를 통해 마취를 유지하십시오.

3. 병리학적 조사

1. 세포 주입 4주 후, 마우스를_CO2 흡입 후 자궁경부 탈구에 의해 희생시켰다.
2. 마우스를 앙와위 자세로 고정시킵니다. 수술용 가위로 복부에서 흉부까지 수직 절개(약 6cm)하여 복부와 흉부의 모든 장기를 노출시키고 암성 병변 및/또는 병리학적 변화가 있는지 육안적으로 검사합니다.
   참고: 심장내 암 세포 주입 연구의 경우 심장에 인접한 종격동의 암 병변은 잘못 주입된 암세포(좌심실에 주입되지 않은 세포)를 시사합니다. 따라서 이러한 마우스는 최종 데이터 수집에 포함되지 않습니다.
3. 가위로 전이성 종양을 절제하십시오. 캘리퍼스를 사용하여 종양의 장경(a)과 단경(b)을 측정하여 공식 V = 1/2 × a × b²를 사용하여 종양 부피(V)를 계산하고 전자 저울을 사용하여 종양의 무게를 잰다.
4. 종양 조직을 10% 포르말린 용액에 고정한 후 파라핀에 포매합니다. 또는 액체 질소에서 종양을 급속 동결합니다.
5. 전이성 병변이 있는 뼈(뒷다리, 척추 및/또는 갈비뼈)를 절제합니다. 각 마우스의 검체를 피부와 근육을 제거한 후 24시간 동안 10% 포르말린 용액 20mL가 들어 있는 50mL 튜브에 고정한 후 완충액을 자주 교체하면서 10% EDTA 용액으로 14일 동안 석회질을 제거하였다(3일마다).
6. 표본을 파라핀에 삽입하고 일상적인 조직학적 검사를 위해 샘플을 절단한다¹⁶.

결과

생물발광 이미징은 심장 내 주사 모델의 전이성 병변 발달을 모니터링하는 데 엄청난 이점을 제공합니다. 암세포 주입 직후(24시간 이내), 생체발광 이미징을 사용하여 일반 순환계로 들어가는 암세포를 시각화했습니다(그림 3A). 암세포가 동맥 순환에 적절하게 주입될 때 몸 전체에 명백한 생물발광 신호가 나타납니다. 주사 부위(심장)에서만 생물발광 신호를 나타내는 마우...

토론

골 전이를 발생시키는 인간 전립선암 세포의 심장내 주사는 전립선암 골 전이의 기능 및 메커니즘을 탐색하고 치료 효능을 평가하기 위한 이상적인 마우스 모델이다. 연구에 따르면 뼈 손상은 근위 경골과 원위 대퇴골¹⁷에서 발생할 가능성이 가장 높으며, 이는 높은 혈관 형성 및 대사 활동 때문일 수 있습니다.

뼈 전이는 유방암 환자에서 빈번하게 관찰되는...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes and needles	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	20200411	The cells were injected into the ventricles of mice
Anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R500IP	Equipment for anesthetizing mice
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	For counting cells
BALB/c athymic mice	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.	Male	6-8 week old, male mice
Bioluminescence imaging system	Shanghai Baitai Technology Co., Ltd	Vieworks	For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning
EDTA solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	G1105	For decalcification of bone tissure
F-12 medium	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	21700075, GIBCO	Cell culture medium
Formalin solution	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	BL539A	For fixing the specimen of each mouse
Isoflurane	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	VETEASY	For anesthesia
Lipofectamine 2000	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	11668027, Thermo fisher	Plasmid transfection reagent
PC-3 cell line	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	TCHu 158	Prostate cancer cell line
Phosphate-buffered saline	Beyotime Biotechnology	ST447	Wash the human osteosarcoma cells
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	For detaching the cells
Vector (pLV-luciferase)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	VL3613	Plasmid for transfection
X-ray imaging system	Brook (Beijing) Technology Co., Ltd	FX PRO	For obtaining x-ray images to detect tumor growth
μCT80	Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd	Scanco Medical AG,Switzerland	For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction,  and μCT Ray V3.4A model visualization software.