在研究细胞培养实验室中避免真菌和细菌污染的细胞培养技术和实践

摘要

该协议介绍了研究细胞培养实验室中使用的基本细胞培养技术和实践，以避免真菌和细菌污染。在细菌类别中，将特别强调防止支原体污染。

摘要

细胞培养是在受控环境中生长人类、动物和昆虫细胞或其他组织所必需的一项精细技能。该协议的目标是强调研究实验室中使用的正确技术，以防止真菌和细菌污染。特别强调避免支原体污染，这是细胞培养室的一个主要问题，因为它体积小，对用于细胞培养的大多数抗生素具有抗性。这些相同的技术可确保持续生长并保持健康的细胞。对于新的和有经验的细胞培养用户，始终如一地遵守这些最佳实践以降低污染风险非常重要。实验室应每年审查一次细胞培养最佳实践，并在需要时进行讨论或额外培训。与污染发生后进行清理相比，尽早采取行动防止污染将节省时间和金钱。通用的最佳实践可保持细胞培养的健康，从而减少不断解冻新细胞的需要，购买昂贵的细胞培养基，并减少培养箱净化和停机时间。

引言

细胞培养在研究实验室中有许多用途。自20世纪初细胞培养起源以来，细胞系一直帮助推动科学发展。细胞系有几个优点;各种细胞系可以帮助研究人员研究细胞生物学，产生杆状病毒用于进一步研究，或产生大量感兴趣的蛋白质，仅^举几例1。一些额外的用途包括研究组织生长，帮助推进疫苗开发，毒理学研究，研究基因在健康生物体和患病模型中的作用，以及杂交^{细胞系的生产}2^，3。细胞系还可以实现药物生产³。使用细胞系时，需要适当的无菌技术;本手稿中概述的实践和技术适用于进行细胞培养工作的研究实验室。其他实验室设置不讨论。

在进行细胞培养工作时，污染通常是主要关注的问题。在本文中，污染通常是指真菌和细菌。本文概述的方法的总体目标是全面描述避免污染的最佳实践。所有实验室成员在研究实验室的细胞培养室工作时都应遵守这些做法。实验室应确保所有工人积极参与使用这些最佳实践来防止污染。正确的实践和技术知识将有助于确保细胞培养物保持活力、健康和不受污染。该技术的发展基于文献研究、七年的细胞培养经验，以及对新手和经验丰富的细胞培养工作者每年都可以参考的方法的需求。

需要一种清晰、标准化的技术，所有研究细胞培养实验室都应遵循。许多关于细胞培养污染的文献讨论了支原体的检测、无菌技术、污染源、污染物的消除以及通过使用抗生素和^{定期检测进行}预防4，⁵，⁶，^7，8。虽然这些信息很有帮助，但文献中没有视频来展示应该遵循的正确细胞培养技术。与其他技术相比，所介绍的做法的优势在于专注于在污染发生之前防止污染，而不是在以后发现和纠正错误。此外，无菌技术的全面演示、关于防止真菌和细菌生长的讨论以及有关生物安全柜气流的信息对于新手和有经验的细胞培养工作者都很有价值。

细菌和真菌是两种最常见的污染物类型。在细菌类别中，支原体是一个主要问题，因为它体积小，能够增殖而不被注意。它们是自我复制的生物，没有依靠真核细胞生长的刚性细胞壁。尽管透射电子显微镜可以检测到支原体⁹，¹⁰，但它们的代谢能力降低，并且可以大量繁殖^，同时在细胞培养物的常规目视检查和定期显微镜分析中仍未被识别。此外，它们可以通过微生物过滤器¹⁰。细胞培养基为支原体提供营养，但不幸的是，用抗生素补充培养基不会影响支原体¹⁰。应该注意的是，一般来说，没有必要用抗生素补充培养基;适当的技术应该足以防止污染。支原体感染不会导致细胞立即死亡，但研究人员担心它会影响数据的可重复性和质量。

所有实验室人员应严格遵守良好的细胞培养规范。培养物应在新购买后、当前生长期间、冷冻保存前以及从液氮^2，10 解冻时检测支原体。市场上有不同的测试，使用聚合酶链反应（PCR），酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫染色。³ 文献表明，"人分离株占细胞培养中发现的支原体污染物的很大一部分"⁵。尽管已经描述了200多种支原体，但其中约6种占大多数感染。这六个物种是 M. arginini、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. oral 和 Acholeplasma laidlawii¹⁰。与其他类型的污染一样，空气和气溶胶将这些污染物带入细胞培养物⁵。这在其他论文中得到了回应，因为"人类操作员可能是实验室中最大的危险"⁷。虽然这是通过人为错误完成的，但如果遵循标准程序，则可以消除风险。人员脱落不仅限于支原体污染;一个实验室中的细胞培养物通常感染相同的支原体物种，这表明由于不正确的细胞培养技术，污染从一个烧瓶扩散到另一个烧瓶¹⁰。

防止交叉污染也是应遵循适当的细胞培养技术的另一个原因。值得注意的是，全球至少有15%-18%的细胞系可能被交叉污染或错误识别^11，12。除了测试细胞系的支原体污染外，还应测试它们的交叉污染¹⁰。对于人类细胞系，通过一种称为短串联重复（STR）分析的廉价基于DNA的技术进行细胞系鉴定是当前的国际参考标准，因为它是确认细胞系身份的简单方法²，^10，13，14。STR可以识别错误标记或交叉污染的细胞系，但不能检测不正确的组织来源¹⁰，^13，14。如果细胞系被错误标记、错误识别或污染，研究数据的有效性可能会受到损害¹³.与其他类型的污染类似，由于技术不佳导致气溶胶扩散，错误接触导致错误的细胞类型进入烧瓶，或使用相同的培养基瓶和具有不同细胞系的试剂，可能会发生交叉污染¹⁰。不应共享媒体瓶;在两个不同的细胞系之间共享一瓶培养基可以使这些细胞群混合，导致生长更快的细胞类型完全接管烧瓶。这种替换并不明显，会导致标签错误和错误识别².如果在处理或标记过程中培养物混淆，则也可能将细胞系误认为另一种细胞系¹⁰。应特别注意将试剂、培养基和培养瓶彼此分开。每个实验室成员都应该有自己的培养基瓶;实验室成员之间不应进行共享。细胞系本身应从合格的细胞库和供应商处购买。实验室不应共用细胞。研究表明，尽管经常使用STR和支原体检测，但文献中的许多研究论文已经使用了错误识别或污染的细胞系¹⁵。筛选研究以找到这些有问题的论文并追溯告知读者此事是很麻烦的。预防是确保此问题不会首先发生的最佳方法。

喷洒含有70%EtOH的物品的简单动作即可杀死生物体;70%的EtOH通过使蛋白质变性和溶解最常见的污染生物（包括细菌和真菌）中的脂质起作用¹⁶。研究表明，70%是最有效的浓度;表面蛋白不会与70%的EtOH快速凝结，因此它们可以进入细胞，而它所含的水是蛋白质变性过程所必需的。由于细胞壁两侧的水和酒精的浓度差异，70%的EtOH进入细胞使酶和结构蛋白变性。如果在烧瓶中观察到霉菌生长，则必须首先用70%EtOH喷洒并擦干整个培养箱，然后在60°C下孵育16小时过夜¹⁷。这可以杀死大多数霉菌和任何细菌。

与在污染发生后消除污染的替代技术相比，预防措施的主要优势在于，通过及早预防污染，实验室工作人员可以确保他们的细胞培养物是健康的，并且不会有与培养箱净化或丢弃细胞培养物相关的高成本。例如，消除支原体污染物后效率不高⁷.尽早花时间确保实验室人员接受适当的培训，细胞培养室是独立的，并使用标准程序将节省时间和金钱。

研究方案

1. 准备工作

1. 常规
   1. 穿着干净的实验室外套，指定仅在细胞培养室穿着，不得在实验室的其他部分穿着。
      注意:实验室外套不需要无菌。
   2. 戴上未接触任何其他表面的新手套。确保手套紧贴。丁腈、无粉手套是最好的。
      注意:手套不需要无菌。
   3. 为了准备工作，用70%的EtOH喷洒手套，实验室衣套和生物安全柜的内部。用不起毛的纸巾擦干工作表面和玻璃面板。
      注意:使用70%的EtOH以最高效率杀死细菌¹⁶。纸巾不需要无菌。
   4. 将水浴保存在细胞培养室内，仅将其用于加热培养基或解冻细胞。按照制造商的清洁说明每周排干并清洗一次水浴。
2. 生物安全柜内
   1. 限制带入机柜的物品数量。不要通过阻塞前格栅或后格栅来中断生物安全柜内的气流。
      注:有关机柜内空气流动方式的说明，请参阅 图 1 。
   2. 用70%的EtOH喷洒橱柜内的所有物品，然后擦干。首先喷洒培养基瓶的顶部并向下工作。同样，用干净的纸巾擦干，逐渐向下。不要朝盖子走回去。
   3. 如果柜子足够大，可以容纳血清移液器，则可以将它们放在里面，否则它们可以存放在安装在柜子外部的容器中。使用前检查包装中的移液器两侧是否有孔洞、撕裂或穿孔。不要撕掉包装。相反，轻轻剥开包装的末端，将血清移液器插入移液器辅助设备，然后以一个流畅的动作取下包装。
   4. 不要将鼠标悬停在打开的瓶子或烧瓶上;将手伸向打开的瓶子或烧瓶，或打开的物品放在生物安全柜中已经打开的物品的顶部。
      注意:机柜内的气流向下推到工作台面上，因此套筒上存在的任何污染物都可能进入细胞培养物。
   5. 不要倒入液体。相反，使用血清移液器添加它们。补充培养基后，彻底混合内容物并初始瓶子。此外，请确保包含媒体补充内容的标签。

2. 使用贴壁细胞系

1. 如果需要塑料烧瓶，请喷洒整个袋子并将其放入橱柜内。
2. 使用高压灭菌玻璃移液器或一次性无菌塑料移液器吸出培养基或洗涤溶液。小心地从存储容器中取下金属盖。通过以一定角度轻轻摇晃容器来隔离一个玻璃移液器。将手伸入容器时，避免触摸任何其他移液器。
   注意:仅从一端处理所选移液器。
3. 尽快快速更换瓶盖。将盖子倒置放在工作台面上，使轮辋不会接触工作台面。不要从顶部或底部抓住盖子;相反，请从侧面触摸盖子。
4. 吸入液体时，请使用位于机柜外的真空捕集瓶，放在地板上的辅助容器中。
   注意:请勿将任何液体废物扔进生物危害废物袋中，因为袋子会泄漏。在机柜内工作时会产生废物。过于频繁地将手移入和移出机柜会中断气流。将任何废物暂时留在机柜内。将其放在一边，这样就不会中断工作。
5. 每当手套变干时，请大量喷洒70%的EtOH。将双手揉搓在一起，以免手套滴湿。
6. 如果血清移液器误碰到柜子里的东西，请不要犹豫，把它扔掉。使用干净的血清移液管重新开始，而不是使用可能被污染的移液器。

4. 检查和存储细胞

1. 在将细胞放入培养箱之前，请检查它们在显微镜下的外观。如果细胞已彻底悬浮，则应观察单个细胞。
2. 不要说话、打喷嚏、咳嗽或对着培养箱重呼吸。快速打开和关闭培养箱门。将门打开的时间超过必要的时间可能会使空气中存在的污染物进入培养箱。
   注意:在细胞培养室工作时戴口罩会有所帮助，因为支原体可能存在于人口中。避免在细胞培养室使用手机，因为不建议说话。
3. 在从柜子中取出瓶子之前，确保所有瓶子上的盖子都紧闭。
4. 不使用时将细胞培养基储存在4°C的黑暗中，因为它对光敏感。
5. 细胞培养工作完成后，再次用70%EtOH喷洒柜子内部，并用纸巾擦干表面。清空生物危害垃圾袋。重复此过程，并在切换到其他细胞系时更换手套。

5. 使用悬浮细胞系

1. 对于在玻璃烧瓶中生长的悬浮细胞，请确保用70%EtOH彻底喷洒手套，然后用湿手套接触铝箔，并在将其放入柜内之前仅喷洒烧瓶的底部。
2. 取样进行细胞计数时，仅从容器中取出一个 1.5 mL 管。请勿触摸任何其他管子。将盖子倒置放在工作表面上。请勿触摸内缘。从侧面小心处理，完成后更换。
3. 小心地取下覆盖烧瓶整个颈部的双折铝箔。薄膜取下后，仅从底部处理玻璃烧瓶，请勿从颈部触摸玻璃烧瓶。使用 1 mL 血清移液管取样进行细胞计数。
4. 不要让培养基从烧瓶侧面滴落;如果是这样，请喷洒含有70%乙醇的纸巾并立即清理。
5. 在从生物安全柜中取出瓶子或烧瓶之前，确保盖子和铝箔已拧紧。

6. 细胞孵育

1. 对不同的细胞类型使用单独的培养箱，以防止不同细胞类型的交叉污染。

7. 废液收集

1. 将液体废物收集在位于柜外地板上的真空捕集瓶中，放在标有"废物"的辅助容器中。
   注意:软管连接到高效微粒吸收（HEPA）过滤器，每月更换一次。

8. 清理

1. 取出生物危害废物袋并尽快清洗玻璃烧瓶。在水槽旁保持玻璃清洗方案。有关洗涤方案，请参阅 补充文件1 。
2. 对细胞培养玻璃器皿进行高压灭菌，而不是将其送到玻璃清洗设施。将其与实验室主要区域的玻璃器皿分开。
   注意:如果玻璃擦洗不当，SF-9细胞会在烧瓶侧面留下死细胞边缘。有关高压灭菌器协议，请参阅 补充文件 1 。

9. 组织

1. 组织细胞培养室，使所有耗材都位于一个区域，从而最大限度地减少实验室成员离开房间寻找耗材的需要。
2. 将任何用于收获细胞并在之后在细胞培养中重复使用的塑料瓶标记为"仅供细胞培养使用"。将指定的细胞培养瓶用于一种特定的细胞类型。将瓶子存放在细胞培养室中，以便于取用。

10. 识别细菌、真菌和支原体污染

注意:不遵循上述工作流程会导致细菌、真菌和支原体污染。

1. 总是在开始工作之前，观察烧瓶是否有重浊度，以绒毛球的形式额外生长，以及侧面细胞的密集堆积，所有这些都是污染的指标。
   注意:有经验的眼睛可以分辨出微生物污染引起的浑浊度与实际细胞之间的差异。当细胞导致通常透明的培养基出现浑浊时，细菌污染会导致白色的严重浑浊。
   1. 通过观察介质中漂浮的圆形模糊球的外观，直观地识别霉菌污染（见 图2）。
   2. 如果培养基浑浊、白色或湍流，目视识别细菌污染（见 图2）。
   3. 通过每月进行支原体检测来识别支原体污染。一项基于 PCR 的测试指示用户取 1.5 mL 细胞样品，使用 10 μL 进行细胞计数，稀释至 0.08 x 10⁶ 个细胞/mL，旋转细胞，使用试剂盒中包含的缓冲液裂解细胞，然后最后一次旋转。将上清液与扩增一系列支原体物种的引物一起孵育。运行DNA凝胶以可视化条带。无条带意味着未鉴定支原体。
      注意:这种主要污染物可能存在于人体口腔中。在解冻细胞后和将其用于实验之前测试细胞中的支原体污染是一种很好的做法。之后，每月监测一次细胞的支原体污染。许多公司提供支原体检测试剂盒。选择一个合适的。

结果

如果不遵循本文中概述的正确细胞培养技术和实践，研究细胞培养实验室可能会受到真菌和细菌的污染。 图2 显示了悬浮液和贴壁培养物中含有污染物的培养瓶。

如果不遵循无菌技术，2-3天后可能会发生霉菌污染。悬浮细胞中漂浮在培养基中的圆形绒毛球很明显，而附着细胞中的霉菌生长可以观察到大块、不规则、白色或绿色斑块。

讨论

虽然污染是进行细胞培养工作时的主要问题之一，但本手稿中概述的实践和技术将有助于降低风险。关键步骤包括穿着干净的实验室外套，仅在细胞培养室使用，使用干净的无粉手套，这些手套经常喷洒70%EtOH，并在细胞系之间切换时更换，鼓励每个人不要共用培养基瓶，在完成工作之前和之后彻底清洁机柜， 整齐地打开血清移液器，避免长时间密切接触打开的瓶子或烧瓶，不要在多个细胞系之?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques