Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları

Özet

Bu protokol, mantar ve bakterilerin kontaminasyonunu önlemek için araştırma hücre kültürü laboratuvarında kullanılacak temel hücre kültürü tekniklerini ve uygulamalarını sunmaktadır. Bakteri kategorisinde, mikoplazma kontaminasyonunun önlenmesine özel önem verilecektir.

Özet

Hücre kültürü, kontrollü bir ortamda insan, hayvan ve böcek hücrelerini veya diğer dokuları büyütmek için gerekli olan hassas bir beceridir. Protokolün amacı, mantar ve bakterilerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için bir araştırma laboratuvarında kullanılan doğru teknikleri vurgulamaktır. Küçük boyutu ve hücre kültürü için kullanılan çoğu antibiyotiğe direnci nedeniyle hücre kültürü odasında büyük bir endişe kaynağı olan mikoplazma kontaminasyonundan kaçınmaya özel önem verilmektedir. Aynı teknikler sürekli büyümeyi sağlar ve sağlıklı hücreleri korur. Hem yeni hem de deneyimli hücre kültürü kullanıcıları için, kontaminasyon riskini azaltmak için bu en iyi uygulamalara tutarlı bir şekilde uymak önemlidir. Yılda bir kez, laboratuvarlar hücre kültürü en iyi uygulamalarını gözden geçirmeli ve gerekirse bir tartışma veya ek eğitim ile takip etmelidir. İlk etapta kontaminasyonu önlemek için erken önlem almak, kontaminasyon meydana geldikten sonra temizlemeye kıyasla zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır. Evrensel en iyi uygulamalar hücre kültürlerini sağlıklı tutar, böylece sürekli olarak yeni hücreleri çözme, pahalı hücre kültürü ortamı satın alma ve inkübatör dekontaminasyon ve arıza süresini azaltma ihtiyacını azaltır.

Giriş

Hücre kültürünün araştırma laboratuvarında birçok kullanım alanı vardır. 20. yüzyılın başlarında hücre kültürünün kökenlerinden bu yana, hücre hatları bilimin ilerlemesine yardımcı olmuştur. Hücre hatlarının birçok avantajı vardır; Çeşitli hücre hatları, araştırmacıların hücre biyolojisini incelemelerine, daha ileri çalışmalar için bakülovirüs üretmelerine veya birkaç^1'i adlandırmak için büyük miktarlarda ilgi çekici bir protein üretmelerine yardımcı olabilir. Bazı ek kullanımlar arasında doku büyümesinin incelenmesi, aşı geliştirmenin ilerlemesine yardımcı olunması, toksikoloji araştırması, sağlıklı organizmalarda ve hastalıklı modellerde genlerin rolünün incelenmesi ve hibrit hücre hatlarının üretimi^{sayılabilir 2,3}. Hücre hatları ayrıca ilaç üretimini de sağlayabilir³. Hücre hatları ile çalışırken uygun aseptik teknikler gereklidir; Bu makalede özetlenen uygulama ve teknikler, hücre kültürü çalışmalarının yapıldığı araştırma laboratuvarlarına uygulanabilir. Diğer laboratuvar ortamları tartışılmamıştır.

Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken genellikle birincil endişe kaynağıdır. Bu makale bağlamında, kontaminasyon genellikle mantar ve bakterileri ifade eder. Bu makalede özetlenen yöntemin genel amacı, kontaminasyonu önlemek için en iyi uygulamaları kapsamlı bir şekilde tanımlamaktır. Tüm laboratuvar üyeleri, bir araştırma laboratuvarının hücre kültürü odasında çalışırken bu uygulamalara uymalıdır. Laboratuvarlar, tüm çalışanların kontaminasyonu önlemek için bu en iyi uygulamaları kullanmada aktif katılımcılar olmasını sağlamalıdır. Doğru uygulamaların ve tekniklerin bilgisi, hücre kültürlerinin canlı, sağlıklı ve kontaminasyondan uzak kalmasını sağlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin gelişimi, literatür araştırmalarına, hücre kültürleriyle çalışma deneyimine ve hem acemilerin hem de deneyimli hücre kültürü çalışanlarının yıllık bazda başvurabilecekleri bir yönteme duyulan ihtiyaca dayanmaktadır.

Tüm araştırma hücre kültürü laboratuvarlarının izlemesi gereken açık, standartlaştırılmış bir tekniğe ihtiyaç vardır. Hücre kültürü kontaminasyonu ile ilgili literatürün çoğunda, mikoplazmanın tespiti, aseptik teknikler, kontaminasyon kaynakları, kontaminantların ortadan kaldırılması ve antibiyotik kullanımı ve^{düzenli testler} 4,5,6,7,8 ile önlenmesi tartışılmaktadır. Bu bilgiler yararlı olsa da, literatürde takip edilmesi gereken uygun hücre kültürü tekniklerini gösteren hiçbir video bulunmamaktadır. Sunulan uygulamaların alternatif tekniklere göre avantajı, hataları daha sonra tespit etmek ve düzeltmek yerine, kontaminasyonu gerçekleşmeden önce önlemeye odaklanmaktır. Ayrıca, aseptik tekniklerin kapsamlı bir gösterimi, mantarların ve bakteri üremesinin önlenmesi hakkında bir tartışma ve biyogüvenlik kabini hava akımı ile ilgili bilgiler hem acemi hem de deneyimli hücre kültürü çalışanları için değerlidir.

Bakteriler ve mantarlar en yaygın iki kirletici türüdür. Bakteri kategorisinde, mikoplazma, küçük boyutu ve fark edilmeden kalırken çoğalma kabiliyeti nedeniyle büyük bir endişe kaynağıdır. Büyümek için ökaryotik hücrelere dayanan sert hücre duvarı olmayan, kendi kendini kopyalayan organizmalardır. Metabolik yetenekleri azalmıştır ve hücre kültürlerinin rutin görsel muayenesinde ve düzenli mikroskobik analizde tanınmadan kalırken büyük ölçüde çoğalabilirler, ancak iletim elektron mikroskobu mikoplazma ^9,10'u tespit edebilir. Ayrıca, mikrobiyolojik filtrelerden geçebilirler¹⁰. Hücre kültürü ortamı mikoplazmaya besin maddeleri sağlar, ancak ne yazık ki medyayı antibiyotiklerle desteklemek mikoplazma^10'u etkilemez. Genel olarak, medyayı antibiyotiklerle desteklemenin gerekli olmadığı unutulmamalıdır; Kirlenmeyi uzak tutmak için uygun teknikler yeterli olmalıdır. Mikoplazma ile enfeksiyon anında hücre ölümüne yol açmaz, ancak veri tekrarlanabilirliğini ve kalitesini etkilediği için araştırmacıları ilgilendirir.

Tüm laboratuvar personeli iyi hücre kültürü uygulamalarına sıkı sıkıya bağlı kalmalıdır. Kültürler yeni satın alındıktan sonra, şu anda yetiştirilirken, kriyoprezervasyondan önce ve sıvı azot ^2,10'dan çözüldüklerinde mikoplazma için test edilmelidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya immünoboyama kullanılarak piyasada farklı testler mevcuttur. ³ Literatür, "insan izolatlarının, hücre kültüründe bulunan mikoplazma kirleticilerinin büyük bir yüzdesini temsil ettiğini"⁵ göstermektedir. 200'den fazla mikoplazma türü tanımlanmış olmasına rağmen, bunların yaklaşık altısı çoğu enfeksiyonu oluşturmaktadır. Bu altı tür M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ve Acholeplasma laidlawii^10'dur. Diğer kontaminasyon türlerinde olduğu gibi, hava ve aerosoller bunları hücre kültürlerine getirir⁵. Bu, "insan operatörü laboratuvardaki potansiyel olarak en büyük tehlikedir"⁷ nedeniyle diğer makalelerde de tekrarlanmaktadır. Bu insan hatası ile yapılsa da, standart bir prosedür izlenirse risk ortadan kaldırılabilir. Personelden dökülme sadece mikoplazma kontaminasyonu ile sınırlı değildir; Bir laboratuvardaki hücre kültürleri genellikle aynı mikoplazma türleriyle enfekte olur, bu da kontaminasyonun yanlış hücre kültürü teknikleri nedeniyle bir şişeden diğerine yayıldığını gösterir¹⁰.

Çapraz kontaminasyonun önlenmesi de uygun hücre kültürü tekniklerinin izlenmesinin bir başka nedenidir. Dünya çapında hücre hatlarının en az% 15-18'inin çapraz kontamine olabileceği veya yanlış tanımlanabileceği belirtilmektedir^11,12. Hücre hatlarını mikoplazma kontaminasyonu açısından test etmenin yanı sıra, çapraz kontaminasyon¹⁰ için de test edilmelidirler. İnsan hücre hatları için, kısa tandem tekrarlama (STR) profillemesi adı verilen ucuz bir DNA tabanlı teknikle hücre hattı kimlik doğrulaması, hücre hattı kimliğini 2,10,13,14 doğrulamanın kolay bir yolu olduğu için mevcut uluslararası referans standardıdır. STR, yanlış etiketlenmiş veya çapraz kontamine olmuş hücre hatlarını tanımlayabilir, ancak yanlış doku orijinini tespit edemez^10,13,14. Araştırma verilerinin geçerliliği, hücre hatlarının yanlış etiketlenmesi, yanlış tanımlanması veya kirlenmesi durumunda tehlikeye girebilir¹³. Diğer kontaminasyon türlerine benzer şekilde, aerosollerin yayılmasına neden olan zayıf teknik, bir şişeye giren yanlış hücre tipine yol açan yanlış temas veya farklı hücre hatlarına sahip aynı ortam şişesini ve reaktiflerini kullanan aynı ortam şişesi ve reaktifleri kullanarak çapraz kontaminasyon oluşabilir¹⁰. Medya şişelerinin paylaşılmaması gerekir; Bir şişe ortamın iki farklı hücre çizgisi arasında paylaşılması, bu hücre popülasyonlarının karıştırılmasına izin verebilir ve daha hızlı büyüyen hücre tipinin şişeyi tamamen ele geçirmesine neden olabilir. Bu değiştirme fark edilmez ve yanlış etiketlemeye ve yanlış tanımlamaya yol açar². Bir hücre çizgisi,^10'un işlenmesi veya etiketlenmesi sırasında kültürlerin karıştırılması durumunda başka bir hücre çizgisiyle de karıştırılabilir. Reaktifleri, medyayı ve şişeleri birbirinden ayrı tutmaya dikkat edilmelidir. Her laboratuvar üyesinin kendi medya şişeleri olmalıdır; Laboratuvar üyeleri arasında hiçbir paylaşım gerçekleşmemelidir. Hücre hatlarının kendileri nitelikli bir hücre bankasından ve sağlayıcıdan satın alınmalıdır. Laboratuvarlar hücreleri paylaşmamalıdır. Çalışmalar, STR ve mikoplazma testlerinin düzenli olarak kullanılmasına rağmen, literatürdeki birçok araştırma makalesinin yanlış tanımlanmış veya kontamine olmuş hücre hatlarını zaten kullandığını göstermektedir¹⁵. Bu sorunlu makaleleri bulmak ve okuyucuları bu konuda geriye dönük olarak bilgilendirmek için araştırmayı gözden geçirmek hantaldır. Önleme, bu sorunun ilk etapta ortaya çıkmamasını sağlamanın en iyi yoludur.

Öğelerin% 70 EtOH ile püskürtülmesinin basit eylemi organizmaları öldürebilir; % 70 EtOH, proteinleri denatüre ederek ve bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere en yaygın kirletici organizmalarda lipitleri çözerek çalışır¹⁶. Çalışmalar,% 70'in en etkili konsantrasyon olduğunu göstermiştir; Yüzey proteinleri% 70 EtOH ile hızlı bir şekilde pıhtılaşmaz, böylece hücreye girebilirler, içerdiği su ise proteinlerin denatüre etme işlemi için gereklidir. Hücre duvarının her iki tarafındaki su ve alkolün konsantrasyon farkı nedeniyle,% 70 EtOH hem enzimatik hem de yapısal proteinleri denatüre etmek için hücreye girer. Şişelerde küf büyümesi gözlenirse, tüm inkübatör önce% 70 EtOH ile püskürtülerek ve kuru olarak silinerek dekontamine edilmeli, ardından 60 ° C'de¹⁶ saat boyunca inkübasyon yapılmalıdır. Bu çoğu küfü ve bakteriyi öldürür.

Önleme uygulamalarının, kontaminasyon oluştuktan sonra ortadan kaldırmaya yönelik alternatif tekniklere göre temel avantajı, laboratuvar çalışanlarının kontaminasyonu erken önleyerek, hücre kültürlerinin sağlıklı olduğundan ve inkübatörlerin dekontaminasyonu veya hücre kültürlerinin atılması ile ilişkili yüksek maliyetler olmayacağından emin olabilmeleridir. Örneğin, mikoplazma kontaminantlarının daha sonra elimine edilmesi etkili değildir⁷. Laboratuvar personelinin uygun şekilde eğitildiğinden, hücre kültürü odasının kendi kendine yeten bir yer olduğundan ve standart bir prosedürün kullanıldığından emin olmak için erkenden zaman ayırmak, zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır.

Protokol

1. Hazırlıklar

1. Genel
   1. Sadece hücre kültürü odasında giyilmek üzere belirlenmiş temiz bir laboratuvar önlüğü giyin ve laboratuvarın diğer bölümlerinde giyilmemelidir.
      NOT: Laboratuvar önlüğünün steril olması gerekmez.
   2. Başka hiçbir yüzeye dokunmamış yeni eldivenler giyin. Eldivenlerin sıkıca oturduğundan emin olun. Nitril, pudrasız eldivenler en iyisidir.
      NOT: Eldivenlerin steril olması gerekmez.
   3. İşe hazırlanmak için eldivenleri, laboratuvar önlüğü kollarını ve biyolojik güvenlik kabininin iç kısmına %70 EtOH püskürtün. Çalışma yüzeyini ve cam paneli tüy bırakmayan bir kağıt havluyla kurulayın.
      NOT: %70 EtOH kullanmak bakterileri en yüksek verimlilikle öldürür¹⁶. Kağıt havlunun steril olması gerekmez.
   4. Su banyolarını hücre kültürü odasının içinde tutun ve bunları sadece kültür ortamını ısıtmak veya hücreleri çözmek için kullanın. Su banyolarını haftada bir kez, üreticinin temizlik talimatlarını izleyerek boşaltın ve yıkayın.
2. Biyolojik güvenlik kabininin içinde
   1. Kabine getirilen öğelerin sayısını sınırlayın. Ön veya arka ızgaraları bloke ederek biyolojik güvenlik kabini içindeki hava akışını kesmeyin.
      NOT: Havanın kabin içinde nasıl aktığına dair bir açıklama için Şekil 1'e bakınız.
   2. Dolabın içine yerleştirilen tüm eşyaları %70 EtOH ile püskürtün ve kurulayın. Medya şişesinin üst kısmını püskürterek ve aşağı doğru çalışarak başlayın. Benzer şekilde, temiz bir kağıt havluyla, kademeli olarak tabana doğru çalışarak kurulayın. Tekrar kapağa doğru gitmeyin.
   3. Kabin serolojik pipetleri barındıracak kadar büyükse, içine yerleştirilebilirler, aksi takdirde kabinin dışına monte edilmiş bir kapta saklanabilirler. Kullanmadan önce muhafazalı pipetin her iki tarafında da delik, yırtılma veya delinme olup olmadığını kontrol edin. Sargıyı sökmeyin. Bunun yerine, sargının uçlarını nazikçe soyun, serolojik pipeti bir pipet yardımcısına yerleştirin ve sargıyı tek bir akışkan hareketle çıkarın.
   4. Açık şişelerin veya şişelerin üzerine gelmeyin; Açık şişelerin veya şişelerin üzerine uzanın veya biyolojik güvenlik dolabında önceden açılmış eşyaların üst kısımlarındaki eşyaları açın.
      NOT: Kabin içindeki hava akımı çalışma yüzeyinde aşağı doğru itilir, bu nedenle örneğin manşonda bulunan herhangi bir kirlenme hücre kültürlerine girebilir.
   5. Sıvı dökmeyin. Bunun yerine, serolojik bir pipet kullanarak ekleyin. Medyayı tamamladıktan sonra, içeriği iyice karıştırın ve şişeyi başlatın. Ayrıca, medyanın desteklendiği şey için bir etiket eklediğinizden emin olun.

2. Yapışkan hücre hatları ile çalışma

1. Plastik bir şişeye ihtiyaç duyulursa, tüm torbayı püskürtün ve dolabın içine yerleştirin.
2. Ortamı veya yıkama solüsyonlarını aspire etmek için otoklavlanmış cam pipetler veya tek kullanımlık steril plastik pipetler kullanın. Metal kapağı saklama kabından dikkatlice çıkarın. Bir cam pipeti, kabı bir açıyla hafifçe sallayarak izole edin. Kabın içine ulaşırken, diğer pipetlere dokunmaktan kaçının.
   NOT: Seçilen pipeti yalnızca bir uçtan tutun.
3. Şişelerin üzerindeki kapakları mümkün olan en kısa sürede hızlı bir şekilde değiştirin. Kapakları çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin, böylece jant çalışma yüzeyine temas etmez. Kapağı üstten veya alttan tutmayın; bunun yerine, yanlardan kapaklara dokunun.
4. Sıvıları aspire ederken, kabinin dışında bulunan bir vakum tuzağı şişesini zemindeki ikincil bir kapta kullanın.
   NOT: Torbalar sızacağından biyolojik tehlike altındaki atık torbalarına sıvı atık atmayın. Kabin içinde çalışırken atık oluşacaktır. Elleri kabine çok sık girip çıkarmak hava akışını keser. Herhangi bir atığı geçici olarak kabinin içinde bırakın. İşi kesintiye uğratmaması için yana doğru yerleştirin.
5. Eldivenleri kuruduklarında cömertçe %70 EtOH ile püskürtün. Eldivenlerin ıslak damlamaması için ellerinizi birbirine sürün.
6. Serolojik bir pipet yanlışlıkla kabindeki bir şeye dokunursa, dışarı atmaktan çekinmeyin. Kirlenmiş olabilecek bir pipet kullanmak yerine temiz bir serolojik pipetle yeniden başlayın.

4. Hücrelerin kontrol edilmesi ve saklanması

1. Hücreleri inkübatöre yerleştirmeden önce, mikroskop altında nasıl göründüklerini kontrol edin. Hücreler iyice askıya alınmışsa, tek hücreler gözlenmelidir.
2. Konuşmayın, hapşırmayın, öksürmeyin veya inkübatörlere ağır nefes almayın. İnkübatör kapılarını hızla açın ve kapatın. Kapıları gerekenden daha uzun süre açık bırakmak, havada bulunan kirleticilerin inkübatörlere girmesine izin verebilir.
   NOT: Hücre kültürü odasında çalışırken maske takmak yardımcı olabilir, çünkü insan ağzında mikoplazma bulunabilir. Hücre kültürü odasında cep telefonu kullanmaktan kaçının, çünkü konuşma tavsiye edilmez.
3. Şişeleri kabinden çıkarmadan önce tüm şişelerdeki kapakların sıkıca kapatıldığından emin olun.
4. Hücre kültürü ortamını, ışığa duyarlı olduğu için kullanılmadığında karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
5. Hücre kültürü çalışması tamamlandıktan sonra kabinin içine% 70 EtOH ile tekrar püskürtün ve yüzeyi bir kağıt havlu ile silin. Biyolojik tehlike çöp atık torbalarını boşaltın. Bu işlemi tekrarlayın ve farklı bir hücre hattına geçerken eldivenleri değiştirin.

5. Süspansiyon hücre hatları ile çalışma

1. Cam şişelerde yetiştirilen süspansiyon hücreleri için, eldivenlerin% 70 EtOH ile iyice püskürtüldüğünden emin olun, ardından alüminyum folyoya ıslak eldivenlerle dokunun ve dolabın içine yerleştirmeden önce şişenin sadece altına püskürtün.
2. Hücre sayımı için bir örnek alırken, kabından sadece bir adet 1,5 mL tüp çıkarın. Başka tüplere dokunmayın. Kapağı çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. İç kenara dokunmayın. Yanlardan dikkatlice tutun ve bittiğinde değiştirin.
3. Şişenin tüm boynunu kaplayan çift katlı alüminyum folyo parçasını dikkatlice çıkarın. Folyo çıktıktan sonra cam şişeyi yalnızca alttan tutun - boynunuzdan dokunmayın. Hücre sayımı için örnek almak üzere 1 mL'lik bir serolojik pipet kullanın.
4. Medyanın şişelerin yanından aşağı damlamasına izin vermeyin; eğer öyleyse,% 70 EtOH içeren bir kağıt havlu püskürtün ve hemen temizleyin.
5. Şişeleri veya şişeleri biyolojik güvenlik dolaplarından çıkarmadan önce kapakların ve alüminyum folyoların sıkıldığından emin olun.

6. Hücre inkübasyonu

1. Farklı hücre tiplerinin çapraz kontaminasyonunu önlemek için farklı hücre tipleri için ayrı inkübatörler kullanın.

7. Sıvı atık toplama

1. Sıvı atıkları, zemindeki dolabın dışında bulunan bir vakum kapanı şişesinde, 'Atık' etiketli ikincil bir kapta toplayın.
   NOT: Hortum, aylık olarak değiştirilen yüksek verimli bir partikül emici (HEPA) filtreye bağlanır.

8. Temizleme

1. Biyolojik tehlike atık torbasını çıkarın ve cam şişeleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın. Lavabonun yanında bir cam yıkama protokolü bulundurun. Yıkama protokolü için Ek Dosya 1'e bakın.
2. Hücre kültürü cam eşyalarını bir cam yıkama tesisine göndermek yerine otoklavlayın. Laboratuvarın ana alanındaki cam eşyalardan ayrı tutun.
   NOT: SF-9 hücreleri, cam iyi temizlenmemişse, şişelerin yanında bir ölü hücre kenarı bırakır. Otoklav protokolü için Ek Dosya 1'e bakın.

9. Organizasyon

1. Hücre kültürü odasını, tüm malzemeler tek bir alanda bulunacak şekilde düzenleyin, böylece laboratuvar üyelerinin malzeme aramak için odadan ayrılma ihtiyacını en aza indirin.
2. Hücreleri toplamak için kullanılan ve daha sonra hücre kültüründe yeniden kullanılan plastik şişeleri 'Sadece Hücre Kültürü Kullanımı İçin' olarak etiketleyin. Belirli bir hücre tipi için belirlenmiş hücre kültürü şişelerini kullanın. Kolay erişim için şişeleri hücre kültürü odasında saklayın.

10. Bakteri, mantar ve mikoplazma kontaminasyonunun tanımlanması

NOT: Yukarıdaki iş akışına uyulmaması bakteriyel, mantar ve mikoplazma kontaminasyonuna yol açabilir.

1. Her zaman çalışmaya başlamadan önce, ağır bulanıklık, bulanık toplar şeklinde ekstra büyüme ve yandaki yoğun hücre birikimleri için şişeleri gözlemleyin, bunların hepsi kirlenmenin göstergeleridir.
   NOT: Deneyimli bir göz, mikrobiyal kontaminasyonun neden olduğu bulanıklık ile gerçek hücreler arasındaki farkı söyleyebilir. Hücreler normalde berrak ortamın bulanık görünmesine neden olurken, bakteriyel kontaminasyon beyaz renkte ağır bulanıklığa neden olur.
   1. Ortamda yüzen yuvarlak, bulanık topların görünümünü not ederek küf kontaminasyonunu görsel olarak tanımlayın (bkz. Şekil 2).
   2. Ortam bulutlu, beyaz veya çalkantılı olduğunda bakteriyel kontaminasyonu görsel olarak tanımlayın (bkz. Şekil 2).
   3. Aylık mikoplazma testi yaparak mikoplazma kontaminasyonunu tanımlayın. PCR tabanlı bir test, kullanıcılara 1,5 mL'lik bir hücre örneği almalarını, 10 μL kullanarak hücre sayımı yapmalarını, 0,08 x 10⁶ hücre / mL'ye seyreltmelerini, hücreleri aşağı döndürmelerini, kitte bulunan tamponu kullanarak hücreleri lize etmelerini ve son bir kez aşağı döndürmelerini söyler. Süpernatant, bir dizi mikoplazma türünü güçlendiren primerlerle inkübe edilir. Bantları görselleştirmek için bir DNA jeli çalıştırın. Bant olmaması, mikoplazmanın tanımlanmadığı anlamına gelir.
      NOT: Bu ana kirletici insan ağzında bulunabilir. Hücrelerdeki mikoplazma kontaminasyonunu çözdükten sonra ve deneyler için kullanmadan önce test etmek iyi bir uygulamadır. Daha sonra, hücreleri ayda bir kez mikoplazma kontaminasyonu açısından izleyin. Birçok şirket mikoplazma test kitleri sunmaktadır. Uygun olanı seçin.

Sonuçlar

Bu makalede özetlenen uygun hücre kültürü teknikleri ve uygulamaları takip edilmezse, araştırma hücre kültürü laboratuvarında mantar ve bakteriler tarafından kontaminasyon meydana gelebilir. Şekil 2'de hem süspansiyonda hem de yapışkan kültürlerde kontaminasyon içeren şişeler görülmektedir.

Aseptik tekniklere uyulmadığında, küf kontaminasyonu 2-3 gün sonra ortaya çıkabilir. Ortamda yüzen yuvarlak bulanık toplar süspansiyon hücre...

Tartışmalar

Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişelerden biri olsa da, bu makalede özetlenen uygulamalar ve teknikler risklerin azaltılmasına yardımcı olacaktır. Kritik adımlar arasında, sadece hücre kültürü odasında kullanılan temiz bir laboratuvar önlüğü giymek, sık sık% 70 EtOH ile püskürtülen ve hücre hatları arasında geçiş yaparken değiştirilen temiz, pudrasız eldivenler kullanmak, her bireyi medya şişelerini paylaşmamaya teşvik etmek, kabini işten önce ve s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques