Zellkulturtechniken und -praktiken zur Vermeidung von Kontaminationen durch Pilze und Bakterien im Forschungszellkulturlabor

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt wesentliche Zellkulturtechniken und -praktiken vor, die im Forschungszellkulturlabor angewendet werden sollen, um eine Kontamination durch Pilze und Bakterien zu vermeiden. Innerhalb der Kategorie der Bakterien wird besonderer Wert auf die Vermeidung einer Mykoplasmenkontamination gelegt.

Zusammenfassung

Zellkultur ist eine heikle Fähigkeit, die notwendig ist, um menschliche, tierische und Insektenzellen oder andere Gewebe in einer kontrollierten Umgebung zu züchten. Das Ziel des Protokolls ist es, die richtigen Techniken hervorzuheben, die in einem Forschungslabor verwendet werden, um eine Kontamination durch Pilze und Bakterien zu verhindern. Besonderer Wert wird auf die Vermeidung einer Mykoplasmenkontamination gelegt, die aufgrund ihrer geringen Größe und Resistenz gegen die meisten Antibiotika, die für die Zellkultur verwendet werden, ein wichtiges Anliegen im Zellkulturraum ist. Dieselben Techniken sorgen für ein kontinuierliches Wachstum und erhalten gesunde Zellen. Sowohl für neue als auch für erfahrene Anwender von Zellkulturen ist es wichtig, sich konsequent an diese Best Practices zu halten, um das Risiko einer Kontamination zu mindern. Einmal im Jahr sollten die Labore die Best Practices für Zellkulturen überprüfen und bei Bedarf eine Diskussion oder zusätzliche Schulungen durchführen. Frühzeitiges Ergreifen von Maßnahmen, um eine Kontamination von vornherein zu verhindern, spart Zeit und Geld im Vergleich zur Reinigung nach einer Kontamination. Universelle Best Practices halten Zellkulturen gesund und reduzieren so die Notwendigkeit, ständig neue Zellen aufzutauen, teure Zellkulturmedien zu kaufen und die Dekontamination und Ausfallzeiten des Inkubators zu reduzieren.

Einleitung

Die Zellkultur hat viele Verwendungsmöglichkeiten im Forschungslabor. Seit den Anfängen der Zellkultur im frühen 20. Jahrhundert haben Zelllinien dazu beigetragen, die Wissenschaft voranzubringen. Zelllinien haben mehrere Vorteile; Verschiedene Zelllinien können Forschern helfen, die Zellbiologie zu untersuchen, Baculoviren für weitere Studien zu produzieren oder große Mengen eines Proteins von Interesse zu produzieren, um nur einige zu nennen¹. Zu den weiteren Anwendungen gehören die Untersuchung des Gewebewachstums, die Förderung der Impfstoffentwicklung, die toxikologische Forschung, die Untersuchung der Rolle von Genen in gesunden Organismen und Krankheitsmodellen sowie die Herstellung von Hybridzelllinien ^2,3. Zelllinien können auch die Herstellung von Medikamenten ermöglichen³. Bei der Arbeit mit Zelllinien sind geeignete aseptische Techniken erforderlich. Die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken sind auf Forschungslabore anwendbar, in denen Zellkulturen durchgeführt werden. Andere Laborumgebungen werden nicht diskutiert.

Kontamination ist oft das Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit bezieht sich der Begriff Kontamination im Allgemeinen auf Pilze und Bakterien. Das übergeordnete Ziel der in diesem Dokument beschriebenen Methode besteht darin, die Best Practices zur Vermeidung von Kontaminationen gründlich zu beschreiben. Alle Labormitglieder sollten sich an diese Praktiken halten, wenn sie im Zellkulturraum eines Forschungslabors arbeiten. Labore sollten sicherstellen, dass alle Mitarbeiter aktiv an der Anwendung dieser bewährten Verfahren zur Vermeidung von Kontaminationen beteiligt sind. Das Wissen über die richtigen Praktiken und Techniken trägt dazu bei, dass Zellkulturen lebensfähig, gesund und frei von Verunreinigungen bleiben. Die Entwicklung dieser Technik basiert auf Literaturrecherchen, sieben Jahren Erfahrung in der Arbeit mit Zellkulturen und der Notwendigkeit einer Methode, auf die sowohl Anfänger als auch erfahrene Zellkulturarbeiter jährlich zurückgreifen können.

Es besteht ein Bedarf an einer klaren, standardisierten Technik, der alle Forschungszellkulturlabore folgen sollten. Ein Großteil der Literatur zur Kontamination von Zellkulturen befasst sich mit dem Nachweis von Mykoplasmen, aseptischen Techniken, Kontaminationsquellen, der Beseitigung von Verunreinigungen und der Prävention durch den Einsatz von Antibiotika und regelmäßigen Tests 4,5,6,7,8. Obwohl diese Informationen hilfreich sind, gibt es in der Literatur keine Videos, die die richtigen Zellkulturtechniken demonstrieren, die man befolgen sollte. Der Vorteil der vorgestellten Praktiken gegenüber alternativen Techniken besteht darin, dass der Schwerpunkt darauf liegt, eine Kontamination zu verhindern, bevor sie auftritt, anstatt Fehler später zu erkennen und zu korrigieren. Darüber hinaus sind eine gründliche Demonstration aseptischer Techniken, eine Diskussion über die Verhinderung von Pilz- und Bakterienwachstum sowie Informationen über den Luftstrom in Biosicherheitswerkbänken sowohl für Anfänger als auch für erfahrene Zellkulturmitarbeiter wertvoll.

Bakterien und Pilze sind die beiden häufigsten Arten von Verunreinigungen. Innerhalb der Bakterienkategorie sind Mykoplasmen aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Fähigkeit, sich unbemerkt zu vermehren, ein großes Problem. Es handelt sich um sich selbst replizierende Organismen ohne starre Zellwand, die auf eukaryotische Zellen angewiesen sind, um zu wachsen. Sie haben eine reduzierte Stoffwechselfähigkeit und können sich stark vermehren, während sie bei der routinemäßigen visuellen Inspektion von Zellkulturen und der regelmäßigen mikroskopischen Analyse unerkannt bleiben, obwohl die Transmissionselektronenmikroskopie Mykoplasmen nachweisen kann ^9,10. Darüber hinaus können sie mikrobiologische Filter¹⁰ passieren. Zellkulturmedium versorgt Mykoplasmen mit Nährstoffen, obwohl die Ergänzung mit Antibiotika leider keinen Einfluss auf Mykoplasmen^{hat 10}. Es ist zu beachten, dass es im Allgemeinen nicht notwendig ist, Medien mit Antibiotika zu ergänzen. Geeignete Techniken sollten ausreichen, um eine Kontamination in Schach zu halten. Eine Infektion mit Mykoplasmen führt nicht zum sofortigen Zelltod, ist aber für Forscher besorgniserregend, da sie die Reproduzierbarkeit und Qualität der Daten beeinträchtigt.

Das gesamte Laborpersonal sollte sich strikt an gute Zellkulturpraktiken halten. Kulturen sollten nach dem Neukauf, während der Zucht, vor der Kryokonservierung und nach dem Auftauen aus flüssigem Stickstoff auf Mykoplasmen getestet werden ^2,10. Auf dem Markt sind verschiedene Tests erhältlich, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder Immunfärbung verwenden. ³ In der Literatur wird darauf hingewiesen, dass "menschliche Isolate einen großen Prozentsatz der in Zellkultur gefundenen Mykoplasmenkontaminanten ausmachen"⁵. Obwohl mehr als 200 Mykoplasmenarten beschrieben wurden, sind etwa sechs davon für die meisten Infektionen verantwortlich. Bei diesen sechs Arten handelt es sich um M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale und Acholeplasma laidlawii¹⁰. Wie bei anderen Arten von Kontaminationen werden diese durch Luft und Aerosole in Zellkulturen eingebracht⁵. Dies wird auch in anderen Arbeiten wiederholt, da der "menschliche Bediener potenziell die größte Gefahr im Labor darstellt^"7. Obwohl dies durch menschliches Versagen geschieht, kann das Risiko eliminiert werden, wenn ein Standardverfahren befolgt wird. Die Ausscheidung des Personals beschränkt sich nicht nur auf die Kontamination mit Mykoplasmen. Zellkulturen in einem Labor sind in der Regel mit denselben Mykoplasmenarten infiziert, was darauf hindeutet, dass sich die Kontamination aufgrund unsachgemäßer Zellkulturtechniken von einem Kolben zum anderen ausbreitet¹⁰.

Die Vermeidung von Kreuzkontaminationen ist auch ein weiterer Grund, warum geeignete Zellkulturtechniken befolgt werden sollten. Es wird darauf hingewiesen, dass mindestens 15 % bis 18 % der Zelllinien weltweit kreuzkontaminiert oder falsch identifiziert sein können^11,12. Neben der Untersuchung von Zelllinien auf Mykoplasmenkontamination sollten sie auch auf Kreuzkontamination getestet werden¹⁰. Für menschliche Zelllinien ist die Zelllinienauthentifizierung durch eine kostengünstige DNA-basierte Technik, die als Short Tandem Repeat (STR)-Profiling bezeichnet wird, der aktuelle internationale Referenzstandard, da es eine einfache Möglichkeit ist, die Identität der Zelllinie zu bestätigen 2,10,13,14. Die STR kann falsch markierte oder kreuzkontaminierte Zelllinien identifizieren, aber keinen falschen Gewebeursprung^{nachweisen 10,13,14}. Die Aussagekraft von Forschungsdaten kann beeinträchtigt werden, wenn Zelllinien falsch markiert, falsch identifiziert oder kontaminiert werden¹³. Ähnlich wie bei anderen Arten von Kontaminationen kann eine Kreuzkontamination aufgrund einer schlechten Technik auftreten, die zur Ausbreitung von Aerosolen führt, eines irrtümlichen Kontakts, der dazu führt, dass der falsche Zelltyp in einen Kolben gelangt, oder der Verwendung derselben Medienflasche und derselben Reagenzien mit unterschiedlichen Zelllinien¹⁰. Es sollte keine gemeinsame Nutzung von Medienflaschen erfolgen. Durch die gemeinsame Nutzung einer Flasche Medium zwischen zwei verschiedenen Zelllinien können diese Zellpopulationen gemischt werden, was dazu führt, dass der schneller wachsende Zelltyp den Kolben vollständig übernimmt. Dieser Austausch ist nicht wahrnehmbar und führt zu falscher Etikettierung und falscher Identifizierung². Eine Zelllinie kann auch mit einer anderen verwechselt werden, wenn Kulturen während der Handhabung oder Markierung^{verwechselt werden 10}. Es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, Reagenzien, Medien und Kolben getrennt voneinander aufzubewahren. Jedes Labormitglied sollte seine eigenen Medienflaschen haben. Es sollte keine Freigabe zwischen Lab-Mitgliedern erfolgen. Die Zelllinien selbst sollten von einer qualifizierten Mobilfunkbank und einem qualifizierten Anbieter erworben werden. Labore sollten keine Zellen gemeinsam nutzen. Studien zeigen, dass, obwohl STR- und Mykoplasmentests regelmäßig verwendet werden, in vielen Forschungsarbeiten in der Literatur bereits falsch identifizierte oder kontaminierte Zelllinien verwendet wurden¹⁵. Es ist umständlich, die Recherchen zu durchforsten, um diese problematischen Papiere zu finden und die Leser nachträglich über dieses Thema zu informieren. Prävention ist der beste Weg, um sicherzustellen, dass dieses Problem gar nicht erst auftritt.

Das einfache Besprühen von Gegenständen mit 70 % EtOH kann Organismen abtöten. 70 % EtOH wirkt, indem es Proteine denaturiert und Lipide in den am häufigsten kontaminierenden Organismen, einschließlich Bakterien und Pilzen, auflöst¹⁶. Studien haben gezeigt, dass 70 % die effektivste Konzentration ist; Oberflächenproteine koagulieren nicht schnell mit 70% EtOH, so dass sie in die Zelle eindringen können, während das darin enthaltene Wasser für den Denaturierungsprozess von Proteinen notwendig ist. Aufgrund des Konzentrationsunterschieds von Wasser und Alkohol auf beiden Seiten der Zellwand gelangen 70 % EtOH in die Zelle, um sowohl enzymatische als auch Strukturproteine zu denaturieren. Wenn Schimmelbildung in Kolben beobachtet wird, muss der gesamte Inkubator dekontaminiert werden, indem er zunächst mit 70 % EtOH besprüht und trocken gewischt wird, gefolgt von einer 16-stündigen Inkubationszeit über Nacht bei 60 °C¹⁷. Dies tötet die meisten Schimmelpilze und Bakterien ab.

Der Hauptvorteil von Präventionspraktiken gegenüber alternativen Techniken zur Beseitigung von Kontaminationen im Nachhinein besteht darin, dass Labormitarbeiter durch die frühzeitige Verhinderung von Kontaminationen sicher sein können, dass ihre Zellkulturen gesund sind und keine hohen Kosten mit der Dekontamination von Inkubatoren oder der Entsorgung von Zellkulturen verbunden sind. Die Eliminierung von Mykoplasmenkontaminanten ist z. B. danach nicht effizient⁷. Wenn Sie sich frühzeitig die Zeit nehmen, um sicherzustellen, dass das Laborpersonal richtig geschult ist, der Zellkulturraum in sich geschlossen ist und ein Standardverfahren verwendet wird, sparen Sie Zeit und Geld.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Allgemein
   1. Tragen Sie einen sauberen Laborkittel, der nur im Zellkulturraum und nicht in anderen Teilen des Labors getragen werden darf.
      HINWEIS: Der Laborkittel muss nicht steril sein.
   2. Tragen Sie neue Handschuhe, die keine anderen Oberflächen berührt haben. Achten Sie darauf, dass die Handschuhe fest sitzen. Puderfreie Nitrilhandschuhe sind am besten.
      Anmerkungen: Die Handschuhe müssen nicht steril sein.
   3. Um sich auf die Arbeit vorzubereiten, sprühen Sie die Handschuhe, die Ärmel des Laborkittels und das Innere der biologischen Sicherheitswerkbank mit 70 % EtOH ein. Wischen Sie die Arbeitsfläche und die Glasscheibe mit einem fusselfreien Papiertuch trocken.
      HINWEIS: Die Verwendung von 70 % EtOH tötet Bakterien mit der höchsten Effizienz^{ab 16}. Das Papiertuch muss nicht steril sein.
   4. Halten Sie Wasserbäder im Zellkulturraum und verwenden Sie diese nur zum Erwärmen von Nährmedien oder zum Auftauen von Zellen. Entleeren und waschen Sie die Wasserbäder einmal pro Woche gemäß den Reinigungsanweisungen des Herstellers.
2. Im Inneren der biologischen Sicherheitswerkbank
   1. Begrenzen Sie die Anzahl der Gegenstände, die in den Schrank gebracht werden. Unterbrechen Sie den Luftstrom in der biologischen Sicherheitswerkbank nicht, indem Sie die vorderen oder hinteren Gitter blockieren.
      Anmerkungen: In Abbildung 1 wird erläutert, wie Luft in einem Schrank strömt.
   2. Sprühen Sie alle Gegenstände im Schrank mit 70 % EtOH ein und wischen Sie sie trocken. Beginnen Sie damit, die Oberseite der Medienflasche zu besprühen und sich nach unten zu arbeiten. Wischen Sie es in ähnlicher Weise mit einem sauberen Papiertuch trocken und arbeiten Sie sich nach und nach nach nach unten. Gehen Sie nicht wieder nach oben in Richtung der Kappe.
   3. Wenn der Schrank groß genug ist, um serologische Pipetten aufzunehmen, können sie im Inneren platziert werden, andernfalls können sie in einem Behälter aufbewahrt werden, der an der Außenseite des Schranks montiert ist. Überprüfen Sie vor der Verwendung beide Seiten der umhüllten Pipette auf Löcher, Risse oder Einstiche in der Verpackung. Reißen Sie die Verpackung nicht ab. Schälen Sie stattdessen vorsichtig die Enden der Verpackung, führen Sie die serologische Pipette in eine Pipettenhilfe ein und entfernen Sie die Hülle in einer fließenden Bewegung.
   4. Bewegen Sie den Mauszeiger nicht über geöffnete Flaschen oder Flaschen; Greifen Sie über offene Flaschen oder Flaschen oder öffnen Sie Gegenstände über bereits geöffnete Gegenstände in der biologischen Sicherheitswerkbank.
      Anmerkungen: Der Luftstrom im Inneren des Gehäuses drückt auf die Arbeitsfläche, so dass z. B. Verunreinigungen auf der Hülse in die Zellkulturen gelangen können.
   5. Gießen Sie keine Flüssigkeiten ein. Fügen Sie sie stattdessen mit einer serologischen Pipette hinzu. Nachdem Sie das Medium ergänzt haben, mischen Sie den Inhalt gründlich und initialisieren Sie die Flasche. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie ein Etikett für das beifügen, womit das Medium ergänzt wurde.

2. Arbeiten mit adhärenten Zelllinien

1. Wenn eine Plastikflasche benötigt wird, sprühen Sie den gesamten Beutel ein und legen Sie ihn in den Schrank.
2. Verwenden Sie autoklavierte Glaspipetten oder sterile Einwegpipetten aus Kunststoff, um die Medien oder Waschlösungen anzusaugen. Entfernen Sie vorsichtig die Metallkappe vom Vorratsbehälter. Isolieren Sie eine Glaspipette, indem Sie den Behälter vorsichtig schräg schütteln. Wenn Sie in den Behälter greifen, vermeiden Sie es, andere Pipetten zu berühren.
   Anmerkungen: Fassen Sie die gewählte Pipette nur von einem Ende aus an.
3. Setzen Sie die Verschlüsse der Flaschen so schnell wie möglich wieder auf. Legen Sie die Kappen verkehrt herum auf die Arbeitsfläche, so dass der Rand die Arbeitsfläche nicht berührt. Fassen Sie die Kappe nicht von oben oder unten; Berühren Sie stattdessen die Kappen von den Seiten.
4. Verwenden Sie zum Absaugen von Flüssigkeiten einen Vakuumkolben, der sich außerhalb des Schranks in einem sekundären Behälter auf dem Boden befindet.
   Anmerkungen: Werfen Sie keine flüssigen Abfälle in Säcke für biologisch gefährliche Abfälle, da die Beutel undicht werden. Bei der Arbeit im Schrank entsteht Abfall. Wenn Sie die Hände zu oft in den Schrank hinein- und herausbewegen, wird der Luftstrom unterbrochen. Lassen Sie alle Abfälle vorübergehend im Schrank. Legen Sie es zur Seite, damit es die Arbeit nicht unterbricht.
5. Besprühen Sie die Handschuhe großzügig mit 70 % EtOH, wenn sie trocken sind. Reiben Sie die Hände aneinander, damit die Handschuhe nicht tropfnass sind.
6. Wenn eine serologische Pipette versehentlich etwas im Schrank berührt, zögern Sie nicht, sie wegzuwerfen. Beginnen Sie von vorne mit einer sauberen serologischen Pipette, anstatt eine zu verwenden, die möglicherweise kontaminiert ist.

4. Zellen prüfen und lagern

1. Bevor Sie die Zellen in den Inkubator legen, überprüfen Sie, wie sie unter dem Mikroskop aussehen. Wenn die Zellen gründlich suspendiert wurden, sollten einzelne Zellen beobachtet werden.
2. Sprechen Sie nicht, niesen, husten Sie nicht und atmen Sie nicht schwer in die Inkubatoren. Öffnen und schließen Sie schnell die Türen des Inkubators. Wenn Sie die Türen länger als nötig offen lassen, können in der Luft vorhandene Verunreinigungen in die Inkubatoren gelangen.
   HINWEIS: Das Tragen einer Maske während der Arbeit im Zellkulturraum kann helfen, da Mykoplasmen im menschlichen Mund vorhanden sein können. Vermeiden Sie die Verwendung von Mobiltelefonen im Zellkulturraum, da das Sprechen nicht empfohlen wird.
3. Stellen Sie sicher, dass die Verschlüsse aller Flaschen fest verschlossen sind, bevor Sie die Flaschen aus dem Schrank nehmen.
4. Lagern Sie Zellkulturmedien bei Nichtgebrauch im Dunkeln bei 4 °C, da sie lichtempfindlich sind.
5. Besprühen Sie das Innere des Schranks nach Abschluss der Zellkulturarbeit erneut mit 70 % EtOH und wischen Sie die Oberfläche mit einem Papiertuch trocken. Leeren Sie die Abfallsäcke für biologisch gefährliche Abfälle. Wiederholen Sie diesen Vorgang und tauschen Sie die Handschuhe aus, wenn Sie zu einer anderen Zelllinie wechseln.

5. Arbeiten mit Suspensionszelllinien

1. Stellen Sie bei Suspensionszellen, die in Glaskolben gezüchtet wurden, sicher, dass die Handschuhe gründlich mit 70 % EtOH besprüht werden, berühren Sie dann die Aluminiumfolie mit den nassen Handschuhen und besprühen Sie nur den Boden des Kolbens, bevor Sie ihn in den Schrank stellen.
2. Wenn Sie eine Probe für die Zellzählung entnehmen, nehmen Sie nur ein 1,5-ml-Röhrchen aus dem Behälter. Berühren Sie keine anderen Röhren. Legen Sie die Kappe verkehrt herum auf die Arbeitsfläche. Berühren Sie nicht die innere Felge. Behandeln Sie es vorsichtig von den Seiten und ersetzen Sie es, wenn Sie fertig sind.
3. Entfernen Sie vorsichtig das doppelt gefaltete Stück Alufolie, das den gesamten Flaschenhals bedeckt. Fassen Sie den Glaskolben nur von unten an – berühren Sie ihn nicht vom Hals aus – sobald die Folie entfernt ist. Verwenden Sie eine serologische 1-ml-Pipette, um eine Probe für die Zellzählung zu entnehmen.
4. Lassen Sie das Medium nicht an der Seite der Kolben heruntertropfen. Wenn dies der Fall ist, sprühen Sie ein Papiertuch mit 70 % EtOH ein und reinigen Sie es sofort.
5. Stellen Sie sicher, dass Verschlüsse und Aluminiumfolie festgezogen sind, bevor Sie Flaschen oder Flaschen aus den biologischen Sicherheitswerkbänken entfernen.

6. Inkubation der Zellen

1. Verwenden Sie separate Inkubatoren für verschiedene Zelltypen, um eine Kreuzkontamination der verschiedenen Zelltypen zu verhindern.

7. Sammlung von flüssigen Abfällen

1. Sammeln Sie flüssige Abfälle in einem Vakuumkolben, der sich außerhalb des Schranks auf dem Boden befindet, in einem Sekundärbehälter mit der Aufschrift "Abfall".
   Anmerkungen: Der Schlauch ist an einen HEPA-Filter (High Efficiency Particulate Absorbing) angeschlossen, der monatlich ausgetauscht wird.

8. Aufräumen

1. Entfernen Sie den Abfallsack und waschen Sie die Glasflaschen so schnell wie möglich. Führen Sie ein Gläserspülprotokoll an der Spüle. Siehe Ergänzungsdatei 1 für das Waschprotokoll.
2. Autoklavieren Sie die Zellkulturgläser, anstatt sie an eine Glaswaschanlage zu schicken. Bewahren Sie es getrennt von Glaswaren im Hauptbereich des Labors auf.
   Anmerkungen: SF-9-Zellen hinterlassen einen Rand abgestorbener Zellen an der Seite der Kolben, wenn das Glas nicht gut geschrubbt wird. Siehe Ergänzungsdatei 1 für das Autoklavenprotokoll.

9. Organisation

1. Organisieren Sie den Zellkulturraum so, dass sich alle Vorräte in einem Bereich befinden, wodurch die Notwendigkeit für Labormitglieder, den Raum auf der Suche nach Vorräten zu verlassen, minimiert wird.
2. Kennzeichnen Sie alle Plastikflaschen, die zur Entnahme von Zellen verwendet und anschließend in der Zellkultur wiederverwendet werden, als "Nur zur Verwendung in Zellkulturen". Verwenden Sie die dafür vorgesehenen Zellkulturflaschen für einen bestimmten Zelltyp. Bewahren Sie die Flaschen im Zellkulturraum auf, damit sie leicht zugänglich sind.

10. Identifizierung von Bakterien-, Pilz- und Mykoplasmenkontamination

HINWEIS: Die Nichtbeachtung des oben genannten Arbeitsablaufs kann zu einer Kontamination mit Bakterien, Pilzen und Mykoplasmen führen.

1. Achten Sie immer vor Beginn der Arbeit auf starke Trübung, zusätzliches Wachstum in Form von Fuzzy-Kugeln und dichte Zellansammlungen an der Seite, die alle Indikatoren für eine Kontamination sind.
   HINWEIS: Ein erfahrenes Auge kann den Unterschied zwischen der durch mikrobielle Kontamination verursachten Trübung und der tatsächlichen Zelle erkennen. Während die Zellen das normalerweise klare Medium trüb erscheinen lassen, verursacht die bakterielle Kontamination eine starke Trübung mit weißer Farbe.
   1. Identifizieren Sie Schimmelpilzverunreinigungen visuell, indem Sie das Auftreten von runden, unscharfen Kugeln bemerken, die im Medium schweben (siehe Abbildung 2).
   2. Erkennen Sie eine bakterielle Kontamination visuell, wenn das Medium trüb, weiß oder turbulent ist (siehe Abbildung 2).
   3. Identifizieren Sie eine Mykoplasmenkontamination, indem Sie einen monatlichen Mykoplasmentest durchführen. Ein PCR-basierter Test weist die Benutzer an, eine 1,5-ml-Zellprobe zu entnehmen, eine Zellzählung mit 10 μl durchzuführen, auf 0,08 x 10⁶ Zellen/ml zu verdünnen, die Zellen herunterzudrehen, die Zellen mit dem im Kit enthaltenen Puffer zu lysieren und ein letztes Mal herunterzufahren. Der Überstand wird mit Primern inkubiert, die eine Reihe von Mykoplasmenarten amplifizieren. Führen Sie ein DNA-Gel durch, um die Banden zu visualisieren. Keine Banden bedeuten, dass Mykoplasmen nicht identifiziert sind.
      Anmerkungen: Diese Hauptverunreinigung kann im menschlichen Mund vorhanden sein. Es hat sich bewährt, Zellen nach dem Auftauen und vor der Verwendung für Experimente auf Mykoplasmenkontamination zu testen. Kontrollieren Sie die Zellen anschließend einmal im Monat auf Mykoplasmenkontamination. Viele Unternehmen bieten Mykoplasmen-Testkits an. Wählen Sie eine aus, die geeignet ist.

Ergebnisse

Wenn die in diesem Artikel beschriebenen Zellkulturtechniken und -praktiken nicht befolgt werden, kann es im Forschungszellkulturlabor zu einer Kontamination durch Pilze und Bakterien kommen. Abbildung 2 zeigt Kolben mit Verunreinigungen sowohl in der Suspensions- als auch in der adhärenten Kultur.

Wenn keine aseptischen Techniken befolgt werden, kann es 2–3 Tage später zu einer Schimmelpilzkontamination kommen. Runde, unscharfe Kugeln, die im Medium schweben,...

Diskussion

Während die Kontamination eines der Hauptanliegen bei der Durchführung von Zellkulturarbeiten ist, werden die in diesem Manuskript beschriebenen Praktiken und Techniken dazu beitragen, die Risiken zu mindern. Zu den kritischen Schritten gehören das Tragen eines sauberen Laborkittels, der nur im Zellkulturraum verwendet wird, die Verwendung sauberer, puderfreier Handschuhe, die häufig mit 70 % EtOH besprüht werden und beim Wechsel zwischen den Zelllinien gewechselt werden, die Ermutigung jedes Einzelnen, Medienflasch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques