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摘要

本协议描述了一种将人和非人灵长类动物尿液来源细胞分离、扩增和重新编程为诱导多能干细胞 （iPSC） 的方法，以及新生成的 iPSC 的无饲养层维护说明。

摘要

研究灵长类多能干细胞及其衍生物的跨物种方法对于更好地了解疾病、发育和进化的分子和细胞机制至关重要。为了使灵长类动物诱导的多能干细胞（iPSCs）更容易获得，本文提出了一种从尿源性细胞中产生人和非人灵长类动物iPSCs的非侵入性方法，并使用无饲养层培养方法维持它们。

尿液可以从非无菌环境（例如动物的笼子）中取样，并在原代细胞培养过程中用广谱抗生素混合物处理，以有效减少污染。在尿源性细胞繁殖后，iPSCs通过市售仙台病毒载体系统的改良转导方法产生。第一个iPSC菌落可能在5天后已经可见，最早可以在10天后采摘。使用无酶解离缓冲液进行常规团块传代，支持生成的 iPSC 的多能性超过 50 次传代。

引言

人类和非人类灵长类动物（NHP）的基因组比较对于了解我们的进化历史和人类特异性状的进化至关重要1。此外，这些比较允许通过识别保守的DNA序列2来推断功能，例如，优先考虑与疾病相关的变异3。分子表型（如基因表达水平）的比较对于更好地解释基因组比较和发现例如细胞表型差异至关重要。此外，它们具有 - 类似于DNA水平的比较 - 推断功能相关性的潜力，从而更好地解释人类内部的医学相关变异4。将全面的分子表型数据纳入这些比较研究需要适当的生物资源（即跨物种的直系同源细胞）。然而，伦理和实践原因使得难以或不可能获得这种可比细胞，特别是在发育过程中。诱导多能干细胞（iPSCs）允许在体外产生这种难以接近的细胞类型5，6，在实验上是可接近的，并且已用于灵长类动物比较6，7，8，9，10，11，12，13，14。

为了产生iPSC，需要获得要重新编程的原代细胞。从尿液中分离的细胞的优点是可以从灵长类动物中非侵入性地采样，并且可以很容易地重新编程，这可能是由于它们的干细胞样分子谱15。维持灵长类动物iPSC的培养条件与重编程一样重要;传统上，人多能干细胞的培养需要一种非定义的、基于血清的培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（所谓的饲养层细胞）的共培养，为胚胎干细胞（ESC）提供必需的营养物质和支架16。自从化学成分明确且无饲养层的培养系统开发以来17，18，现在有多种市售iPSC培养基和基质可供选择。然而，这些培养条件中的大多数已针对人类ESC和iPSC进行了优化，因此在NHP iPSC培养中可能效果较差。在此视频协议中，我们提供了生成和维持源自尿细胞培养的人类和NHP iPSC的说明。

自2006年首次报道通过成纤维细胞中特定因子的强制表达产生iPSC以来，该方法已应用于各种来源的许多不同细胞类型19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32.其中，只能以完全无创的方式获得尿源性细胞。基于Zhou等人先前描述的方案33，通过补充广谱抗生素，甚至可以从非无菌样品中分离和扩增灵长类动物尿液中的细胞15。值得注意的是，通过该方案采样的尿液来源细胞表现出产生iPSCs的高潜力，在比传统的成纤维细胞重编程（20-30天，根据我们的经验）更短的时间内（集落在5-15天内可见），并且具有足够高的成功率。这些尿源性细胞被归类为间充质干细胞样细胞和膀胱上皮细胞的混合群体，导致重编程效率高15。

除了原代细胞的变化外，产生iPSCs的重编程方法也根据使用目的而有所不同。人体细胞的常规重编程程序是通过用逆转录病毒或慢病毒载体过表达重编程因子来进行的，这允许外源性DNA整合到基因组中5，34，35。为了保持生成的iPSCs基因组完整，研究人员开发了多种非整合系统-可切除的PiggyBac载体36，37，游离体载体38，39，仙台病毒40和腺病毒41等非整合病毒载体，mRNA转染42，蛋白质转染43，44和化合物处理45.由于高效且易于处理，该协议中使用了基于仙台病毒的重编程载体。原代细胞的感染在接种前以5的感染多重性（MOI）在细胞和病毒的1小时悬浮培养中进行。与将病毒直接添加到贴壁细胞培养物中的常规方法相比，这种修改的步骤可以增加细胞表面与病毒接触的可能性，从而产生更多的iPSC集落15。

人类和NHP多能干细胞的传代可以通过团块传代和单细胞传代来完成。乙二胺四乙酸（EDTA）是一种具有成本效益的螯合剂，可结合钙和镁离子，从而防止钙粘蛋白和整合素的贴壁活性。EDTA也被用作温和的选择性解离试剂，因为未分化的细胞由于其不同的粘附分子而在分化的细胞之前分离。完全解离通过含有蛋白激酶（Rho/Rock）介导的肌球蛋白过度激活的Rho/Rho相关线圈 诱导 灵长类iPSCs的大量细胞死亡。因此，对于需要悬浮液中的单细胞的实验，补充Rho/Rock抑制剂培养基至关重要46，47。在该协议中，我们建议将团块传代作为常规传代方法，并建议仅在必要时进行单细胞传代，例如，当需要接种定义的细胞数量时或在亚克隆期间。

研究方案

该实验程序得到了负责人体实验伦理委员会（20-122，Ethikkommission LMU München）的批准。所有实验均按照相关指南和规定进行。
注意:在开始处理人类和非人灵长类样品的实验之前，必须获得相应伦理委员会的批准。所有实验程序必须按照相关指南和规定进行。以下每个步骤都应在生物安全柜中使用无菌技术进行。所有缓冲液和培养基组成均可在 补充表S1中找到。确保在将所有培养基加热至室温（22°C）之前加入细胞。除非另有说明，否则每个离心步骤应在室温下进行。

1. 从尿液样本中分离细胞

注意:确保人类捐赠者不含人类免疫缺陷病毒（HIV），乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）。对于非人灵长类，确保可能的供体/细胞不含特定病原体-B 病毒 （BV）、猿免疫缺陷病毒 （SIV）、猿猴 β 逆转录病毒 （SRV） 和猿猴 T 细胞嗜淋巴细胞病毒 （STLV）。

  1. 通过每孔添加 500 μL 0.2% 明胶来制备明胶包被的 12 孔板，并通过移动板来分配液体。在需要之前置于37°C至少30分钟。
  2. 在 50 mL 锥形管中收集人尿样本。对于灵长类动物，用注射器从动物设施的地板收集尿液。
    注意:5 mL尿液的体积被证明足以在42%的尝试中分离至少一个菌落。但是，建议使用更大体积的 ~50 mL 尿液以增加分离菌落的机会。NHP尿液应尽可能新鲜取样，最好在排尿后立即取样。尿液样品在4°C下储存4小时对方案的成功率没有负面影响，但没有测试更长的储存时间。
  3. 将含尿管以400× g 离心10分钟，并小心吸出上清液，在管中留下约1mL。
  4. 将沉淀重悬于残留的 1 mL 液体中。如果收集多管尿液，则将悬浮液集中在一个管中。
  5. 通过向管中加入含有2.5μg/ mL两性霉素的10mL尿洗涤缓冲液（参见 补充表S1）来洗涤细胞，并使用血清移液管小心地混合悬浮液。
  6. 将管以200× g 离心10分钟，并小心吸出上清液，在管中留下约<0.2mL。
  7. 将细胞沉淀重悬于每 50 mL 初始处理尿液中含有 0.5 μg/mL 两性霉素的 1 mL 原代尿培养基（参见 补充表 S1）（重悬于 1 mL，即使处理的尿液少于 50 mL）。
  8. 从孔中吸出明胶（在步骤1.1中制备），并将步骤1.7中的悬浮液板1mL板放入12孔板的一个孔中。根据需要重复任意数量的孔，或尽可能多的悬浮液。
    可选:为避免因不卫生的样品采集而造成的污染，从现在开始向细胞中添加 100 μg/mL 抗菌试剂，直到第一次传代。
  9. 将板置于37°C，5%CO2 培养箱中。
  10. 每天每孔添加 1 mL 初级尿培养基，直到第 5 天，无需去除现有培养基。
  11. 在第 5 天，从平板中吸出 4 mL 培养基，留下约 1 mL 培养基。每孔加入 1 mL REMC 培养基（参见补充表 S1），以获得与新培养基的 1:1 混合物。
  12. 每天用REMC培养基替换一半的培养基，直到出现第一个菌落（图1A，B）。因此，取出 1 mL 旧培养基，每孔加入 1 mL 新鲜 REMC 培养基。

2.泌尿细胞扩增

注意:尿细胞传代应在培养达到90%汇合之前进行。

  1. 制备所需量的明胶包衣12孔板，如步骤1.1中所述。
  2. 吸出旧培养基，并通过加入 1 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞。
  3. 吸出 DPBS，并加入 300 μL 用 DPBS 稀释的 0.5x 解离酶。将板在37°C孵育5分钟。
  4. 加入 700 μL REMC 培养基以停止酶促反应。使用P1000移液器轻轻移液悬浮液，直到细胞解离成单个细胞。
  5. 将细胞悬液转移到 15 mL 管中，并以 200 × g 离心管 5 分钟。
  6. 小心吸出上清液并将沉淀重悬于1mL REMC培养基中。
  7. 使用细胞计数器（血细胞计数器或自动细胞计数器）对细胞进行计数。
  8. 为了扩增尿细胞，将 1 mL REMC 培养基中的 1.5 × 104 至 3 × 104 细胞 板放入一个涂有 0.2% 明胶的 12 孔板中。
  9. 每隔一天进行后续培养基更换，直到培养物达到80%-90%汇合度。因此，吸出旧培养基并加入 1 mL 新鲜 REMC 培养基。

3. 仙台病毒载体感染产生iPSC

注意:有关重新编程过程的工作流程，请参见 图2A。用于重编程的泌尿细胞应尽可能年轻，但在传代4之前未观察到重编程效率的显着损失。仙台病毒重编程试剂盒必须在BL-2设施中使用。在层流生物安全柜下处理病毒，并始终使用适当的安全设备以防止粘膜暴露。

  1. 通过每孔添加 500 μL 基底膜基质来制备基底膜基质包被的 12 孔板，并通过移动板来分配液体。将板在37°C孵育至少1小时，并用900μLREMC培养基替换基底膜基质。将板储存在37°C直至使用。
  2. 在37°C水浴中快速解冻仙台重编程套件的组件。将仙台病毒（多顺反子KLF4-OCT3/4-SOX2、cMYC和KLF4）与MOI为5混合，并加入最多100μL的REMC培养基。 使用公式（1）:
    figure-protocol-2760
    注:由于不同批次的病毒滴度不同，请始终检查制造商提供的分析证书中的滴度。
    可选:另外使用绿色荧光蛋白（GFP）仙台病毒作为转导效率的阳性对照。为此，在步骤3.3期间在单独的管中准备另外3.5×104 个细胞。
  3. 对于尿细胞的解离，请按照步骤2.2-2.4进行操作。使用细胞计数器计数细胞，并将 7 × 104 个泌尿细胞转移到 1.5 mL 管中。
  4. 将管以200 ×g 离心5分钟，并小心地除去上清液而不破坏细胞沉淀。将沉淀重悬于步骤3.2制备的100μLSeV混合物中。将管在37°C孵育1小时以进行悬浮液感染。
  5. 将悬浮液铺在步骤3.1中制备的基底膜基质包被的12孔板上。常规地，板1×104 和2.5×每孔104 个细胞一式两份。
  6. 将细胞在37°C和5%CO2下孵育。转导后 24 小时和第 3 天用 1 mL 新鲜 REMC 培养基替换培养基。
  7. 在转导后第5天，将培养基更换为PSC生成培养基（参见补充表S1），随后每隔一天更换一次培养基。因此，取出旧培养基，每孔加入 1 mL PSC 生成培养基。
    注意:最多可能需要 15 天才能出现第一个菌落。
  8. 当菌落大小超过 1 mm 时，选择单个 iPSC 菌落。为此，在显微镜下用p10移液管刮擦并小心地收集单个菌落。将菌落转移到涂有含有 750 μL PSC 培养基的基底膜基质的 12 孔板的新孔中。
    可选:在采摘前用DPBS冲洗板并用0.5mM EDTA处理1分钟可以支持进一步步骤的稳健培养。如果要培养细胞更长时间以等待以后出现的菌落，请不要执行此EDTA处理步骤。
  9. 如协议第4节所述，在37°C和5%CO2 下培养细胞，随后每隔一天更换一次培养基。当采摘的菌落直径达到 2 mm 时，继续常规 iPSC 传代，如实验方案第 5 节所述。

4. 介质更换

注意:培养基应每隔一天更换一次，直到菌落长到足够大以进行传代。

  1. 吸出旧培养基，每 12 孔板加入 750 μL 新鲜培养基。要切换到不同类型的培养基，请在传代后至少 1 天更换培养基。

5. 传代

注意:当iPSC集落长得足够大（直径>2毫米）或菌落即将相互接触时，应传代细胞。通常，iPSC 大约每 5 天分裂一次。使用团块传代（步骤5.1）进行常规维护，将单细胞传代（步骤5.2）用于需要确定数量细胞的实验。如果iPSCs分化很多，菌落采摘（步骤5.3）可以帮助提高培养物的纯度。

  1. 团块传代
    1. 通过每孔添加 500 μL 基底膜基质来制备基底膜基质包被的 12 孔板，并通过移动板来分配液体。将板在37°C孵育至少1小时。用500μLPSC培养基替换基底膜基质，并将板储存在37°C直至使用。
    2. 从培养的细胞中吸出培养基，并通过小心地加入 500 μL DPBS 来洗涤细胞。取出 DPBS 并向孔中加入 500 μL 0.5 mM EDTA。
    3. 将板在室温下孵育2-5分钟，直到菌落开始分离。在显微镜下仔细观察细胞。
    4. 当菌落的边缘开始剥落并且细胞之间的间隙变得可见时（图3A），取出EDTA并 小心地 加入500μL DPBS。
      注意:始终将移液器移液到孔的侧壁上，切勿直接移到细胞上，以免将细胞从板上分离。
    5. 吸出 DPBS 并使用 p1000 移液器用 500 μL PSC 培养基冲洗孔。上下移液1x-5x，将菌落分散成适当大小的团块（图3A）。 不要移液过多。
      注意:如果iPSCs不小心移液过多，请向培养基中加入10μM的岩石抑制剂Y-27632。这可以提高存活率，因为iPSCs不能作为单细胞存活。
    6. 将1/10-1/50的细胞团块悬浮液转移到新孔中。该比率取决于分裂前孔的汇合度、所需接种细胞的密度和 iPSC 克隆偏好。
    7. 通过轻轻地来回移动板几次，将团块均匀地分布在孔中。将板在37°C孵育至少30分钟，让团块附着。
    8. 如果观察到许多漂浮的死细胞，则用 750 μL PSC 培养基替换培养基;否则，加入 250 μL PSC 培养基。将板置于37°C和5%CO2 培养箱中。
      注意:30分钟后更换培养基至关重要，特别是对于不稳定的细胞系（例如，非人灵长类）。
    9. 每2-3天更换一次培养基，直到菌落长到足以传代。对于介质更改，请按照协议的步骤 4 进行操作。
  2. 单细胞传代
    1. 如步骤5.1.1所述制备基底膜基质包被的培养板，向PSC培养基中加入10μM Y-27632。
      可选:在传代前1-3小时向细胞中加入10μM Y-27632，以提高敏感细胞系的存活率。
    2. 吸出培养基并通过加入 500 μL DPBS 洗涤细胞。取出 DPBS 并向孔中加入 300 μL 分离溶液。
    3. 将板在37°C孵育5-10分钟。当在显微镜下观察到细胞充分脱离时，加入 700 μL PSC 培养基或 DPBS。
    4. 使用p1000移液器上下移液5-10倍，直到细胞解离成单个细胞。 不要移液过多，以防止细胞损伤。
    5. 将细胞悬液转移到含有至少 2 mL DPBS 的 15 mL 管中以稀释分离溶液。
    6. 将管以200 ×g 离心5分钟并完全吸出溶液，而不会破坏细胞沉淀。
    7. 将沉淀重悬于补充有 10 μM Y-27632 的 500 μL PSC 培养基中。
    8. 计数细胞并接种每个基底膜基质包被的12孔板的5，000-7，000个细胞，在步骤5.2.1中制备。
      注意:如果需要不同的细胞编号，请相应地更改为更大或更小的孔。
    9. 将板在37°C和5%CO2 下孵育至少30分钟，让细胞附着。
    10. 如果观察到许多死细胞，则用 750 μL PSC 培养基 + 10 μM Y-27632 替换培养基;否则，添加 250 μL + 10 μM Y-27632。
      注意:此步骤至关重要，特别是对于不稳定的细胞系（例如，非人灵长类）。
    11. 将板置于37°C和5%CO2 培养箱中。
    12. 分裂后1至2天将培养基更换为不含Y-27632的PSC培养基，以使细胞再次显示经典的集落形态（图3B）。
    13. 每2天更换一次培养基，直到菌落长得足够大。对于介质更改，请遵循协议的第 4 节。
  3. 通过菌落采集传代 iPSC
    1. 如步骤5.1.1所述制备基底膜基质包被的12孔。
    2. 吸出培养基并通过小心地加入 500 μL DPBS 来洗涤细胞。取出 DPBS 并向孔中加入 500 μL 0.5 mM EDTA。
    3. 将板在室温下孵育1-3分钟，并在显微镜下观察细胞，直到在边界上可见菌落的分离。
    4. 取出 EDTA 并 小心地 加入 500 μL DPBS。在向孔中缓慢加入 500 μL PSC 培养基之前吸出液体， 不要分离细胞。
    5. 使用p200移液器在显微镜下挑选所需的菌落，而不收集分化的细胞。为此，在吸收含有细胞的培养基的同时轻轻刮擦菌落。
    6. 将每个采摘的菌落转移到一个基底膜基质包被的孔中，如步骤5.3.1中制备。使用 p1000 移液器将细胞解离成小团块，方法是将细胞移液 2-5 倍。
    7. 将板在37°C和5%CO2下孵育30分钟，使团块附着。
    8. 如果观察到许多漂浮的死细胞，则用 750 μL PSC 培养基替换培养基;否则，加入 250 μL PSC 培养基。
      注意:30分钟后更换培养基至关重要，特别是对于不稳定的细胞系（例如，非人灵长类）。
    9. 将板置于37°C和5%CO2 培养箱中。
    10. 每2-3天更换一次培养基，直到菌落长到足以传代。为此，请遵循协议的第 4 节。

6. 冷冻尿细胞和iPSCs以长期储存

注意:通常，iPSCs在细胞冷冻培养基中以团块形式冷冻而不计数。移液应最少，以避免解离成单个细胞。对于泌尿细胞，通常，每管冷冻1.5×104 至3×104 个细胞，允许用户直接在12孔板的一个孔中解冻一个试管，而无需另一个计数步骤。

  1. 在 15 mL 管中制备 5 mL DPBS。
  2. 对于尿细胞的冷冻，请按照协议的步骤2.2-2.4进行操作。对于iPSC的冷冻，请按照团块传代方案中的步骤5.1.2-5.1.5进行操作。
  3. 将悬浮液转移到步骤6.1中制备的15 mL管中。对于尿细胞的冷冻，使用血细胞计数器计数 10 μL 细胞悬液。将细胞以200 ×g离心5分钟，并完全吸出上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于每管 400 μL 细胞冷冻培养基中，并将细胞分配到所需数量的冷冻管中。
  5. 立即将冷冻管转移到-80°C。 将冷冻的试管转移到-150°C冰箱或液氮中，在-80°C冷冻1天后长期储存。

7. 尿细胞和iPSCs的解冻

  1. 对于尿细胞的解冻，如协议的步骤1.1中所述，准备所需量的明胶包被的12孔。对于iPSC，制备基底膜基质包被的12孔板，如步骤5.1.1中所述。在这两种情况下，都不要将基质与培养基交换。
  2. 准备含有4mLDPBS的15 mL管，并将其储存在37°C。
  3. 将冷冻的细胞瓶快速放入37°C水浴中解冻，直到一块浮冰可见。
    注意:在水浴中孵育前后用乙醇擦拭冷冻管以避免污染。
  4. 向含冰悬浮液中加入 500 μL 用于泌尿细胞的 REMC 培养基或 500 μL 用于 iPSC 的 PSC 培养基，并立即将悬浮液转移到步骤 7.2 中制备的预热的 15 mL 管中。
  5. 将管以200× g 离心5分钟，并完全弃去上清液。
  6. 对于泌尿细胞，将沉淀重悬于 1 mL REMC 培养基中。对于 iPSC，小心地将沉淀重悬于 750 μL PSC 培养基中。 避免移液过多，以保持团块完好无损。
    可选:在培养基中补充 10 μM Y-27632 可支持 iPSC 解冻后的存活。
  7. 从步骤7.1中制备的12孔板中吸出基质，并小心地将细胞悬液转移到孔中。
  8. 将板在37°C和5%CO2 下置于培养箱中过夜。
  9. 第二天，用 PSC 培养基替换培养基，iPSC 不含 Y-27632，泌尿细胞用 REMC。
  10. 在培养箱中以37°C和5%CO2 培养细胞生长细胞。
  11. 每2-3天更换一次培养基，直到细胞长到足够大以进行传代。对于介质更改，请遵循协议的第 4 节。

8. 免疫细胞化学

注意:使用靶向多能性相关标志物（如 NANOG、OCT3/4、SOX2、TRA-1-60 和 EpCAM）的抗体进行免疫染色是新生成的 iPSC 使用最广泛的验证之一。有关抗体和稀释液的更多信息，请参见 材料表。

  1. 使用前 1-3 天将 iPSC 接种在适当数量的 12 孔板中。吸出培养基，通过加入 500 μL DPBS 洗涤细胞，然后取出 DPBS。每孔加入 400 μL 4% 多聚甲醛 （PFA），并在室温下固定细胞 15 分钟。
  2. 去除4%PFA，并用DPBS洗涤细胞3次。每孔加入 400 μL 封闭缓冲液，并在室温下孵育板 30 分钟。
  3. 吸出封闭缓冲液，并将用 400 μL 抗体稀释缓冲液 （ADB） 稀释的抗体加入每个孔中。将板在4°C孵育过夜。
  4. 取出含有一抗的ADB，并用DPBS洗涤细胞3次。
  5. 吸出DPBS，每孔加入400μL在ADB中稀释的二抗。将板在室温下在黑暗中孵育1小时。
  6. 取出 ADB，并用 DPBS 清洗细胞 3 倍。每孔加入 1 μg/mL 在 DPBS 中稀释的 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI），并在室温下孵育 3 分钟。
  7. 吸出DAPI溶液，并用DPBS洗涤细胞3倍。加入 500 μL DPBS 进行成像。

结果

从人和非人灵长类尿液中分离细胞时，可以在分离后直接鉴定不同类型的细胞。鳞状细胞以及各种较小的圆形细胞随尿液排出体外;女性尿液含有比男性尿液多得多的鳞状细胞（图1B - 第0天; 补充图S1）。在原代尿培养基中培养5天后，可以看到第一个贴壁增殖细胞（图1A，B - 第5天）。此时，每天用REMC增殖培养基替换一半的培养?...

讨论

iPSCs是有价值的细胞类型，因为它们允许 在体外产生原本无法接近的细胞类型。作为重编程的起始材料，例如，并非所有灵长类动物都能获得成纤维细胞，本文提出了一种从尿液来源的细胞中生成iPSCs的方案。这些细胞可以通过在培养基中补充广谱抗生素以非侵入性方式获得，甚至可以从非无菌灵长类动物尿液样本中获得。

协议中的几个关键步骤值得进一步讨论。首先...

披露声明

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

这项工作得到了DFG EN 1093/5-1（项目编号458247426）的支持。M.O.得到了JSPS海外研究奖学金的支持。所有图形都是用 BioRender.com 创建的。流式细胞术是在慕尼黑生物医学中心的核心设施流式细胞术的帮助下进行的。我们要感谢京都大学ASHBi的Makoto Shida和Tomoyo Muto对摄像的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody Stem Cell Technologies60064Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody Miltenyi Biotec130-122-965Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium)Nippon GeneticsBB01
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlucoseTH.GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o MagnesiumTH.GeyerL0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottomGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottomGreiner BIO-ONE227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 663441
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 incubatorFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinetKendro51017905
Human EGF, premium gradeMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersion 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibodyR&D SystemsMAB1368Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibodyR&D SystemsMAB1420Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibodyR&D SystemsMAB1195Dilution: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology4903SDilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent)Invivogenant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody Cell Signaling Technology2750SDilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basicPeproTech100-18B
Recombinant Human PDGF-ABPeproTech100-00AB
Refrigerated benchtop centrifugeSIGMA 4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900Cell Signaling Technology4900SDilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAbNEB4755SDilution: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)BiozolBYT-ORB153635
Antibody dilution bufferFor composition see the supplementary table S1
Blocking bufferFor composition see the supplementary table S1
REMC mediumFor composition see the supplementary table S1
Primary urine mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC culture mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC generation mediumFor composition see the supplementary table S1
Urine wash bufferFor composition see the supplementary table S1

参考文献

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