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Résumé

Le présent protocole décrit une méthode pour isoler, étendre et reprogrammer des cellules dérivées de l’urine de primates humains et non humains en cellules souches pluripotentes induites (CSPi), ainsi que des instructions pour le maintien sans alimentation des CSPi nouvellement générées.

Résumé

Les approches interspécifiques qui étudient les cellules souches pluripotentes des primates et leurs dérivés sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de la maladie, du développement et de l’évolution. Pour rendre les cellules souches pluripotentes induites par les primates (CSPi) plus accessibles, cet article présente une méthode non invasive pour générer des CSPi de primates humains et non humains à partir de cellules dérivées de l’urine, et leur maintien à l’aide d’une méthode de culture sans nourrisseur.

L’urine peut être échantillonnée dans un environnement non stérile (p. ex. la cage de l’animal) et traitée avec un cocktail d’antibiotiques à large spectre pendant la culture cellulaire primaire afin de réduire efficacement la contamination. Après multiplication des cellules dérivées de l’urine, les CSPi sont générées par une méthode de transduction modifiée d’un système vectoriel du virus Sendai disponible dans le commerce. Les premières colonies d’iPSC peuvent déjà être visibles après 5 jours, et peuvent être cueillies après 10 jours au plus tôt. Le passage systématique d’amas avec tampon de dissociation sans enzyme soutient la pluripotence des CSPi générées pendant plus de 50 passages.

Introduction

Les comparaisons génomiques des primates humains et non humains (PNH) sont cruciales pour comprendre notre histoire évolutive et l’évolution des traits spécifiques à l’homme1. De plus, ces comparaisons permettent d’inférer la fonction en identifiant les séquences d’ADN conservées2, par exemple, pour prioriser les variantes associées à la maladie3. Les comparaisons de phénotypes moléculaires tels que les niveaux d’expression génique sont cruciales pour mieux interpréter les comparaisons génomiques et découvrir, par exemple, les différences phénotypiques cellulaires. En outre, ils ont - comme les comparaisons au niveau de l’ADN - le potentiel de déduire la pertinence fonctionnelle, et donc de mieux interpréter la variation médicalement pertinente chez l’homme4. L’incorporation de données phénotypiques moléculaires complètes dans ces études comparatives nécessite des ressources biologiques appropriées (c.-à-d. des cellules orthologues pour toutes les espèces). Cependant, des raisons éthiques et pratiques rendent difficile, voire impossible, l’accès à ces cellules comparables, en particulier pendant le développement. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération de tels types de cellules inaccessibles in vitro5,6, sont expérimentalement accessibles et ont été utilisées pour des comparaisons avec les primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Pour générer des CSPi, il faut acquérir les cellules primaires à reprogrammer. Les cellules isolées de l’urine ont l’avantage de pouvoir être prélevées de manière non invasive chez les primates et de pouvoir être facilement reprogrammées, probablement en raison de leurs profils moléculaires semblables à ceux des cellules souches15. Les conditions de culture pour maintenir les CSPi des primates sont aussi importantes que la reprogrammation; Classiquement, la culture de cellules souches pluripotentes humaines nécessitait un milieu non défini à base de sérum et une co-culture de fibroblastes embryonnaires de souris - appelés cellules nourricières - qui fournissent des nutriments essentiels et un échafaudage pour les cellules souches embryonnaires (CSE)16. Depuis la mise au point de systèmes de culture chimiquement définis et sans alimentation17,18, il existe maintenant diverses options de milieux et de matrices de culture iPSC disponibles dans le commerce. Cependant, la plupart de ces conditions de culture ont été optimisées pour les CSE et les CSPi humaines et, par conséquent, pourraient moins bien fonctionner dans la culture des CSPi des PSN. Dans ce protocole vidéo, nous fournissons des instructions pour générer et maintenir des CSPi humaines et de PSP de PSN dérivées de cultures de cellules urinaires.

Depuis le premier rapport de génération de CSPi par l’expression forcée de facteurs définis dans les fibroblastes en 2006, cette méthode a été appliquée à de nombreux types cellulaires différents d’origines diverses 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Parmi eux, seules les cellules dérivées de l’urine peuvent être obtenues de manière totalement non invasive. Sur la base du protocole précédemment décrit par Zhou et al.33, on peut isoler et développer des cellules à partir d’urine de primates même à partir d’échantillons non stériles, en complétant des antibiotiques à large spectre15. Notamment, les cellules dérivées de l’urine échantillonnées par ce protocole présentent un potentiel élevé de production de CSPi, dans un laps de temps plus court (les colonies deviennent visibles en 5-15 jours) que la reprogrammation conventionnelle des fibroblastes (20-30 jours, selon notre expérience), et avec un taux de réussite suffisamment élevé. Ces cellules dérivées de l’urine ont été classées comme la population mixte de cellules souches mésenchymateuses et de cellules épithéliales de la vessie, provoquant une efficacité de reprogrammation élevée15.

En plus de la variation des cellules primaires, les méthodes de reprogrammation pour générer des CSPi varient également en fonction du but de l’utilisation. Les procédures conventionnelles de reprogrammation des cellules somatiques humaines ont été réalisées par la surexpression de facteurs de reprogrammation avec des vecteurs rétrovirus ou lentivirus, ce qui a permis l’intégration de l’ADN exogène dans le génome 5,34,35. Pour garder les CSPi générées génomiquement intactes, les chercheurs ont mis au point une grande variété de systèmes de non-intégration - vecteur PiggyBac36,37 excisable, vecteur épisomique38,39, vecteurs de virus non intégrateurs tels que le virus Sendai 40 et l’adénovirus 41, transfection d’ARNm 42, transfection de protéines 43,44 et traitement de composés chimiques 45. En raison de l’efficacité et de la facilité de manipulation, les vecteurs de reprogrammation basés sur le virus Sendai sont utilisés dans ce protocole. L’infection des cellules primaires est réalisée dans une culture en suspension de cellules et de virus de 1 h à une multiplicité d’infection (MOI) de 5 avant le placage. Cette étape modifiée pourrait augmenter la probabilité de contact entre les surfaces cellulaires et les virus, par rapport à la méthode conventionnelle dans laquelle les virus sont ajoutés directement à la culture cellulaire adhérente, et ainsi produire plus de colonies de CSPi15.

La transmission des cellules souches pluripotentes humaines et des PSN peut se faire par passage d’agglomérats et par passage unicellulaire. L’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) est un agent chélatant rentable qui lie les ions calcium et magnésium et empêche ainsi l’activité adhérente de la cadhérine et de l’intégrine. L’EDTA est également utilisé comme réactif de dissociation sélectif et léger, car les cellules indifférenciées se détachent devant les cellules différenciées en raison de leurs différentes molécules d’adhésion. La dissociation complète induit la mort cellulaire massive des CSPi des primates via l’hyperactivation de la myosine médiée par la bobine enroulée associée à Rho / Rho contenant la protéine kinase (Rho / Rock). Par conséquent, la supplémentation du milieu de culture avec un inhibiteur de Rho/Rock est essentielle pour les expériences qui nécessitent des cellules individuelles en suspension46,47. Dans ce protocole, nous recommandons le passage par agrégats comme méthode de passage de routine et recommandons le passage d’une seule cellule uniquement lorsque cela est nécessaire, par exemple lorsque l’ensemencement de numéros de cellules définis est nécessaire, ou pendant le sous-clonage.

Protocole

Cette procédure expérimentale a été approuvée par le comité d’éthique responsable de l’expérimentation humaine (20-122, Ethikkommission LMU München). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes.
REMARQUE : L’approbation du comité d’éthique approprié doit être obtenue avant d’entreprendre des expériences portant sur des échantillons humains et des échantillons de PSN. Toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées conformément aux lignes directrices et aux règlements pertinents. Chacune des étapes suivantes doit être effectuée en utilisant une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique. Toutes les compositions de tampons et de supports se trouvent dans le tableau supplémentaire S1. Assurez-vous que tous les fluides sont chauffés à température ambiante (22 °C) avant d’être ajoutés aux cellules. Chaque étape de centrifugation doit être effectuée à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Isolement de cellules à partir d’échantillons d’urine

MISE EN GARDE : S’assurer que les donneurs humains sont exempts du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), du virus de l’hépatite B (VHB) et du virus de l’hépatite C (VHC). Dans le cas des PSN, assurez-vous que les donneurs ou cellules possibles sont exempts d’agents pathogènes spécifiques : le virus B (VB), le virus de l’immunodéficience simienne (SIV), le bêtarétrovirus simien (VRS) et le virus lymphotrope à cellules T simiennes (VLV).

  1. Préparez une plaque de 12 puits recouverte de gélatine en ajoutant 500 μL de gélatine à 0,2 % par puits, et répartissez le liquide en déplaçant la plaque. Placer à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant d’être nécessaire.
  2. Prélever des échantillons d’urine humaine dans des tubes coniques de 50 mL. Pour les primates, prélevez l’urine du sol de l’animalerie avec une seringue.
    REMARQUE : Un volume de 5 mL d’urine s’est avéré suffisant pour isoler au moins une colonie dans 42 % des tentatives. Cependant, l’utilisation d’un volume plus élevé de ~50 mL d’urine est recommandée pour augmenter les chances d’isoler les colonies. L’urine des PSN doit être échantillonnée aussi fraîche que possible, de préférence immédiatement après la miction. Le stockage des échantillons d’urine à 4 °C pendant 4 h n’a pas eu d’effet négatif sur le taux de réussite du protocole, mais des temps de conservation plus longs n’ont pas été testés.
  3. Centrifuger le tube contenant de l’urine à 400 × g pendant 10 minutes et aspirer soigneusement le surnageant, en laissant environ 1 mL dans le tube.
  4. Remettez la pastille en suspension dans le résidu de 1 mL de liquide. Regroupez les suspensions dans un tube si plusieurs tubes d’urine ont été recueillis.
  5. Laver les cellules en ajoutant 10 mL de tampon de lavage d’urine (voir le tableau supplémentaire S1) contenant 2,5 μg/mL d’amphotéricine dans le tube, et mélanger soigneusement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique.
  6. Centrifuger le tube à 200 × g pendant 10 minutes et aspirer soigneusement le surnageant, en laissant environ <0,2 mL dans le tube.
  7. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu urinaire primaire (voir le tableau supplémentaire S1) contenant 0,5 μg/mL d’amphotéricine par 50 mL d’urine initialement traitée (remise en suspension dans 1 mL, même si moins de 50 mL d’urine ont été traitées).
  8. Aspirer la gélatine des puits (préparée à l’étape 1.1) et plaquer 1 mL de la suspension de l’étape 1.7 dans un puits d’une plaque de 12 puits. Répéter pour autant de puits que désiré, ou pour autant de mililitres de suspension disponibles.
    Facultatif : Pour éviter la contamination provenant du prélèvement d’échantillons insalubres, ajouter 100 μg/mL de réactif antimicrobien aux cellules à partir de maintenant, jusqu’au premier passage.
  9. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 .
  10. Ajouter 1 mL de milieu urinaire primaire par puits par jour jusqu’au jour 5, sans enlever le milieu existant.
  11. Le jour 5, aspirer 4 mL de milieu de la plaque, ce qui laisse environ 1 mL de milieu. Ajouter 1 mL de milieu REMC (voir le tableau supplémentaire S1) par puits pour obtenir un mélange 1:1 avec le nouveau milieu de culture.
  12. Remplacer la moitié du milieu par un milieu REMC tous les jours jusqu’à l’apparition des premières colonies (Figure 1A, B). Par conséquent, retirez 1 mL d’ancien milieu et ajoutez 1 mL de milieu REMC frais par puits.

2. Expansion des cellules urinaires

REMARQUE: Le passage des cellules urinaires doit être effectué avant que la culture n’atteigne 90% de confluence.

  1. Préparer la quantité désirée de plaques à 12 puits recouvertes de gélatine, comme indiqué à l’étape 1.1.
  2. Aspirer l’ancien milieu et laver les cellules en ajoutant 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
  3. Aspirer le DPBS et ajouter 300 μL d’enzyme de dissociation 0,5x diluée avec DPBS. Incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min.
  4. Ajouter 700 μL de milieu REMC pour arrêter la réaction enzymatique. Pipeter doucement la suspension à l’aide d’une pipette P1000 jusqu’à ce que les cellules soient dissociées en cellules individuelles.
  5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min.
  6. Aspirer délicatement le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu REMC.
  7. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules (un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé).
  8. Pour l’expansion des cellules urinaires, plaquer 1,5 × 10 4 à 3 × 104 cellules dans 1 mL de milieu REMC dans une plaque de 12 puits recouverte de gélatine à 0,2 %.
  9. Effectuez les changements de milieu suivants tous les deux jours jusqu’à ce que la culture atteigne 80% à 90% de confluence. Par conséquent, aspirez l’ancien milieu et ajoutez 1 mL de milieu REMC frais.

3. Génération de CSPi par infection par le vecteur du virus Sendai

Remarque : Pour le flux de travail de la procédure de reprogrammation, voir la figure 2A. Les cellules urinaires utilisées pour la reprogrammation doivent être aussi jeunes que possible, mais une perte remarquable d’efficacité de reprogrammation n’est pas observée avant le passage 4. Le kit de reprogrammation du virus Sendai doit être utilisé dans une installation BL-2. Manipulez les virus sous une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire et utilisez toujours l’équipement de sécurité approprié pour prévenir l’exposition des muqueuses.

  1. Préparer une plaque de 12 puits revêtue d’une matrice de membrane basale en ajoutant 500 μL de matrice membranaire basale par puits, et distribuer le liquide en déplaçant la plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h et remplacer la matrice membranaire basale par 900 μL de milieu REMC. Conserver la plaque à 37 °C jusqu’à utilisation.
  2. Décongelez rapidement les composants du kit de reprogrammation Sendai au bain-marie à 37 °C. Mélanger les virus Sendai (polycistronique KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC et KLF4) avec un MOI de 5 et ajouter un milieu REMC jusqu’à 100 μL. Utilisez l’équation (1) :
    figure-protocol-7709
    REMARQUE : Comme les titres de virus diffèrent d’un lot à l’autre, vérifiez toujours le titre dans le certificat d’analyse fourni par le fabricant.
    Facultatif : Utiliser le virus Sendai de la protéine fluorescente verte (GFP) en plus comme témoin positif de l’efficacité de la transduction. Pour cela, préparez 3,5 × 104 cellules supplémentaires dans un tube séparé à l’étape 3.3.
  3. Pour la dissociation des cellules urinaires, suivez les étapes 2.2-2.4. Compter les cellules à l’aide du compteur de cellules et transférer 7 × 104 cellules urinaires dans un tube de 1,5 mL.
  4. Centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min, et retirer délicatement le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Remettez la pastille en suspension dans 100 μL du mélange SeV préparé à l’étape 3.2. Incuber le tube pendant 1 h à 37 °C pour l’infection en suspension.
  5. Plaquer la suspension sur les plaques à 12 puits revêtues de matrice de membrane basale qui ont été préparées à l’étape 3.1. Habituellement, la plaque 1 × 10 4 et 2,5 × 104 cellules par puits en double.
  6. Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO2. Remplacer le milieu par 1 mL de milieu REMC frais 24 h après la transduction et le jour 3.
  7. Le jour 5 après la transduction, remplacer le milieu par le milieu de génération de CSP (voir le tableau supplémentaire S1), puis changer de milieu tous les deux jours. Par conséquent, retirez l’ancien milieu et ajoutez 1 mL de milieu de génération de CSP par puits.
    REMARQUE: Cela peut prendre jusqu’à 15 jours jusqu’à ce que les premières colonies apparaissent.
  8. Choisissez des colonies individuelles de CSPi lorsque la taille de la colonie dépasse 1 mm. Pour ce faire, grattez et collectez soigneusement une seule colonie avec une pipette p10 au microscope. Transférer la colonie dans un nouveau puits d’une plaque de 12 puits recouverte d’une matrice membranaire basale contenant 750 μL de milieu de culture PSC.
    Facultatif : Le rinçage de la plaque avec du DPBS et le traitement pendant 1 min avec 0,5 mM d’EDTA avant la cueillette pourraient soutenir la culture robuste des étapes ultérieures. Si les cellules doivent être cultivées plus longtemps pour attendre l’émergence ultérieure de colonies, n’effectuez pas cette étape de traitement à l’EDTA.
  9. Faire pousser les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 avec des changements de milieu subséquents tous les deux jours, comme indiqué dans la section 4 du protocole. Lorsque la colonie prélevée atteint un diamètre de 2 mm, poursuivre le passage de routine des CSPi, comme expliqué à la section 5 du protocole.

4. Changement moyen

NOTE: Le milieu de culture doit être changé tous les deux jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer.

  1. Aspirer l’ancien milieu et ajouter 750 μL du milieu frais par plaque de 12 puits. Pour passer à un autre type de milieu, remplacez le milieu au moins 1 jour après le passage.

5. Passage

NOTE: Les cellules doivent être traversées lorsque les colonies d’iPSC deviennent suffisamment grandes (diamètre > 2 mm) ou que les colonies sont sur le point de se toucher. Habituellement, les CSPi peuvent être fractionnées environ tous les 5 jours. Utiliser le passage en agrumeaux (étape 5.1) pour l’entretien de routine et le passage à cellule unique (étape 5.2) pour les expériences où un nombre défini de cellules est nécessaire. Dans le cas où les CSPi se différencient beaucoup, la cueillette des colonies (étape 5.3) peut aider à améliorer la pureté des cultures.

  1. Passage en groupe
    1. Préparer une plaque de 12 puits revêtue d’une matrice de membrane basale en ajoutant 500 μL de matrice membranaire basale par puits, et distribuer le liquide en déplaçant la plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h. Remplacer la matrice membranaire basale par 500 μL de milieu de culture PSC et entreposer la plaque à 37 °C jusqu’à utilisation.
    2. Aspirer le milieu des cellules cultivées et laver les cellules en ajoutant soigneusement 500 μL de DPBS. Retirez le DPBS et ajoutez 500 μL d’EDTA 0,5 mM dans le puits.
    3. Incuber la plaque à TA pendant 2-5 min, jusqu’à ce que les colonies commencent à se détacher. Observez attentivement les cellules au microscope.
    4. Lorsque les bords des colonies commencent à se décoller et que les espaces entre les cellules deviennent visibles (Figure 3A), retirez l’EDTA et ajoutez soigneusement 500 μL de DPBS.
      REMARQUE: Toujours pipeter contre la paroi latérale du puits et jamais directement sur les cellules, afin de ne pas détacher les cellules de la plaque.
    5. Aspirer le DPBS et rincer le puits avec 500 μL de milieu de culture PSC à l’aide d’une pipette p1000. Pipeter de haut en bas de 1x-5x pour disperser les colonies en touffes de taille appropriée (figure 3A). Ne pipette pas trop.
      REMARQUE: Si les CSPi sont accidentellement trop pipetées, ajouter 10 μM d’inhibiteur de roche Y-27632 au milieu. Cela peut améliorer la survie, car les CSPi ne sont pas capables de survivre en tant que cellules uniques.
    6. Transférer 1/10-1/50 de la suspension de l’amas de cellules dans les nouveaux puits. Le rapport dépend de la confluence du puits avant la division, de la densité souhaitée des cellules ensemencées et de la préférence clonale iPSC.
    7. Répartir les touffes uniformément dans le puits en déplaçant doucement la plaque d’avant en arrière plusieurs fois. Incuber la plaque pendant au moins 30 min à 37 °C pour laisser les touffes se fixer.
    8. Remplacer le milieu par 750 μL de milieu de culture PSC si de nombreuses cellules mortes flottantes sont observées; sinon, ajouter 250 μL de milieu de culture PSC. Placer la plaque à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
      REMARQUE : Le remplacement du milieu après 30 minutes est essentiel, en particulier pour les lignées cellulaires instables (p. ex. PSN).
    9. Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer. Pour un changement moyen, suivez l’étape 4 du protocole.
  2. Passage unicellulaire
    1. Préparer la plaque de culture recouverte de matrice membranaire basale, comme indiqué à l’étape 5.1.1, en ajoutant 10 μM Y-27632 au milieu de culture PSC.
      Facultatif : Ajouter 10 μM Y-27632 aux cellules 1 à 3 h avant le passage pour améliorer la survie des lignées cellulaires sensibles.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant 500 μL de DPBS. Retirez le DPBS et ajoutez 300 μL de solution de détachement dans les puits.
    3. Incuber la plaque à 37 °C pendant 5-10 min. Lorsque le détachement suffisant des cellules est observé au microscope, ajouter 700 μL de milieu de culture PSC ou DPBS.
    4. Pipeter de haut en bas 5-10x à l’aide d’une pipette p1000 jusqu’à ce que les cellules soient dissociées en cellules individuelles. Ne pas trop pipetter, afin d’éviter les dommages cellulaires.
    5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL contenant au moins 2 mL de DPBS pour diluer la solution de détachement.
    6. Centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min et aspirer complètement la solution, sans perturber la pastille cellulaire.
    7. Resuspendre la pastille dans 500 μL de milieu de culture PSC complété par 10 μM Y-27632.
    8. Compter les cellules et ensemencer 5 000 à 7 000 cellules par plaque à 12 puits revêtue d’une matrice basale à membrane, préparée à l’étape 5.2.1.
      REMARQUE: Si un numéro de cellule différent est nécessaire, changez pour un puits plus grand ou plus petit en conséquence.
    9. Incuber la plaque pendant au moins 30 min à 37 °C et 5% de CO2 pour laisser les cellules se fixer.
    10. Remplacer le milieu par 750 μL de milieu de culture PSC + 10 μM Y-27632 si de nombreuses cellules mortes sont observées; sinon, ajouter 250 μL + 10 μM Y-27632.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle, en particulier pour les lignées cellulaires instables (p. ex. PSN).
    11. Placer la plaque à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
    12. Changer le milieu en milieu de culture PSC sans Y-27632 1 à 2 jours après la division, pour permettre aux cellules d’afficher à nouveau la morphologie classique de la colonie (Figure 3B).
    13. Changez le milieu tous les 2 jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes. Pour un changement moyen, suivez la section 4 du protocole.
  3. Transmission des CSPi par prélèvement de colonies
    1. Préparer les 12 puits revêtus de matrice de membrane basale comme indiqué à l’étape 5.1.1.
    2. Aspirer le milieu et laver les cellules en ajoutant soigneusement 500 μL de DPBS. Retirez le DPBS et ajoutez 500 μL d’EDTA 0,5 mM dans le puits.
    3. Incuber la plaque à TA pendant 1-3 min et observer les cellules au microscope, jusqu’à ce que le détachement de la colonie soit visible sur les bords.
    4. Retirez l’EDTA et ajoutez délicatement 500 μL de DPBS. Aspirer le liquide avant d’ajouter lentement 500 μL de milieu de culture PSC au puits, sans détacher les cellules.
    5. Utilisez une pipette p200 pour prélever la colonie souhaitée au microscope, sans collecter les cellules différenciées. Pour ce faire, grattez doucement la colonie tout en reprenant le milieu contenant les cellules.
    6. Transférer chaque colonie prélevée dans un puits recouvert d’une matrice membranaire basale, tel que préparé à l’étape 5.3.1. Dissocier les cellules en petits amas à l’aide d’une pipette p1000, en pipetant les cellules 2-5x.
    7. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2, en laissant les touffes se fixer.
    8. Remplacer le milieu par 750 μL de milieu de culture PSC si de nombreuses cellules mortes flottantes sont observées; sinon, ajouter 250 μL de milieu de culture PSC.
      REMARQUE : Le remplacement du milieu après 30 minutes est essentiel, en particulier pour les lignées cellulaires instables (p. ex. PSN).
    9. Placer la plaque à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
    10. Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour passer. Pour ce faire, suivez la section 4 du protocole.

6. Congélation des cellules urinaires et des CSPi pour stockage à long terme

REMARQUE : Habituellement, les CSPi sont congelées sous forme de touffes dans un milieu de congélation cellulaire sans compter. Le pipetage doit être minime, pour éviter la dissociation en cellules individuelles. Pour les cellules urinaires, 1,5 × 104 à 3 × 104 cellules sont congelées par tube, ce qui permet à l’utilisateur de décongeler un tube directement dans un puits d’une plaque de 12 puits sans avoir besoin d’une autre étape de comptage.

  1. Préparer 5 mL de DPBS dans un tube de 15 mL.
  2. Pour la congélation des cellules urinaires, suivez les étapes 2.2-2.4 du protocole. Pour la congélation des CSPi, suivez les étapes 5.1.2 à 5.1.5 du protocole de passage en aggloméré.
  3. Transférer la suspension dans le tube de 15 mL préparé à l’étape 6.1. Pour la congélation des cellules urinaires, comptez 10 μL de la suspension cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 × g et aspirer complètement le surnageant.
  4. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 400 μL de milieu de congélation cellulaire par tube et distribuez les cellules à la quantité souhaitée de cryotubes.
  5. Transférer immédiatement les cryotubes à -80 °C. Transférer les tubes congelés dans un congélateur à -150 °C ou de l’azote liquide 1 jour après la congélation à -80 °C pour un stockage à long terme.

7. Décongélation des cellules urinaires et des CSPi

  1. Pour la décongélation des cellules urinaires, préparer la quantité souhaitée de 12 puits recouverts de gélatine, comme indiqué à l’étape 1.1 du protocole. Pour les CSPi, préparer les plaques à 12 puits revêtues d’une matrice de membrane basale, comme indiqué à l’étape 5.1.1. Dans les deux cas, n’échangez pas la matrice avec le support.
  2. Préparez un tube de 15 mL contenant 4 mL de DPBS et conservez-le à 37 °C.
  3. Placez rapidement un flacon congelé de cellules dans un bain-marie à 37 °C pour la décongélation, jusqu’à ce qu’un morceau de glace flottante devienne visible.
    REMARQUE: Essuyez le cryotube avec de l’éthanol avant et après l’incubation au bain-marie pour éviter les contaminations.
  4. Ajouter 500 μL de milieu REMC pour les cellules urinaires, ou 500 μL de milieu de culture PSC pour CSPi à la suspension contenant de la glace, et transférer immédiatement la suspension dans le tube préchauffé de 15 mL préparé à l’étape 7.2.
  5. Centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min et jeter complètement le surnageant.
  6. Pour les cellules urinaires, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu REMC. Pour les CSPi, remettre soigneusement la pastille en suspension dans 750 μL de milieu de culture PSC. Évitez de trop pipeter, afin de garder les touffes intactes.
    Facultatif : La supplémentation du milieu avec 10 μM Y-27632 peut favoriser la survie des CSPi après décongélation.
  7. Aspirer la matrice des plaques de 12 puits préparées à l’étape 7.1 et transférer délicatement la suspension cellulaire dans le puits.
  8. Placer la plaque pendant la nuit à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
  9. Le lendemain, remplacer le milieu par un milieu de culture PSC, sans Y-27632 pour les CSPi et par REMC pour les cellules urinaires.
  10. Cultiver les cellules à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur.
  11. Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les cellules deviennent assez grandes pour passer. Pour un changement moyen, suivez la section 4 du protocole.

8. Immunocytochimie

REMARQUE : L’immunomarquage avec des anticorps ciblant des marqueurs liés à la pluripotence tels que NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 et EpCAM est l’une des validations les plus largement utilisées des CSPi nouvellement générées. De plus amples informations sur les anticorps et les dilutions peuvent être trouvées dans le tableau des matériaux.

  1. Plaquer les CSPi 1 à 3 jours avant l’utilisation dans un nombre approprié de plaques à 12 puits. Aspirer le milieu, laver les cellules en ajoutant 500 μL de DPBS et retirer le DPBS. Ajouter 400 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % par puits, et fixer les cellules pendant 15 min à TA.
  2. Retirez le PFA à 4% et lavez les cellules 3x avec DPBS. Ajouter 400 μL de tampon de blocage par puits, et incuber la plaque pendant 30 min à TA.
  3. Aspirer le tampon de blocage et ajouter les anticorps dilués dans 400 μL de tampon de dilution d’anticorps (ADB) à chaque puits. Incuber la plaque à 4 °C pendant une nuit.
  4. Retirer l’ADB contenant les anticorps primaires et laver les cellules 3x avec DPBS.
  5. Aspirer le DPBS et ajouter 400 μL d’anticorps secondaires dilués dans l’ADB par puits. Incuber la plaque pendant 1 h à TA dans l’obscurité.
  6. Retirez l’ADB et lavez les cellules 3x avec DPBS. Ajouter 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué dans du DPBS par puits, et incuber pendant 3 min à TA.
  7. Aspirez la solution DAPI et lavez la cellule 3x avec DPBS. Ajouter 500 μL de DPBS pour l’imagerie.

Résultats

Lors de l’isolement de cellules de l’urine humaine et de l’urine de PSN, différents types de cellules peuvent être identifiés directement après l’isolement. Les cellules squameuses, ainsi que diverses cellules rondes plus petites, sont excrétées avec l’urine; l’urine féminine contient beaucoup plus de cellules malpighiennes que l’urine masculine (Figure 1B - Jour 0; Figure supplémentaire S1). Après 5 jours de culture dans un milieu urinaire primaire, l...

Discussion

Les CSPi sont des types cellulaires précieux car ils permettent la génération de types cellulaires autrement inaccessibles in vitro. Comme les matériaux de départ pour la reprogrammation, par exemple, les fibroblastes ne sont pas facilement disponibles chez toutes les espèces de primates, cet article présente un protocole pour la génération de CSPi à partir de cellules dérivées de l’urine. Ces cellules peuvent être obtenues de manière non invasive, même à partir d’échantillons d’urine de p...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par DFG EN 1093/5-1 (numéro de projet 458247426). M.O. a été soutenu par JSPS Overseas Research Fellowship. Toutes les figurines ont été créées avec BioRender.com. La cytométrie en flux a été réalisée avec l’aide de la cytométrie en flux de l’installation centrale du centre biomédical de Munich. Nous tenons à remercier Makoto Shida et Tomoyo Muto de l’ASHBi, Université de Kyoto, pour leur soutien à la vidéographie.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody Stem Cell Technologies60064Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody Miltenyi Biotec130-122-965Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium)Nippon GeneticsBB01
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlucoseTH.GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o MagnesiumTH.GeyerL0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottomGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottomGreiner BIO-ONE227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 663441
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 incubatorFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinetKendro51017905
Human EGF, premium gradeMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersion 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibodyR&D SystemsMAB1368Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibodyR&D SystemsMAB1420Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibodyR&D SystemsMAB1195Dilution: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology4903SDilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent)Invivogenant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody Cell Signaling Technology2750SDilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basicPeproTech100-18B
Recombinant Human PDGF-ABPeproTech100-00AB
Refrigerated benchtop centrifugeSIGMA 4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900Cell Signaling Technology4900SDilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAbNEB4755SDilution: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)BiozolBYT-ORB153635
Antibody dilution bufferFor composition see the supplementary table S1
Blocking bufferFor composition see the supplementary table S1
REMC mediumFor composition see the supplementary table S1
Primary urine mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC culture mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC generation mediumFor composition see the supplementary table S1
Urine wash bufferFor composition see the supplementary table S1

Références

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