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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo per isolare, espandere e riprogrammare cellule derivate dall'urina di primati umani e non umani in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), nonché istruzioni per il mantenimento senza alimentatore delle iPSC appena generate.

Abstract

Gli approcci interspecie che studiano le cellule staminali pluripotenti dei primati e i loro derivati sono cruciali per comprendere meglio i meccanismi molecolari e cellulari della malattia, dello sviluppo e dell'evoluzione. Per rendere le cellule staminali pluripotenti indotte dai primati (iPSC) più accessibili, questo articolo presenta un metodo non invasivo per generare iPSC di primati umani e non umani da cellule derivate dall'urina e il loro mantenimento utilizzando un metodo di coltura senza alimentatore.

L'urina può essere campionata da un ambiente non sterile (ad esempio, la gabbia dell'animale) e trattata con un cocktail antibiotico ad ampio spettro durante la coltura cellulare primaria per ridurre efficacemente la contaminazione. Dopo la propagazione delle cellule derivate dall'urina, le iPSC sono generate da un metodo di trasduzione modificato di un sistema vettoriale del virus Sendai disponibile in commercio. Le prime colonie di iPSC possono essere già visibili dopo 5 giorni e possono essere raccolte dopo 10 giorni al più presto. Il passaggio di routine del grumo con tampone di dissociazione privo di enzimi supporta la pluripotenza delle iPSC generate per più di 50 passaggi.

Introduzione

I confronti genomici dei primati umani e non umani (NHP) sono cruciali per comprendere la nostra storia evolutiva e l'evoluzione dei tratti specifici dell'uomo1. Inoltre, questi confronti consentono l'inferenza della funzione identificando sequenze di DNA conservate2, ad esempio, per dare priorità alle varianti associate alla malattia3. I confronti di fenotipi molecolari come i livelli di espressione genica sono cruciali per interpretare meglio i confronti genomici e scoprire, ad esempio, le differenze fenotipiche cellulari. Inoltre, hanno - analogamente ai confronti a livello del DNA - il potenziale per dedurre la rilevanza funzionale, e quindi per interpretare meglio la variazione clinicamente rilevante all'interno degli esseri umani4. L'incorporazione di dati fenotipici molecolari completi in questi studi comparativi richiede risorse biologiche appropriate (cioè cellule ortologhe tra le specie). Tuttavia, ragioni etiche e pratiche rendono difficile o impossibile accedere a tali cellule comparabili, specialmente durante lo sviluppo. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di tali tipi di cellule inaccessibili in vitro5,6, sono sperimentalmente accessibili e sono state utilizzate per confronti di primati 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Per generare iPSC, è necessario acquisire le cellule primarie da riprogrammare. Le cellule isolate dalle urine hanno il vantaggio di poter essere campionate in modo non invasivo dai primati e di poter essere facilmente riprogrammate, probabilmente a causa dei loro profili molecolari simili alle cellule staminali15. Le condizioni colturali per mantenere le iPSC dei primati sono importanti quanto la riprogrammazione; Classicamente, la coltura di cellule staminali pluripotenti umane richiedeva un mezzo non definito, basato sul siero e una co-coltura di fibroblasti embrionali di topo - le cosiddette cellule feeder - che forniscono nutrienti essenziali e un'impalcatura per le cellule staminali embrionali (ESC)16. Dopo lo sviluppo di sistemi di coltura chimicamente definiti e privi di alimentazione17,18, ci sono ora varie opzioni di terreni di coltura e matrici iPSC disponibili in commercio. Tuttavia, la maggior parte di queste condizioni di coltura sono state ottimizzate per ESC e iPSC umane, e quindi potrebbero funzionare meno bene nella coltura NHP iPSC. In questo protocollo video, forniamo istruzioni per generare e mantenere iPSC umane e NHP derivate da colture cellulari urinarie.

Dal primo rapporto sulla generazione di iPSC mediante l'espressione forzata di fattori definiti nei fibroblasti nel 2006, questo metodo è stato applicato a molti diversi tipi cellulari di varia origine 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Tra questi, solo le cellule derivate dall'urina possono essere ottenute in modo completamente non invasivo. Sulla base del protocollo precedentemente descritto da Zhou et al.33, è possibile isolare ed espandere le cellule dall'urina dei primati anche da campioni non sterili, integrando antibiotici ad ampio spettro15. In particolare, le cellule derivate dall'urina campionate da questo protocollo mostrano un alto potenziale di produrre iPSC, in un periodo di tempo più breve (le colonie diventano visibili in 5-15 giorni) rispetto alla riprogrammazione convenzionale dei fibroblasti (20-30 giorni, nella nostra esperienza) e con un tasso di successo sufficientemente elevato. Queste cellule derivate dall'urina sono state classificate come popolazione mista di cellule staminali mesenchimali simili e cellule epiteliali della vescica, causando l'elevata efficienza di riprogrammazione15.

Oltre alla variazione nelle celle primarie, anche i metodi di riprogrammazione per generare iPSC variano a seconda dello scopo di utilizzo. Le procedure convenzionali di riprogrammazione per le cellule somatiche umane sono state effettuate mediante la sovraespressione di fattori di riprogrammazione con vettori di retrovirus o lentivirus, che hanno permesso l'integrazione del DNA esogeno nel genoma 5,34,35. Per mantenere intatte le iPSC generate, i ricercatori hanno sviluppato un'ampia varietà di sistemi non di integrazione - vettore PiggyBac asportabile36,37, vettore episomiale38,39, vettori virali non integranti come il virus Sendai 40 e adenovirus 41, trasfezione mRNA42, trasfezione proteica 43,44 e trattamento con composti chimici 45. A causa dell'efficienza e della facilità di gestione, i vettori di riprogrammazione basati su virus Sendai vengono utilizzati in questo protocollo. L'infezione delle cellule primarie viene eseguita in una coltura in sospensione di 1 ora di cellule e virus a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 prima della placcatura. Questo passaggio modificato potrebbe aumentare la probabilità di contatto tra superfici cellulari e virus, rispetto al metodo convenzionale in cui i virus vengono aggiunti direttamente alla coltura cellulare aderente, e quindi produrre più colonie iPSC15.

Il passaggio delle cellule staminali pluripotenti umane e NHP può essere effettuato mediante passaggio di grumi e passaggio di singole cellule. L'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) è un agente chelante economico che lega gli ioni di calcio e magnesio e quindi impedisce l'attività aderente della caderina e dell'integrina. L'EDTA è anche usato come reagente di dissociazione lieve e selettiva, poiché le cellule indifferenziate si staccano prima delle cellule differenziate a causa delle loro diverse molecole di adesione. La dissociazione completa induce la morte cellulare massiccia delle iPSC dei primati attraverso l'iperattivazione della miosina mediata dalla bobina a spirale associata a Rho/Rho contenente la proteina chinasi (Rho/Rock). Pertanto, l'integrazione del terreno di coltura con un inibitore Rho/Rock è essenziale per esperimenti che richiedono singole cellule in sospensione46,47. In questo protocollo, raccomandiamo il clump passaging come metodo di passaggio di routine e raccomandiamo il passaging a singola cella solo quando è necessario, ad esempio, quando è richiesta la semina di numeri di celle definiti o durante la sub-clonazione.

Protocollo

Questa procedura sperimentale è stata approvata dal comitato etico responsabile sulla sperimentazione umana (20-122, Ethikkommission LMU München). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.
NOTA: L'approvazione deve essere ottenuta dal comitato etico appropriato prima di iniziare esperimenti relativi a campioni umani e NHP. Tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Ciascuno dei seguenti passaggi deve essere eseguito utilizzando una tecnica sterile in un armadio di sicurezza biologica. Tutte le composizioni tampone e dei supporti sono disponibili nella tabella supplementare S1. Assicurarsi che tutti i fluidi siano riscaldati a temperatura ambiente (22 °C) prima di essere aggiunti alle celle. Ogni fase di centrifugazione deve essere eseguita a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

1. Isolamento delle cellule da campioni di urina

ATTENZIONE: Assicurarsi che i donatori umani siano esenti da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV) e virus dell'epatite C (HCV). Per gli NHP, assicurarsi che i possibili donatori / cellule siano privi di agenti patogeni specifici: virus B (BV), virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV), betaretrovirus delle scimmie (SRV) e virus linfotropico delle cellule T delle scimmie (STLV).

  1. Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita di gelatina aggiungendo 500 μL di gelatina allo 0,2% per pozzetto e distribuire il liquido spostando la piastra. Porre a 37 °C per almeno 30 minuti prima del necessario.
  2. Raccogliere campioni di urina umana in provette coniche da 50 ml. Per i primati, raccogliere l'urina dal pavimento della struttura per animali con una siringa.
    NOTA: Un volume di 5 ml di urina si è dimostrato sufficiente per isolare almeno una colonia nel 42% dei tentativi. Tuttavia, si raccomanda l'utilizzo di un volume maggiore di ~ 50 ml di urina per aumentare la possibilità di isolare le colonie. L'urina NHP deve essere campionata il più fresca possibile, preferibilmente immediatamente dopo la minzione. La conservazione di campioni di urina a 4 °C per 4 ore non ha avuto alcun effetto negativo sul tasso di successo del protocollo, ma non sono stati testati tempi di conservazione più lunghi.
  3. Centrifugare il tubo contenente urina a 400 × g per 10 minuti e aspirare delicatamente il surnatante, lasciando circa 1 mL nel tubo.
  4. Risospendere il pellet nel residuo 1 mL di liquido. Raggruppare le sospensioni in un tubo se sono stati raccolti più tubi di urina.
  5. Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di tampone per il lavaggio delle urine (vedere Tabella supplementare S1) contenente 2,5 μg/mL di amfotericina al tubo e mescolare accuratamente la sospensione usando una pipetta sierologica.
  6. Centrifugare il tubo a 200 × g per 10 minuti e aspirare con cura il surnatante, lasciando circa <0,2 ml nel tubo.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno urinario primario (vedere Tabella supplementare S1) contenente 0,5 μg/mL di amfotericina per 50 mL di urina inizialmente trattata (risospendere in 1 ml, anche se sono stati trattati meno di 50 mL di urina).
  8. Aspirare la gelatina dai pozzetti (preparata al punto 1.1) e la piastra 1 mL della sospensione dal punto 1.7 in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti desiderati o per tutti i millilitri di sospensione disponibili.
    Facoltativo: per evitare la contaminazione derivante dalla raccolta di campioni non igienica, aggiungere 100 μg / ml di reagente antimicrobico alle cellule da qui in poi, fino al primo passaggio.
  9. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .
  10. Aggiungere 1 ml di terreno urinario primario per pozzetto al giorno fino al giorno 5, senza rimuovere il terreno esistente.
  11. Il giorno 5, aspirare 4 mL di terreno dalla piastra, lasciando circa 1 mL di mezzo. Aggiungere 1 mL di terreno REMC (vedere Tabella supplementare S1) per pozzetto per ottenere una miscela 1:1 con il nuovo terreno di coltura.
  12. Sostituire metà del terreno con terreno REMC ogni giorno fino alla comparsa delle prime colonie (Figura 1A, B). Pertanto, rimuovere 1 mL di vecchio terreno e aggiungere 1 mL di terreno REMC fresco per pozzetto.

2. Espansione delle cellule urinarie

NOTA: Il passaggio delle cellule urinarie deve essere condotto prima che la coltura raggiunga il 90% di confluenza.

  1. Preparare la quantità desiderata di piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina, come indicato nel passaggio 1.1.
  2. Aspirare il vecchio mezzo e lavare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS).
  3. Aspirare il DPBS e aggiungere 300 μL di enzima di dissociazione 0,5x diluito con DPBS. Incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
  4. Aggiungere 700 μL di terreno REMC per arrestare la reazione enzimatica. Pipettare delicatamente la sospensione usando una pipetta P1000 fino a quando le cellule non sono dissociate in singole celle.
  5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare la provetta a 200 × g per 5 minuti.
  6. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno REMC.
  7. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule (un emocitometro o un contatore automatico delle cellule).
  8. Per l'espansione delle cellule urinarie, la piastra 1,5 × 10 da 4 a 3 × 104 cellule in 1 ml di terreno REMC in una piastrada 12 pozzetti rivestita con gelatina allo 0,2%.
  9. Eseguire successive modifiche del mezzo a giorni alterni fino a quando la coltura raggiunge l'80% -90% di confluenza. Pertanto, aspirare il vecchio mezzo e aggiungere 1 mL di terreno REMC fresco.

3. Generazione di iPSC da parte dell'infezione da vettore del virus Sendai

Nota : per il flusso di lavoro della procedura di riprogrammazione, vedere la Figura 2A. Le cellule urinarie utilizzate per la riprogrammazione dovrebbero essere il più giovani possibile, ma una notevole perdita di efficienza di riprogrammazione non si osserva prima del passaggio 4. Il Sendai Virus Reprogramming Kit deve essere utilizzato in una struttura BL-2. Maneggiare i virus sotto un armadio di sicurezza biologica con flusso laminare e utilizzare sempre dispositivi di sicurezza appropriati per prevenire l'esposizione alle mucose.

  1. Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale aggiungendo 500 μL di matrice di membrana basale per pozzetto e distribuire il liquido spostando la piastra. Incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora e sostituire la matrice della membrana basale con 900 μL di terreno REMC. Conservare la piastra a 37 °C fino all'uso.
  2. Scongelare rapidamente i componenti del Sendai Reprogramming Kit a bagnomaria a 37 °C. Mescolare i virus Sendai (policistronico KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC e KLF4) con un MOI di 5 e aggiungere il mezzo REMC fino a 100 μL. Usa l'equazione (1):
    figure-protocol-7565
    NOTA: poiché i titoli dei virus differiscono tra i lotti, controllare sempre il titolo nel certificato di analisi fornito dal produttore.
    Opzionale: Utilizzare il virus Sendai della proteina fluorescente verde (GFP) in aggiunta come controllo positivo per l'efficienza di trasduzione. Per questo, preparare altre 3,5 × 104 celle in un tubo separato durante il passaggio 3.3.
  3. Per la dissociazione delle cellule urinarie, seguire i passaggi 2.2-2.4. Contare le cellule utilizzando il contatore delle cellule e trasferire 7 × 104 cellule urinarie in un tubo da 1,5 ml.
  4. Centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 100 μL della miscela SeV preparata nella fase 3.2. Incubare la provetta per 1 ora a 37 °C per l'infezione da sospensione.
  5. Placcare la sospensione sulle piastre a 12 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale preparate nella fase 3.1. Di routine, piastra 1 × 10 4 e 2,5 × 104 celle per pozzetto in duplicati.
  6. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2. Sostituire il terreno con 1 mL di terreno REMC fresco 24 ore dopo la trasduzione e il giorno 3.
  7. Il giorno 5 dopo la trasduzione, cambiare il mezzo in mezzo di generazione PSC (vedere Tabella supplementare S1), con successive variazioni del terreno a giorni alterni. Pertanto, rimuovere il vecchio mezzo e aggiungere 1 mL di terreno di generazione PSC per pozzetto.
    NOTA: possono essere necessari fino a 15 giorni prima che compaiano le prime colonie.
  8. Scegli le singole colonie iPSC quando la dimensione della colonia supera 1 mm. Per fare questo, raschiare e raccogliere con cura una singola colonia con una pipetta p10 al microscopio. Trasferire la colonia in un nuovo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti rivestita con una matrice di membrana basale contenente 750 μL di terreno di coltura PSC.
    Facoltativo: il risciacquo della piastra con DPBS e il trattamento per 1 minuto con 0,5 mM di EDTA prima della raccolta potrebbero supportare la coltura robusta di ulteriori passaggi. Se le cellule devono essere coltivate più a lungo per attendere le successive colonie emergenti, non eseguire questa fase di trattamento EDTA.
  9. Far crescere le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 con successive variazioni del mezzo a giorni alterni, come indicato nella sezione 4 del protocollo. Quando la colonia prelevata raggiunge un diametro di 2 mm, continuare con il passaggio iPSC di routine, come spiegato nella sezione 5 del protocollo.

4. Cambio medio

NOTA: Il terreno di coltura deve essere cambiato a giorni alterni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi da passare.

  1. Aspirare il vecchio mezzo e aggiungere 750 μL di terreno fresco per piastra a 12 pozzetti. Per passare a un diverso tipo di mezzo, sostituire il mezzo almeno 1 giorno dopo il passaggio.

5. Passaggio

NOTA: Le cellule devono essere fatte passare quando le colonie iPSC crescono abbastanza grandi (diametro > 2 mm), o le colonie stanno per toccarsi. Di routine, le iPSC possono essere suddivise circa ogni 5 giorni. Utilizzare il passa-aggregazione (fase 5.1) per la manutenzione ordinaria e il passaggio a singola cella (passaggio 5.2) per esperimenti in cui è necessario un numero definito di cellule. Nel caso in cui le iPSC si differenzino molto, la raccolta delle colonie (fase 5.3) può aiutare a migliorare la purezza delle colture.

  1. Passante a grumi
    1. Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale aggiungendo 500 μL di matrice di membrana basale per pozzetto e distribuire il liquido spostando la piastra. Incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora. Sostituire la matrice della membrana basale con 500 μL di terreno di coltura PSC e conservare la piastra a 37 °C fino all'uso.
    2. Aspirare il terreno dalle cellule in coltura e lavare le cellule aggiungendo con cura 500 μL di DPBS. Rimuovere il DPBS e aggiungere 500 μL di 0,5 mM EDTA al pozzetto.
    3. Incubare la piastra a RT per 2-5 minuti, fino a quando le colonie iniziano a staccarsi. Osservare attentamente le cellule al microscopio.
    4. Quando i bordi delle colonie iniziano a staccarsi e gli spazi tra le cellule diventano visibili (Figura 3A), rimuovere l'EDTA e aggiungere con attenzione 500 μL di DPBS.
      NOTA: Pipettare sempre contro la parete laterale del pozzetto e mai direttamente sulle celle, in modo da non staccare le celle dalla piastra.
    5. Aspirare il DPBS e lavare il pozzetto con 500 μL di terreno di coltura PSC utilizzando una pipetta p1000. Pipettare su e giù 1x-5x per disperdere le colonie in grumi di dimensioni appropriate (Figura 3A). Non pipetta troppo.
      NOTA: se le iPSC vengono accidentalmente pipettate troppo, aggiungere 10 μM di inibitore di roccia Y-27632 al mezzo. Ciò può migliorare la sopravvivenza, poiché le iPSC non sono in grado di sopravvivere come singole cellule.
    6. Trasferire 1/10-1/50 della sospensione del grumo di celle ai nuovi pozzi. Il rapporto dipende dalla confluenza del pozzo prima della scissione, dalla densità desiderata delle cellule seminate e dalla preferenza clonale iPSC.
    7. Distribuire uniformemente i grumi nel pozzetto spostando delicatamente la piastra avanti e indietro più volte. Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 37 °C per far aderire i grumi.
    8. Sostituire il terreno con 750 μL di terreno di coltura PSC se si osservano molte cellule morte galleggianti; in caso contrario, aggiungere 250 μL di terreno di coltura PSC. Porre la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
      NOTA: La sostituzione media dopo 30 minuti è fondamentale, specialmente per le linee cellulari instabili (ad esempio, NHP).
    9. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi per passare. Per modifiche medie, seguire il passaggio 4 del protocollo.
  2. Passaggio a cella singola
    1. Preparare la piastra di coltura rivestita con matrice di membrana basale, come indicato al punto 5.1.1, con l'aggiunta di 10 μM Y-27632 al terreno di coltura PSC.
      Opzionale: aggiungere 10 μM Y-27632 alle cellule 1-3 ore prima del passaggio per migliorare la sopravvivenza delle linee cellulari sensibili.
    2. Aspirare il mezzo e lavare le celle aggiungendo 500 μL di DPBS. Rimuovere il DPBS e aggiungere 300 μL di soluzione di distacco ai pozzetti.
    3. Incubare la piastra a 37 °C per 5-10 min. Quando si osserva un distacco sufficiente delle cellule al microscopio, aggiungere 700 μL di terreno di coltura PSC o DPBS.
    4. Pipettare su e giù 5-10 volte usando una pipetta p1000 fino a quando le cellule non sono dissociate in singole celle. Non pipettare troppo, al fine di prevenire danni alle cellule.
    5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente almeno 2 mL di DPBS per diluire la soluzione di distacco.
    6. Centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti e aspirare completamente la soluzione, senza interrompere il pellet cellulare.
    7. Risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura PSC integrato con 10 μM Y-27632.
    8. Contare le cellule e seminare 5.000-7.000 cellule per piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice di membrana basale, preparata al punto 5.2.1.
      NOTA: se è necessario un numero di cella diverso, passare a un pozzetto più grande o più piccolo di conseguenza.
    9. Incubare la piastra per almeno 30 minuti a 37 °C e al 5% di CO2 per consentire alle cellule di attaccarsi.
    10. Sostituire il terreno con 750 μL di terreno di coltura PSC + 10 μM Y-27632 se si osservano molte cellule morte; altrimenti, aggiungere 250 μL + 10 μM Y-27632.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale, specialmente per le linee cellulari instabili (ad esempio, NHPs).
    11. Porre la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
    12. Cambiare il terreno in terreno di coltura PSC senza Y-27632 da 1 a 2 giorni dopo la scissione, per consentire alle cellule di visualizzare nuovamente la morfologia classica della colonia (Figura 3B).
    13. Cambia il mezzo ogni 2 giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi. Per modifiche medie, seguire la sezione 4 del protocollo.
  3. Passaggio delle iPSC mediante raccolta delle colonie
    1. Preparare 12 pozzetti rivestiti di matrice di membrana basale come indicato al punto 5.1.1.
    2. Aspirare il mezzo e lavare le celle aggiungendo con cura 500 μL di DPBS. Rimuovere il DPBS e aggiungere 500 μL di 0,5 mM EDTA al pozzetto.
    3. Incubare la piastra a RT per 1-3 minuti e osservare le cellule al microscopio, fino a quando il distacco della colonia è visibile sui bordi.
    4. Rimuovere l'EDTA e aggiungere con cautela 500 μL di DPBS. Aspirare il liquido prima di aggiungere lentamente 500 μL di terreno di coltura PSC al pozzetto, senza staccare le cellule.
    5. Utilizzare una pipetta p200 per scegliere la colonia desiderata al microscopio, senza raccogliere le cellule differenziate. Per fare questo, grattare delicatamente sulla colonia mentre si prende il mezzo contenente le cellule.
    6. Trasferire ogni colonia prelevata in un pozzetto rivestito di matrice di membrana basale, come preparato al punto 5.3.1. Dissociare le cellule in piccoli grumi usando una pipetta p1000, pipettando le celle 2-5 volte.
    7. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2, lasciando che i grumi si attacchino.
    8. Sostituire il terreno con 750 μL di terreno di coltura PSC se si osservano molte cellule morte galleggianti; in caso contrario, aggiungere 250 μL di terreno di coltura PSC.
      NOTA: La sostituzione media dopo 30 minuti è fondamentale, specialmente per le linee cellulari instabili (ad esempio, NHP).
    9. Porre la piastra a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
    10. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni fino a quando le colonie diventano abbastanza grandi per passare. Per fare ciò, seguire la sezione 4 del protocollo.

6. Congelamento delle cellule urinarie e delle iPSC per la conservazione a lungo termine

NOTA: Di routine, le iPSC vengono congelate come grumi nel mezzo di congelamento cellulare senza contare. Il pipettaggio dovrebbe essere minimo, per evitare la dissociazione in singole cellule. Per le cellule urinarie, di routine, 1,5 × 10 4 a 3 × 104 cellule sono congelate per tubo, consentendo all'utente di scongelare un tubo direttamente in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti senza la necessità di un'altra fase di conteggio.

  1. Preparare 5 mL di DPBS in una provetta da 15 mL.
  2. Per il congelamento delle cellule urinarie, seguire i passaggi 2.2-2.4 del protocollo. Per il congelamento delle iPSC, seguire i passaggi 5.1.2-5.1.5 del protocollo di passaggio del gruppo.
  3. Trasferire la sospensione nel tubo da 15 mL preparato al punto 6.1. Per il congelamento delle cellule urinarie, contare 10 μL della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 × g e aspirare completamente il surnatante
  4. Risospendere il pellet cellulare in 400 μL di mezzo di congelamento cellulare per provetta e distribuire le cellule alla quantità desiderata di criotubi.
  5. Trasferire immediatamente i criotubi a -80 °C. Trasferire i tubi congelati in un congelatore a -150 °C o in azoto liquido 1 giorno dopo il congelamento a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

7. Scongelamento delle cellule urinarie e delle iPSC

  1. Per lo scongelamento delle cellule urinarie, preparare la quantità desiderata di 12 pozzetti rivestiti di gelatina, come indicato nella fase 1.1 del protocollo. Per le iPSC, preparare le piastre a 12 pozzetti rivestite con membrana basale rivestite con matrice di matrice, come indicato al punto 5.1.1. In entrambi i casi, non scambiare la matrice con il mezzo.
  2. Preparare una provetta da 15 mL contenente 4 mL di DPBS e conservarla a 37 °C.
  3. Posizionare rapidamente una fiala congelata di cellule a bagnomaria a 37 °C per lo scongelamento, fino a quando un pezzo di ghiaccio galleggiante diventa visibile.
    NOTA: Pulire il criotubo con etanolo prima e dopo l'incubazione a bagnomaria per evitare contaminazioni.
  4. Aggiungere 500 μL di terreno REMC per le cellule urinarie o 500 μL di terreno di coltura PSC per le iPSC alla sospensione contenente ghiaccio e trasferire immediatamente la sospensione nel tubo da 15 mL preriscaldato preparato al punto 7.2.
  5. Centrifugare il tubo a 200 × g per 5 minuti ed eliminare completamente il surnatante .
  6. Per le cellule urinarie, risospendere il pellet in 1 ml di terreno REMC. Per le iPSC, risospendere accuratamente il pellet in 750 μL di terreno di coltura PSC. Evitare di pipettare troppo, in modo da mantenere intatti i grumi.
    Opzionale: l'integrazione del terreno con 10 μM Y-27632 può supportare la sopravvivenza delle iPSC dopo lo scongelamento.
  7. Aspirare la matrice dalle piastre a 12 pozzetti preparate al punto 7.1 e trasferire con attenzione la sospensione cellulare nel pozzetto.
  8. Posizionare la piastra per una notte a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
  9. Il giorno successivo, sostituire il terreno con terreno di coltura PSC, senza Y-27632 per iPSC e con REMC per le cellule urinarie.
  10. Far crescere le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 in un incubatore.
  11. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino a quando le cellule diventano abbastanza grandi per passare. Per modifiche medie, seguire la sezione 4 del protocollo.

8. Immunocitochimica

NOTA: L'immunocolorazione con anticorpi mirati a marcatori correlati alla pluripotenza come NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 ed EpCAM è una delle convalide più utilizzate delle iPSC di nuova generazione. Ulteriori informazioni sugli anticorpi e sulle diluizioni sono disponibili nella tabella dei materiali.

  1. Piastra iPSC 1-3 giorni prima dell'uso in un numero appropriato di piastre a 12 pozzetti. Aspirare il mezzo, lavare le celle aggiungendo 500 μL di DPBS e rimuovere il DPBS. Aggiungere 400 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per pozzetto e fissare le cellule per 15 minuti a RT.
  2. Rimuovere il PFA al 4% e lavare le celle 3 volte con DPBS. Aggiungere 400 μL di tampone bloccante per pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti a RT.
  3. Aspirare il tampone bloccante e aggiungere gli anticorpi diluiti in 400 μL di tampone anticorpale di diluizione (ADB) a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 4 °C durante la notte.
  4. Rimuovere l'ADB contenente gli anticorpi primari e lavare le cellule 3 volte con DPBS.
  5. Aspirare il DPBS e aggiungere 400 μL di anticorpi secondari diluiti in ADB per pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a RT al buio.
  6. Rimuovere l'ADB e lavare le celle 3 volte con DPBS. Aggiungere 1 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in DPBS per pozzetto e incubare per 3 minuti a RT.
  7. Aspirare la soluzione DAPI e lavare la cella 3 volte con DPBS. Aggiungere 500 μL di DPBS per l'imaging.

Risultati

Quando si isolano le cellule dall'urina umana e NHP, diversi tipi di cellule possono essere identificati direttamente dopo l'isolamento. Le cellule squamose, così come varie cellule rotonde più piccole, vengono escrete con l'urina; l'urina femminile contiene molte più cellule squamose rispetto all'urina maschile (Figura 1B - Giorno 0; Figura supplementare S1). Dopo 5 giorni di coltura nel mezzo urinario primario, si possono vedere le prime cellule proliferanti aderenti (<...

Discussione

Le iPSC sono tipi di cellule preziose in quanto consentono la generazione di tipi cellulari altrimenti inaccessibili in vitro. Poiché i materiali di partenza per la riprogrammazione, ad esempio, i fibroblasti non sono facilmente disponibili da tutte le specie di primati, questo documento presenta un protocollo per la generazione di iPSC da cellule derivate dall'urina. Queste cellule possono essere ottenute in modo non invasivo, anche da campioni di urina di primati non sterili, integrando il terreno di coltura ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da DFG EN 1093/5-1 (numero di progetto 458247426). M.O. è stato supportato da JSPS Overseas Research Fellowship. Tutte le figure sono state create con BioRender.com. La citometria a flusso è stata eseguita con l'aiuto del Core Facility Flow Cytometry presso il Biomedical Center di Monaco. Vorremmo ringraziare Makoto Shida e Tomoyo Muto di ASHBi, Università di Kyoto, per il supporto della videografia.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody Stem Cell Technologies60064Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody Miltenyi Biotec130-122-965Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium)Nippon GeneticsBB01
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlucoseTH.GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o MagnesiumTH.GeyerL0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottomGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottomGreiner BIO-ONE227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 663441
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 incubatorFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinetKendro51017905
Human EGF, premium gradeMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersion 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibodyR&D SystemsMAB1368Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibodyR&D SystemsMAB1420Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibodyR&D SystemsMAB1195Dilution: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology4903SDilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent)Invivogenant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody Cell Signaling Technology2750SDilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basicPeproTech100-18B
Recombinant Human PDGF-ABPeproTech100-00AB
Refrigerated benchtop centrifugeSIGMA 4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900Cell Signaling Technology4900SDilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAbNEB4755SDilution: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)BiozolBYT-ORB153635
Antibody dilution bufferFor composition see the supplementary table S1
Blocking bufferFor composition see the supplementary table S1
REMC mediumFor composition see the supplementary table S1
Primary urine mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC culture mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC generation mediumFor composition see the supplementary table S1
Urine wash bufferFor composition see the supplementary table S1

Riferimenti

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, . A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero, ., I, , et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero, ., I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).

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