评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病理的协议

摘要

小鼠模型可以成为研究视网膜色素上皮（RPE）生物学的有用工具。已经确定小鼠可以发展出一系列RPE病理。在这里，我们描述了一种表型方案，以使用光，透射电子和共聚焦显微镜阐明和量化小鼠的RPE病理。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人群中一种使人衰弱的视网膜疾病。人们普遍认为，视网膜色素上皮 （RPE） 功能障碍是 AMD 的关键病理生物学事件。为了了解导致RPE功能障碍的机制，研究人员可以利用小鼠模型。以前的研究已经确定，小鼠可以发展为RPE病理，其中一些是在被诊断患有AMD的个体的眼睛中观察到的。在这里，我们描述了一种表型方案来评估小鼠的RPE病理。该协议包括使用光学显微镜和透射电子显微镜制备和评估视网膜横截面，以及通过共聚焦显微镜制备和评估RPE平面安装。我们详细介绍了这些技术观察到的小鼠RPE病理的常见类型，以及通过无偏的统计测试方法量化它们的方法。作为概念验证，我们使用这种RPE表型方案来量化在过表达跨膜蛋白135（Tmem135）和老年野生型C57BL / 6J小鼠中观察到的RPE病理。该协议的主要目标是为使用AMD小鼠模型的科学家提供具有无偏定量评估的标准RPE表型方法。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种常见的致盲性疾病，影响55岁以上的人群^1。许多研究人员认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD²的早期和关键的病理生物学事件。RPE是单层极化细胞，其任务是维持邻近光感受器和脉络膜血管的稳态³。存在多种模型来研究RPE内的疾病相关机制，包括细胞培养模型⁴，⁵和小鼠⁶，^7，8。最近的一份报告描述了RPE细胞培养模型⁴的标准化方案和质量控制标准，但没有报告试图标准化小鼠模型中RPE的表型。事实上，许多关于AMD小鼠模型的出版物缺乏对RPE的完整描述或对其中RPE病理的量化。该协议的总体目标是为使用AMD小鼠模型的科学家提供具有无偏定量评估的标准RPE表型方法。

以前的出版物已经通过三种成像技术注意到小鼠中存在几种RPE病理。例如，光学显微镜允许研究人员查看小鼠视网膜的粗大形态（图1A）并检测RPE病理，例如RPE变薄，空泡化和迁移。AMD 小鼠模型中的 RPE 变薄示例是 RPE 高度与其各自对照的偏差（图 1B）。RPE空泡化可分为两类:微空泡化（图1C）和大空泡化（图1D）。RPE微空泡化总结为RPE中存在不影响其总高度的液泡，而大空泡化则表现为存在突出到感光器外部部分的液泡。RPE迁移的特征在于视网膜横截面中RPE单层上方色素的焦点聚集体（图1E）。应该注意的是，AMD供体眼睛中的迁移性RPE细胞对免疫细胞标志物表现出免疫反应性，例如分化簇68（CD68）9，并且可能代表免疫细胞吞噬RPE碎片或RPE经历转分化⁹。另一种称为透射电子显微镜的成像技术可以让研究人员可视化RPE及其基底膜的超微结构（图2A）。该技术可以识别小鼠中主要的亚RPE沉积物，称为基底层流沉积物（BLamD）（图2B）¹⁰。最后，共聚焦显微镜可以通过成像RPE平面支架揭示RPE细胞的结构（图3A）。这种方法可以发现RPE畸形，即RPE与其经典蜂窝形状的偏差（图3B）。它还可以检测RPE多核，即RPE细胞内存在三个或更多细胞核（图3C）。有关当前AMD小鼠模型中存在的RPE病理类型的摘要，我们请研究人员参考文献^6，7中的这些评论。

研究AMD的研究人员应该意识到在表型方案之前使用小鼠研究RPE病理的优缺点。小鼠是有利的，因为它们的寿命相对较短，成本效益，以及它们的遗传和药理可操作性。小鼠还表现出RPE退行性变化，包括RPE迁移，畸形和多核，在AMD供体眼睛中观察到¹¹，¹²，^13，14，¹⁵，^16，17;这表明类似的机制可能是小鼠和人类这些RPE病理发展的基础。然而，存在一些关键差异，限制了小鼠研究对人类AMD的可转化性。首先，小鼠没有黄斑，黄斑是人类视网膜中视力所必需的解剖学上独特的区域，在AMD中优先受到影响。其次，小鼠的一些RPE病理，如RPE变薄和空泡化，在AMD供体的眼睛中并不常见¹⁸。第三，小鼠不会发育玻璃疣，这是AMD病理学的标志¹⁹。玻璃膜疣是含有脂质和蛋白质的沉积物，在RPE基底层和布鲁赫膜（BrM）的内部胶原层之间形成很少的基底膜蛋白¹⁹。玻璃膜疣与BLamD不同，BLamD是小鼠中常见的亚RPE沉积物，无论是它们的组成还是解剖位置。BLamD 是年龄和应激依赖性细胞外基质富集异常，在 BrM 的 RPE 基底层和 RPE²⁰ 的基底折叠之间形成。有趣的是，BLamD在小鼠^和人类中具有相似的蛋白质组成和外观6，^10，21。最近的研究表明，BLamDs可能通过影响AMD进展到后期来影响AMD的病理生物学^18，22;因此，这些沉积物可能代表小鼠视网膜中的患病RPE。了解这些益处和局限性对于有兴趣将小鼠研究结果转化为AMD的研究人员至关重要。

在该协议中，我们讨论了为光，透射电子和共聚焦显微镜准备眼睛以可视化RPE病理的方法。我们还描述了如何以无偏的方式量化RPE病理以进行统计测试。作为概念验证，我们利用RPE表型方案来研究在跨膜蛋白135-（Tmem135）过表达小鼠和老年野生型（WT）C57BL / 6J小鼠中观察到的结构RPE病理。总之，我们的目标是描述表征AMD小鼠模型中RPE的表型方法，因为目前没有可用的标准协议。有兴趣检查和量化光感受器或脉络膜病理的研究人员，这些病理在AMD小鼠模型中也受到影响，可能发现该协议对他们的研究没有用。

研究方案

所有涉及动物受试者的程序均已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会的批准，并符合视觉和眼科研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。

1.光学显微镜评估小鼠RPE

1. 在玻璃瓶中制备终浓度为2%多聚甲醛和2%戊二醛的固定缓冲液，在室温（RT）下。
   注意:该方案每只小鼠最多需要14 mL固定缓冲液。
   注意:多聚甲醛和戊二醛是有害物质。使用这些物质时，请遵循标准操作程序。
2. 在吸收性垫上准备重力进料灌注系统，以便在通风橱中进行心脏灌注（补充图1A）。
   1. 将40mL固定缓冲液放入灌注系统的注射器筒中（补充图1B）。
   2. 转动阀门，直到它与管路平行，以允许缓冲器流过管路（补充图1C）。用缓冲液冲洗管路，直到从管路中去除所有气泡。
   3. 转动阀门直到它垂直于管路，以阻止缓冲液流入管路（补充图1D）。
      注意:灌注系统现已准备就绪，可供使用。
3. 通过将小鼠放入二氧化碳（CO 2）室中对小鼠实施安乐死，并让CO₂以每分钟腔室体积的30%的流速流入室。一旦小鼠停止呼吸，让CO₂流入腔室至少1分钟。在继续下一步之前，请验证鼠标是否已死亡。
   注意:通过注射药物的安乐死可用于本协议，作为CO₂ 吸入的替代方案。
4. 对安乐死的小鼠进行心脏灌注。
   1. 将鼠标转移到灌注系统附近的浅托盘中，腹部朝上。用70%乙醇（EtOH）喷洒腹部。
   2. 做四个切口以暴露腹腔（补充图2A）。
      1. 使用弯曲的剪刀和镊子穿过肋骨正下方鼠标最远左侧的皮肤和腹壁，创建一个 5 厘米的下切口。
      2. 继续从下切口的顶部开始，在小鼠的皮肤和腹壁上进行3厘米的内侧切口。
      3. 在内侧切口末端再做一个5厘米的下切口，穿过小鼠最远右侧的皮肤和腹壁，直接在肋骨下方。
      4. 再做一个3厘米的内侧切口，用弯曲的镊子去除腹部皮肤瓣。
   3. 切开横膈膜和胸骨以暴露心脏（补充图2B）。
      注意:小心避免切口心脏、动脉和静脉。切口这些会导致心脏灌注效率低下。
   4. 将仪表针插入心脏的左心室。转动阀门，直到它与管路平行。用弯曲的剪刀切开右心房，让血液和固定剂离开心脏（补充图2C）。
   5. 让 10 mL 固定缓冲液穿透小鼠至少 1-2 分钟，或直到肝脏颜色变浅且没有血液流出右心房。灌注完成后，转动阀门直到它垂直于管路以停止缓冲液的流动。
5. 心脏灌注后从小鼠身上摘除眼睛。
   1. 从浅托盘中取出鼠标，然后将鼠标放在通风橱中的吸收垫上。调整鼠标头部的方向，使左眼朝向实验者，右眼不在视线范围内。用组织标记染料注释眼睛的上侧。
   2. 用拇指和食指在眼窝周围轻轻向下推，使眼睛从眼窝突出（补充图3A）。
   3. 拿起弯曲的剪刀，用刀片与眼窝成 30° 角握住它。继续用弯曲的剪刀以30°角切割眼睛周围（补充图3B）。
      注意:可以从眼窝中切下多余的组织，以保持眼球的完整性。
   4. 用弯曲的镊子从头部取出眼球，并将其放在吸收性垫上。用 11 号手术刀刀片切开角膜，用弯曲的镊子将眼睛放入装有 2 mL 固定缓冲液的 2 mL 微管中。用小鼠标识标记 2 mL 微管，并标记"左"以指示左眼。
      注意:角膜上的切口允许固定剂容易穿透眼睛以更好地保护它。
   5. 对右眼重复步骤1.5.1-1.5.4。
6. 让眼睛在固定缓冲液中以每分钟75转（rpm）的速度在4°C（C）房间的摇床上孵育过夜。
7. 用 2 mL 的 1x 磷酸盐缓冲液 （PBS） 替换固定缓冲液。在 1x PBS 中以 RT 和 75 rpm 在摇床上孵育眼睛 10 分钟。重复此步骤两次。
8. 清洁和解剖眼睛以产生后节。
   注意:后段是小鼠眼球，神经视网膜，RPE，脉络膜和巩膜没有角膜，虹膜和晶状体。
   1. 将眼睛放入充满1x PBS的培养皿中，在解剖显微镜下（补充图4A）。
   2. 用细尖镊子轻轻地将任何脂肪和肌肉从眼球上移开。用显微解剖剪刀小心地修剪脂肪和肌肉，与眼球平行，直到眼球具有均匀的蓝黑色（补充图4B）。
      注意:不要垂直切割，因为这会损害眼球。此外，如果在加工过程中组织标记染料脱落，请立即重新注释眼球的上侧。
   3. 将细尖镊子放在角膜穿刺部位。从穿刺部位开始，在角膜周围切割，用微型解剖剪刀从眼球中去除角膜和虹膜（补充图4C）。
   4. 取细尖镊子，轻轻地从眼球上取下晶状体以产生后段（补充图4D）。
   5. 将后段放回装有 2 mL 1x PBS 的 2 mL 微管中。将后段储存在4°C冰箱中。
      注意:在进一步处理之前，后段可以在4°C的1x PBS中保留数周。
9. 重复步骤1.3-1.8以准备研究中其他小鼠的眼睛。
10. 处理并将每个鼠标的后段之一嵌入石蜡中以进行切片。确保后段的上侧在顶部。
    注意:作者依靠威斯康星大学麦迪逊分校（UW）病理学转化研究计划（TRIP）实验室来执行这些任务。以下是使用类似的石蜡处理和包埋方法^23，24的已发布协议。
11. 修剪并切片每个石蜡块，以获得一个 5 μm 厚的视网膜切片，其中包括视神经头，以及四个额外的 5 μm 厚的视网膜切片，彼此相距 250 μm。用鼠标标识和序列号（即 1、2、3、4 或 5）标记载玻片。将幻灯片存储在幻灯片框中。
    注意:作者依靠UW TRIP实验室提供石蜡切片服务。以下是使用类似石蜡切片方法^25，26的已发布方案。
12. 用苏木精和伊红（H&E）染色含有视网膜切片的载玻片。H&E染色方案可以在 补充图5中找到。
    注意:H&E 染色程序的所有步骤必须在通风橱中完成。
13. 使用20倍放大倍率的光学显微镜，用比例尺收集H&E染色视网膜切片的拼接图像。
14. 量化每个样品包含视神经头的视网膜图像中的 RPE 厚度。
    1. 下载并打开斐济ImageJ程序。将所有包含视神经头的拼接视网膜图像拖到斐济 ImageJ 任务栏中。验证图像比例是否以μm而不是像素为单位进行校准。
       注意:图像比例位于斐济 ImageJ 程序中包含视网膜图像的窗口的左上角。如果比例设置为像素，请参阅斐济 ImageJ 程序的使用说明书将像素转换为 μm。
    2. 在从视神经头边缘到视网膜末端（ora serrata）的每个图像中每300μm间隔标记一次。单击斐济 ImageJ 任务栏中的 直线 图标。单击并拖动一条线从视神经头的边缘到长度为 300 μm 的锯齿状动脉。单击斐济 ImageJ 任务栏中的 画笔 工具，然后单击 300 μm 线的末尾进行标记。
    3. 在每个标记的间隔处测量 RPE 厚度。单击斐济 ImageJ 任务栏中的 直线 图标。单击 RPE 的顶部并拖动一条线到底部（补充图 6）。单击斐济 ImageJ 菜单栏中的分析 >测量 值以获取 RPE 厚度。
    4. 将 RPE 厚度测量值传输到电子表格，并用鼠标标识标记包含测量值的列。用"标记间隔"标记附加列，并输入与视神经值的距离（即 300、600、900 等）
       注意:第一个测量间隔对应于距离视神经300μm，第二个测量间隔对应于距离视神经600μm，依此类推。
15. 根据每个样本的视网膜图像量化 RPE 病理发生率。
    1. 打开斐济 ImageJ 程序。
    2. 在斐济ImageJ程序中打开细胞计数器应用程序。单击插件>斐济 ImageJ 菜单栏中分析>细胞计数器。将视网膜图像拖到斐济 ImageJ 任务栏中，然后单击细胞计数器窗口中的初始化。
    3. 使用细胞计数器应用程序计算每个视网膜切片的 RPE 病理数量。单击计数器下的类型 1，然后单击图像中的所有微空泡化事件。单击计数器下的类型 2，然后单击图像中的所有大空泡化事件。单击计数器下的类型 3，然后单击图像中的所有单个迁移事件。
    4. 将 RPE 病理的编号传输到电子表格。用微空泡化、大空泡化或迁移标记行，用鼠标标识标记列。
    5. 对样品的其他图像重复步骤1.15.2-1.15.4。平均每个样本的 RPE 病理数量并除以 5 以计算电子表格中样本的每个 RPE 病理的发病率。
16. 对每个间隔的 RPE 厚度和 RPE 病理发生率进行统计分析，以确定研究中各组之间是否存在显着差异。

2.透射电镜评估小鼠RPE

1. 用剃须刀片将步骤1.5-1.9后产生的其他后段切成两半，穿过上标记。用组织标记染料重新注释切片后节段的上侧。将切片的后段分离到新的 2 mL 微管中，其中包含 2 mL 的 1x PBS 和小鼠识别。
   注意:小鼠后段太大，无法一体加工，必须切成两半以进行透射电子显微镜处理。
2. 用 2 mL 的 0.1 M 二甲胂酸缓冲液冲洗组织，pH 7.2。在台面上的室温下孵育10分钟。再重复此步骤两次。
3. 用 2 mL 在 0.1 M 二甲胂酸缓冲液中稀释的 2% 四氧化锇 （OsO₄） 替换 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液。在通风橱中的室温下孵育1.5小时。
   注意:OsO₄ 是一种有毒物质。使用 OsO₄ 时，请遵循标准操作程序。
4. 在通风橱中的室温下用2mL的0.1M二甲胂酸盐缓冲液冲洗组织10分钟。重复此步骤一次。
5. 在通风橱中的室温下，用50%至100%的渐变EtOH稀释度使组织脱水。脱水程序的方案可以在 补充图7中找到。
6. 从组织中去除 100% EtOH，并向组织中加入 2 mL 环氧丙烷。在通风橱中的室温孵育15分钟。从组织中取出环氧丙烷，并向组织中加入 2 mL 新鲜环氧丙烷。在通风橱中的室温孵育15分钟。
   注意:环氧丙烷是一种有毒物质。使用环氧丙烷时，请遵循标准操作程序。
7. 从组织中取出环氧丙烷，并向组织中加入 2 mL 环氧丙烷和树脂的 1:1 混合物。在室温通风橱的真空下放置过夜。
   注意:树脂是对人体有害的物质。使用树脂时，请遵循实验室的标准操作程序。
8. 用 2 mL 纯树脂替换组织中环氧丙烷和树脂的 1:1 混合物。在 RT 的通风橱中的真空下放置过夜。
9. 将纸巾嵌入树脂中。用铅笔将带有鼠标识别的标签和一滴树脂放入模具中。将纸巾放在树脂滴上。用树脂填充模具，并在通风橱中的室温下真空下放置1小时。
10. 用细尖镊子重新定位标签和标本，后眼罩部分的后侧在顶部。将模具在65°C的通风橱中的烤箱中放置过夜。
11. 从烤箱中取出模具。让模具在工作台上冷却至室温。从模具中取出块。
    注意:块现在已准备好进行修剪。
12. 用剃须刀片塑造树脂块的形状，形成梯形。使用切片机修剪树脂块，直到视神经头可见。继续使用金刚石刀从厚度为0.5μm的树脂块上切割半薄部分。
    注意:这是关于切片机切片的已发布方案²⁷.如果需要，可以从树脂块中收集0.5μm厚的半薄切片并进行染色，以评估样品的完整性。
13. 使用超薄切片机从每个修剪的块上切割 70 nm 厚的超薄切片。在 70 目薄条铜网格上收集 400 nm 厚的超薄切片。将网格放入网格存储盒中，并用鼠标标识标记插槽。
    注意:这是关于超切片机切片的已发布方案²⁸。
14. 用2%乙酸铀酰染色网格5分钟，然后在通风橱中的室温下用3.5%柠檬酸铅溶液染色5分钟。
    注意:乙酸铀酰和柠檬酸铅是有害物质。使用这些物质时，请遵循标准操作程序。
15. 使用透射电子显微镜以15，000倍的放大倍率获取每个样品的图像，其中铜网格的网格线与RPE和BrM相交。
    注意:每个部分应至少有 20 到 35 张图像，每个样本应至少有 40 到 70 张图像。
16. 量化研究中样品图像中的 BLamD 高度。
    1. 打开斐济 ImageJ 程序。将所有图像从示例部分拖到斐济 ImageJ 任务栏中。验证图像是否以μm而不是像素为单位进行校准。
    2. 测量图像中的 BLamD 高度。单击斐济 ImageJ 任务栏中的 直线 图标。单击一条线并将其从 BrM 的弹性层拖动到图像中最高沉积物的顶部（补充图 8）。单击斐济 ImageJ 菜单栏中的分析 >测量 值以获取图像中的 BLamD 高度。
       注意:如果图像中没有BLamD，则从BrM的弹性层到RPE的基底层画一条线。
    3. 将 BLamD 高度传输到电子表格并使用鼠标标识标记。
17. 在电子表格中计算每个基因型的 BLamD 高度的累积频率和每只小鼠的 BLamD 高度平均值。对 BLamD 身高的平均值进行统计分析，以确定研究中各组之间是否存在显著差异。

3. 通过共聚焦显微镜评估小鼠RPE

1. 收集小鼠的眼睛。按照步骤1.3中描述的程序对小鼠实施安乐死。使用步骤1.5去除眼睛。使用弯曲的镊子将眼睛放入具有 2 mL 1x PBS 和小鼠识别的 2 mL 微管中。
   注意:不要对小鼠进行暗适应，因为光感受器和RPE顶端过程的指指化允许通过共聚焦显微镜更好地可视化RPE。
2. 立即清洁并解剖小鼠眼睛以生成小鼠后眼罩。
   注意:后眼罩与后段不同，因为它不包含神经视网膜。
   1. 在解剖显微镜下将眼睛转移到含有1x PBS的培养皿中（补充图9A）。
   2. 去除眼球中的脂肪和肌肉，如步骤1.8.2（补充图9B）中所述。
   3. 用11号手术刀刀片划破眼球角膜。去除角膜和虹膜，如步骤1.8.3（补充图9C）中所述。
   4. 用细尖镊子拉出镜片。取两个细尖镊子，轻轻地将神经视网膜与后段分开。
   5. 小心地切割视神经头处的神经视网膜，以便从后眼罩上移除（补充图9D）。
   6. 将后眼罩放入含有 500 μL 1x PBS 的新 2 mL 微管中，并进行小鼠识别。
3. 用甲醇（MeOH）固定后眼罩（补充图10）。
   注意:步骤 3.3 大约需要 2 小时 40 分钟才能完成。
   1. 向组织中加入 500 μL 甲醇。在室温下以75rpm在摇床上孵育5分钟。
   2. 从组织中取出 500 μL 溶液并加入 500 μL MeOH。在室温下以75rpm在摇床上孵育5分钟5分钟。 再重复此步骤一次。
   3. 从组织中取出整个溶液并加入 500 μL MeOH。在室温下以75rpm在摇床上孵育至少2小时。
      注意:作为步骤3.3.3的替代方法，后眼罩可以在4°C房间中以75rpm的摇床在MeOH中孵育过夜。
   4. 向组织中加入 500 μL 的 1x PBS。在室温下以75rpm在摇床上孵育5分钟。
   5. 从组织中取出 500 μL 溶液，加入 500 μL 的 1x PBS。在室温下以75rpm在摇床上孵育5分钟。 再重复此步骤一次。
   6. 从组织中取出整个溶液，并用 500 μL 1x PBS 代替。
      注意:组织由MeOH完全固定，可以在4°C冰箱中保存至少1个月。
4. 对后眼罩进行免疫荧光染色，以可视化RPE的紧密连接和细胞核（补充图11）。
   1. 从样品中取出 500 μL 的 1x PBS，并在 1x PBS 溶液中加入 100 μL 稀释的 10% 正常驴血清。在室温下以75rpm在摇床上孵育30分钟。
   2. 从样品中取出稀释的 10% 正常驴血清溶液，并在 1x PBS 中加入 100 μL 1:50 稀释的兔多克隆抗 Zonula Occludens-1 （ZO-1） 抗体。将样品转移到4°C室中，并在摇床上以75rpm孵育过夜。
   3. 从样品中取出抗体稀释液，加入 2 mL 的 1x PBS。在室温下以75rpm在摇床上孵育10分钟。 再重复此步骤两次。
   4. 从样品中取出 1x PBS。向样品中加入 100 μL 1:250 稀释度的驴抗兔 IgG 抗体，加入 488 荧光团偶联标签和 1:250 稀释的 4'，6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐 （DAPI） 的 1x PBS。用铝箔覆盖样品，并在室温下以75rpm在摇床上孵育2小时。
      注意:样品必须完全用铝箔覆盖，以防止光漂白。
   5. 从样品中取出抗体和DAPI稀释液。向样品中加入 2 mL 的 1x PBS，用铝箔重新盖住，并在室温下以 75 rpm 在摇床上孵育 10 分钟。 再重复此步骤三次。
      注意:RPE的紧密连接和细胞核现在分别完全标记和染色。
5. 将后眼罩安装到显微镜载玻片上。
   1. 用鼠标识别标记显微镜载玻片。将后眼罩转移到解剖显微镜下的显微镜载玻片上，脉络膜面朝下。在后眼罩上滴一滴1x PBS，以防止其变干（补充图12）。
   2. 使用数字 11 手术刀刀片在四个点切割后眼罩，这将产生对应于基本方向（即北、东、南和西）的四个象限。用后眼罩周边的组织轻拍多余的 1x PBS。用骆驼毛刷和细尖镊子轻轻压平后眼罩（补充图12）。
      注:由此产生的产品现在称为 RPE 平面安装。
   3. 在 RPE 平面支架上添加一滴安装介质，并在其顶部放置盖玻片。涂上透明的指甲油以密封盖玻片，并在密闭的抽屉中在室温下干燥至少30分钟。将载玻片放入载玻片盒中，并将箱子保存在4°C冰箱中。
      注:小心避免在 RPE 平面安装座上引入气泡。RPE 平面支架可以在 2 周内成像。
6. 在共聚焦显微镜上以 20 倍放大倍率获取每个样品的 RPE 平面支架视神经周围四个象限中的每一个的图像。RPE 平面安装映像的示例可在 补充图 13A 中找到。
   注意:可能需要对 RPE 平板支架执行 z 堆栈成像，其中拍摄并堆叠多个图像以补偿 RPE 平板支架的尺寸差异。
7. 跟踪每个 RPE 平面安装映像中 RPE 单元的紧密连接。跟踪的RPE平面安装映像的示例可在 补充图13B中找到。
   1. 打开斐济 ImageJ 程序。将 RPE 平面装载映像拖到斐济 ImageJ 任务栏中。验证图像是否以微米而不是像素为单位进行校准。
   2. 双击斐济 ImageJ 任务栏中的叠加画笔工具图标，将画笔宽度设置为 3，透明度设置为 0，颜色设置为红色。单击叠加画笔工具窗口中的关闭按钮。
   3. 单击 叠加画笔工具 图标。单击并拖动完全位于图像内的所有 RPE 单元的紧密连接。
      注意:如果出现描摹错误，请双击"叠加画笔工具"图标，然后单击"叠加画笔工具"窗口中的"撤消"框以从图像中删除描摹错误。
   4. 单击斐济 ImageJ 任务栏中的 矩形 图标。单击图像并在图像的周边拖动。单击斐济 ImageJ 菜单栏上的 编辑>清除 以保留描摹线并从图像中删除任何蓝色和绿色。
   5. 将跟踪图像保存在适当的位置，其中包含鼠标标识、象限位置（即北、南、东或西）和 CP 后缀标签。
      注意:在完成步骤 3.7.4 之前，请勿保存 RPE 跟踪映像。
8. 计算每个样本的 RPE 细胞面积。
   1. 通过在计算机桌面屏幕上创建文件夹来指定保存 RPE 区域分析中文件的位置。为每个 RPE 跟踪图像生成子文件夹，并使用鼠标标识和象限位置（即北、南、东或西）标记子文件夹。
   2. 安装并打开细胞分析器程序²⁹.下载Ikeda_RPE面积计算器.cpproj（补充编码文件 1）项目文件。通过单击单元格分析器程序栏中的" 文件>打开项目 "打开Ikeda_RPE面积计算器.cpproj 文件。
   3. 将一个 RPE 跟踪图像拖到"单元格探查器程序"窗口中的" 图像>将文件和文件夹拖放到此处 "框中。
   4. 将文件夹的位置输入到与 RPE 跟踪图像对应的单元格分析器程序中。单击单元格分析器程序窗口左下角的"输出设置"按钮，然后在"默认输入文件夹"和"默认输出文件夹"文本框中输入文件夹的位置。
   5. 单击细胞分析器程序窗口左下角的"分析图像"按钮。分析完成后，屏幕上将出现"分析完成"窗口。单击"分析完成"窗口中的"确定"按钮。
      注意:此操作将生成 csv 文件和 jpeg 图像。csv 文件将包含跟踪图像中 RPE 单元格的区域。jpeg图像将对应于RPE跟踪图像，其中每个RPE单元将标有一个数字（补充图13C）。
   6. 将 RPE 区域从 csv 文件传输到电子表格。用鼠标标识标记电子表格。
   7. 通过确认 csv 文件中的每个 RPE 区域链接到 jpeg 图像中完全跟踪的 RPE 单元格，对数据执行质量控制调查。从电子表格中删除与完全跟踪的 RPE 单元格不对应的任何值。
   8. 返回到细胞分析器程序。右键单击"将 文件和文件夹拖放到此处 "框中的 RPE 跟踪映像名称，然后选择 "清除列表 "以从单元探查器程序中删除该映像。
   9. 重复步骤3.8.3-3.8.8以计算样品的其余三个RPE跟踪图像的RPE大小。
9. 量化电子表格中每个样本的 RPE 细胞大小平均值。
10. 量化电子表格中每个样本的 RPE 细胞密度。要计算 RPE 细胞密度，请将每个象限的 RPE 细胞总数除以细胞分析器程序检测到的每个象限的 RPE 细胞总面积。从每个样品的四个象限确定RPE细胞密度的平均值。
11. 量化每个样品的每个 RPE 平面安装的多核 RPE 细胞数量。如步骤 1.15.1-1.15.3 中所述，使用 Fiji ImageJ 程序中的细胞计数器应用程序来计数样品四个象限中具有三个以上细胞核的 RPE 细胞 的数量。
12. 对RPE细胞大小和密度平均值以及多核RPE细胞的数量进行统计分析，以确定研究中各组之间是否存在显着差异。

结果

本文中描述的RPE表型方案的完成提供了对AMD小鼠模型中常见的结构RPE异常的定量分析。为了确认该协议的有效性，我们在已知显示RPE病理的小鼠中使用它，包括由鸡β-肌动蛋白启动子（Tmem135 TG）³⁰和老年C57BL / 6J小鼠^31，32驱动的过表达WT Tmem135的转基因小鼠。这些实验的目的是向刚接触小鼠模型的研究人员展示使用本协议?...

讨论

在本文中，我们介绍了一种表型协议，用于评估小鼠模型的结构RPE病理。我们描述了处理各种成像技术（包括光，透射电子和共聚焦显微镜）的眼睛所需的步骤，以及通过这些成像方法观察到的典型病理的定量。我们通过检查Tmem135 TG和24个月大的WT小鼠证明了我们的RPE表型方案的有效性，因为这些小鼠显示RPE病理³⁰，^31，32...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02