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要約

マウスモデルは、網膜色素上皮(RPE)の生物学を調べるための有用なツールとなり得る。マウスは一連のRPE病理を発症する可能性があることが確立されています。ここでは、光、透過電子、および共焦点顕微鏡を使用してマウスのRPE病理を解明および定量化するための表現型プロトコルについて説明します。

要約

加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者における衰弱性網膜障害です。網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの重要な病態学的事象であると広く信じられています。RPE機能障害につながるメカニズムを理解するために、研究者はマウスモデルを利用することができます。以前の研究により、マウスはRPEの病状を発症する可能性があり、その一部はAMDと診断された個人の目に観察されることが確立されています。ここでは、マウスのRPE病態を評価するための表現型プロトコールについて説明します。このプロトコルには、光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡を使用した網膜断面の準備と評価、および共焦点顕微鏡によるRPEフラットマウントの標本の作成と評価が含まれます。これらの手法によって観察されるマウスRPEの病状の一般的なタイプと、統計的検定のための偏りのない方法を通じてそれらを定量化する方法について詳しく説明します。概念実証として、このRPE表現型プロトコルを使用して、膜貫通タンパク質135(Tmem135)を過剰発現するマウスおよび野生型C57BL/6Jの老化マウスで観察されたRPEの病状を定量化しました。このプロトコルの主な目的は、AMDのマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を伴う標準的なRPE表現型分析法を提示することです。

概要

加齢黄斑変性症(AMD)は、55歳以上の人々に影響を与える一般的な失明性疾患です1。多くの研究者は、網膜色素上皮(RPE)内の機能不全は、AMD2の早期かつ重要な病態学的事象であると考えています。RPEは、隣接する視受容体と脈絡膜血管の恒常性を維持する役割を負った偏光細胞の単層です3。RPE内の疾患関連メカニズムを調べるために、細胞培養モデル4、5、マウス6、7、8など、さまざまなモデルが存在します。最近の報告では、RPE細胞培養モデル4の標準化されたプロトコルと品質管理基準が記載されているが、マウスモデルにおけるRPEの表現型を標準化しようとした報告はない。実際、AMDのマウスモデルに関する多くの出版物には、RPEの完全な説明やRPEの病状の定量化が欠けています。このプロトコルの全体的な目標は、AMDマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を備えた標準的なRPE表現型分析法を提示することです。

以前の出版物は、3つの画像技術を通じてマウスにおけるいくつかのRPE病理の存在を指摘している。たとえば、光学顕微鏡法により、研究者はマウス網膜の肉眼的形態を観察し(図1A)、RPEの菲薄化、空胞化、移動などのRPEの病状を検出できます。AMDマウスモデルにおけるRPEの薄化は、それぞれのコントロールからのRPEの高さの偏差によって例示されます(図1B)。RPE空胞化は、微小液胞化(図1C)とマクロ液胞化(図1D)の2つのカテゴリーに分けることができます。RPE微小液胞化は、その全体の高さに影響を及ぼさないRPE内の液胞の存在によって要約されるが、マクロ液胞化は、光受容体の外側セグメントに突出する液胞の存在によって示される。RPEの移動は、網膜断面におけるRPE単層上の色素の焦点集合体によって区別されます(図1E)。AMDドナーの眼における遊走性RPE細胞は、分化クラスター68(CD68)9などの免疫細胞マーカーに対して免疫反応性を示し、RPE破片または分化形質転換を受けているRPEを巻き込む免疫細胞を表す可能性があることに注意する必要があります9。透過型電子顕微鏡と呼ばれる別のイメージング技術により、研究者はRPEとその基底膜の微細構造を視覚化することができます(図2A)。この手法により、基底層流沈着(BLamD)として知られるマウスの優勢なサブRPE沈着物を特定することができます(図2B)10。最後に、共焦点顕微鏡は、RPEフラットマウントのイメージングを通じてRPE細胞の構造を明らかにすることができます(図3A)。この方法により、RPE異形症、つまりRPEの古典的なハニカム形状からの偏差を明らかにすることができます(図3B)。また、RPE細胞内に3つ以上の核が存在するRPE多核化を検出することもできます(図3C)。現在のAMDマウスモデルに存在するRPE病理の種類の要約については、文献6,7からこれらのレビューを参照します。

AMDを研究している研究者は、表現型プロトコルの前にマウスを使用してRPEの病状を調査することの長所と短所を知っておく必要があります。マウスは、それらの比較的短い寿命および費用対効果、ならびにそれらの遺伝的および薬理学的操作性のために有利である。マウスはまた、RPE遊走、異形症、および多核形成を含むRPE変性変化を示し、AMDドナー眼で観察される11、12、13、14、15、16、17;これは、同様のメカニズムがマウスとヒトにおけるこれらのRPE病状の発症の根底にある可能性があることを示唆しています。ただし、マウス研究のヒトAMDへの翻訳可能性を制限する重要な違いがあります。第一に、マウスには、AMDで優先的に影響を受ける視力に必要な人間の網膜の解剖学的に異なる領域である黄斑がありません。第二に、RPEの菲薄化や空胞化など、マウスの一部のRPE病理は、通常、AMDドナーの目には見られません18。第三に、マウスはAMD病理の特徴であるドルーゼンを発症しません19。ドルーゼンは脂質およびタンパク質を含む沈着物であり、RPE基底膜とブルッフ膜(BrM)の内側コラーゲン層との間に形成される基底膜タンパク質はほとんどありません19。ドルーゼンは、マウスの一般的なサブRPE沈着物であるBLamDとは、その組成と解剖学的位置の両方が異なります。BLamDは、BrMのRPE基底膜とRPE20の基底折り畳みとの間に形成される、年齢およびストレス依存性の細胞外マトリックスに富む異常です。興味深いことに、BLamDはマウスとヒトの両方で同様のタンパク質組成と外観を持っています6、10、21。最近の研究は、BLamDがAMDの後期段階への進行に影響を与えることによってAMDの病態生物学において作用する可能性があることを示唆しています18,22;したがって、これらの沈着物は、マウス網膜における罹患RPEを表し得る。これらの利点と限界に関する知識は、マウス研究の結果をAMDに変換することに関心のある研究者にとって重要です。

このプロトコルでは、RPEの病状を視覚化するために、光、透過電子、および共焦点顕微鏡のために目を準備する方法について説明します。また、統計的検定のためにRPEの病状を偏りのない方法で定量化する方法についても説明します。概念実証として、RPE表現型プロトコルを利用して、膜貫通タンパク質135-(Tmem135)過剰発現マウスおよび老化野生型(WT)C57BL/6Jマウスで観察された構造的RPE病理を調査します。要約すると、現在利用可能な標準プロトコルがないため、AMDマウスモデルでRPEを特徴付けるための表現型決定方法論を説明することを目的としています。AMDマウスモデルでも影響を受ける光受容体または脈絡膜の病状の調査と定量化に関心のある研究者は、このプロトコルが研究に役立たない可能性があります。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物管理および使用委員会によって承認されており、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明に準拠しています。

1. 光学顕微鏡によるマウスRPEの評価

  1. ガラス瓶に室温(RT)で最終濃度が2%のパラホルムアルデヒドと2%のグルタルアルデヒドの固定液バッファーを作ります。
    注:このプロトコルでは、マウスあたり最大14 mLの固定液バッファーが必要です。
    注意: パラホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは有害物質です。これらの物質を取り扱うときは、標準的な操作手順に従ってください。
  2. ヒュームフード内の心臓灌流用の吸収性アンダーパッドに重力供給灌流システムを準備します(補足図1A)。
    1. 40 mLの固定バッファーを灌流システムのシリンジバレルに入れます(補足図1B)。
    2. バルブがチューブラインと平行になるまで回して、バッファーがチューブラインを流れるようにします(補足図1C)。すべての気泡がラインから除去されるまで、バッファーでラインをフラッシュします。
    3. バルブをチューブラインに垂直になるまで回して、バッファーがチューブラインに流れ込まないようにします(補足図1D)。
      注意: これで、灌流システムを使用する準備が整いました。
  3. マウスを二酸化炭素(CO2)チャンバーに入れて安楽死させ、CO2をチャンバー容積の毎分の30%の流量でチャンバー内に流入させる。マウスが呼吸を停止したら、CO2をチャンバーに少なくとも1分間流します。次の手順に進む前に、マウスが不良であることを確認します。
    注:薬理学的物質の注射による安楽死は、このプロトコルではCO2 吸入の代替として使用することができる。
  4. 安楽死させたマウスに心臓灌流を行う。
    1. マウスを灌流システムの近くの浅いトレイに移し、腹部を上に向けてください。腹部に70%エタノール(EtOH)をスプレーします。
    2. 腹腔を露出させるために4つの切開を行います(補足図2A)。
      1. 胸郭の真下にあるマウスの左端の皮膚と腹壁を通して湾曲したハサミと鉗子を使用して5 cmの劣った切り込みを作成します。
      2. 下切り傷の上部から始まるマウスの皮膚と腹壁を通して3 cmの内側の切り込みを入れます。
      3. 胸郭の真下のマウスの最も遠い右側の皮膚と腹壁を通る内側の切り込みの端にさらに5 cm下の切り込みを入れます。
      4. さらに3 cmの内側切開を行い、湾曲した鉗子で腹部の皮膚皮弁を取り除きます。
    3. 横隔膜と胸骨を切り裂いて心臓を露出させます(補足図2B)。
      注意: 心臓、動脈、静脈に傷を付けないように注意してください。これらを刻むと、非効率的な心臓灌流につながります。
    4. ゲージ針を心臓の左心室に挿入します。チューブラインと平行になるまでバルブを回します。右心房を湾曲したハサミで切断し、血液と固定剤が心臓から出るようにします(補足図2C)。
    5. 10 mLの固定バッファーをマウスに少なくとも1〜2分間浸透させるか、肝臓の色が薄くなり、右心房から血液が流れなくなるまで待ちます。.灌流が完了したら、チューブラインに垂直になるまでバルブを回して、バッファーの流れを停止します。
  5. 心臓灌流後にマウスから眼を摘出する。
    1. 浅いトレイからマウスを取り外し、ドラフトの吸収性アンダーパッドにマウスを置きます。左目が実験者の方を向き、右目が見えなくなるようにマウスの頭を向けます。目の上側に組織マーキング染料で注釈を付けます。
    2. 親指と人差し指で眼窩の周りをそっと押し下げて、眼窩から目をはみ出させます(補足図3A)。
    3. 湾曲したはさみを取り、眼窩から30°の角度で刃でそれを保持します。湾曲したハサミで目の周りを30°の角度で切ります(補足図3B)。
      注意: 眼球の完全性を維持するために、眼窩から余分な組織を切り取ってもかまいません。
    4. 湾曲した鉗子で頭から眼球を取り除き、吸収性のアンダーパッドの上に置きます。11番のメスの刃で角膜をニックし、湾曲した鉗子で2 mLの固定バッファーを含む2 mLのマイクロチューブに目を入れます。2 mLマイクロチューブにマウス識別用のラベルを付け、左目を示すために「左」を示します。
      注:角膜の傷は、固定剤がそれをよりよく保存するために目に容易に浸透することを可能にします。
    5. 右目に対して手順1.5.1〜1.5.4を繰り返します。
  6. 固定バッファー中で、4°C(C)室のシェーカー上で毎分75回転(rpm)の速度で一晩インキュベートします。
  7. 固定液バッファーを2 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と交換します。1x PBSで、RTおよび75rpmのシェーカーで10分間目をインキュベートします。この手順を 2 回繰り返します。
  8. 目をきれいにして解剖し、後部セグメントを生成します。
    注:後部セグメントは、角膜、虹彩、および水晶体のない神経網膜、RPE、脈絡膜、および強膜を備えたマウス眼球です。
    1. 解剖顕微鏡下で1x PBSで満たされたペトリ皿に目を置きます(補足図4A)。
    2. 先端の細かい鉗子で脂肪や筋肉を眼球からそっと持ち上げます。眼球が均一な青みがかった黒色になるまで、マイクロ解剖ハサミで眼球と平行方向に脂肪と筋肉を慎重にトリミングします(補足図4B)。
      注意: 眼球を損傷するため、垂直方向に切断しないでください。また、処理中に組織マーキング染料が剥がれた場合は、すぐに眼球の上側に注釈を付け直してください。
    3. 角膜穿刺部位に先端の細かい鉗子を置きます。角膜の周囲を切断し、穿刺部位から始めて、マイクロ解剖ハサミで、眼球から角膜と虹彩を除去します(補足図4C)。
    4. 先端の細かい鉗子を取り、眼球からレンズをそっと取り外して、後部セグメントを生成します(補足図4D)。
    5. 後部セグメントを2 mLの1x PBSを含む2 mLのマイクロチューブに戻します。後部セグメントは4°Cの冷蔵庫に保管してください。
      注:後部セグメントは、さらに処理する前に、4°Cで1x PBSに何週間も留まる可能性があります。
  9. 手順1.3〜1.8を繰り返して、研究の他のマウスから目を準備します。
  10. 切片作成のために、各マウスの後方セグメントの1つをパラフィンに処理して埋め込みます。後部セグメントの上側が上にあることを確認してください。
    注:著者は、これらのタスクを実行するためにウィスコンシン大学マディソン校(UW)の病理学におけるトランスレーショナルリサーチイニシアチブ(TRIP)ラボに依存しています。ここに公開されている、同様のパラフィン処理および埋め込み方法23、24を使用するプロトコルがある。
  11. 各パラフィンブロックをトリミングして切片化し、視神経乳頭を含む厚さ5 μmの網膜切片と、互いに250 μm離れた厚さ5 μmの網膜切片を4つ追加します。スライドにマウスIDとシリアル番号(1、2、3、4、または5)のラベルを付けます。スライドをスライド ボックスに格納します。
    注:著者らは、パラフィン切片作成のサービスをUW TRIPラボに依存しています。ここに、同様のパラフィン切片法25、26を用いた公開されたプロトコルがある。
  12. 網膜切片を含むスライドをヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色します。H&E染色のプロトコルは、 補足図5に記載されています。
    注:H&E染色手順のすべてのステップは、ドラフト内で完了する必要があります。
  13. H&E染色された網膜切片のステッチ画像をスケールバーで、光学顕微鏡を使用して20倍の倍率で収集します。
  14. 各サンプルの視神経乳頭を含む網膜画像におけるRPEの厚さを定量化します。
    1. Fiji ImageJプログラムをダウンロードして開きます。視神経乳頭を含むすべてのステッチ網膜画像をFiji ImageJタスクバーにドラッグします。画像スケールがピクセルではなくμmでキャリブレーションされていることを確認します。
      注意: 画像スケールは、Fiji ImageJプログラムの網膜画像を含むウィンドウの左上隅にあります。スケールがピクセル単位で設定されている場合は、Fiji ImageJプログラムの取扱説明書を参照して、ピクセルをμmに変換してください。
    2. 視神経乳頭の端から網膜の端(鋸歯状突起)までの各画像に300μm間隔ごとにマークを付けます。フィジーImageJタスクバーの ストレート アイコンをクリックします。視神経乳頭の端から長さ300μmの鋸筋に向かって線をクリックしてドラッグします。Fiji ImageJタスクバーの ペイントブラシ ツールをクリックし、300 μmの線の端をクリックしてマークします。
    3. マークされた各間隔でRPEの厚さを測定します。フィジーImageJタスクバーの ストレート アイコンをクリックします。RPEの上から下に線をクリックしてドラッグします(補足図6)。Fiji ImageJメニューバーの [分析>測定 ]をクリックして、RPEの厚さを取得します。
    4. RPE厚さ測定値をスプレッドシートに転送し、測定値を含むカラムにマウス識別のラベルを付けます。追加の列に「マークされた間隔」のラベルを付け、視神経値からの距離(つまり、300、600、900など)を入力します。
      注:最初の測定間隔は視神経から300μm離れており、2番目に測定された間隔は600μm離れています。
  15. 各サンプルの網膜画像に基づいてRPE病理発生率を定量化します。
    1. フィジー ImageJ プログラムを開きます。
    2. Fiji ImageJプログラム内のセルカウンターアプリケーションを開きます。Fiji ImageJメニューバーの[プラグイン]>[セルカウンターの分析]>をクリックします。網膜画像をFiji ImageJタスクバーにドラッグし、セルカウンターウィンドウで初期化をクリックします。
    3. セルカウンターアプリケーションを使用して、網膜切片あたりのRPE病状の数を数えます。[カウンター]の下の[タイプ1]をクリックし、画像内のすべての微小液胞化イベントをクリックします。[カウンター]の下の[タイプ2]をクリックし、画像内のすべてのマクロ液胞化イベントをクリックします。[カウンター] の下の [Type 3] をクリックし、イメージ内のすべての個々の移行イベントをクリックします。
    4. RPE病理の番号をスプレッドシートに転送します。行に微小液胞化、マクロ液胞化、または移行のいずれかのラベルを付け、列にマウス識別のラベルを付けます。
    5. サンプルの他の画像に対して手順1.15.2-1.15.4を繰り返します。サンプルあたりのRPE病理の数を平均し、5で割って、スプレッドシート内のサンプルの各RPE病理の発生率を計算します。
  16. 各区間でのRPEの厚さとRPE病理発生率の統計分析を実行して、研究のグループ間に有意差があるかどうかを判断します。

2. 透過型電子顕微鏡によるマウスRPEの評価

  1. ステップ1.5〜1.9の後に得られた他の後部セグメントを、かみそりの刃で上マークを通して半分に2つのセクションにカットします。切片化された後部セグメントの上側に組織マーキング染料で再注釈を付けます。切片化された後部セグメントを、2 mLの1x PBSとマウス識別を含む新しい2 mLマイクロチューブに分離します。
    注:マウスの後方セグメントは大きすぎて1つのピースで処理できないため、透過型電子顕微鏡処理のために半分にカットする必要があります。
  2. 2 mLの0.1 Mカコジル酸緩衝液、pH 7.2で組織をすすぎます。ベンチトップのRTで10分間インキュベートします。この手順をさらに 2 回繰り返します。
  3. 0.1 Mカコジル酸バッファーを、0.1 Mカコジル酸バッファーで希釈した2 mLの2%四酸化オスミウム(OsO4)と交換します。ドラフト内のRTで1.5時間インキュベートします。
    注意: OsO4 は有毒物質です。OsO4を使用する場合は、標準の操作手順に従ってください。
  4. 組織を2 mLの0.1 Mカコジル酸バッファーで、ドラフト内のRTで10分間すすぎます。この手順を一度繰り返します。
  5. ドラフト内のRTで50%から100%の範囲の段階的なEtOH希釈で組織を脱水します。脱水手順のプロトコルは、 補足図7に記載されています。
  6. 組織から100%EtOHを除去し、組織に2 mLのプロピレンオキシドを加えます。ドラフト内のRTで15分間インキュベートします。組織からプロピレンオキシドを取り除き、2mLの新鮮なプロピレンオキシドを組織に加えます。ドラフト内のRTで15分間インキュベートします。
    注意: プロピレンオキシドは有毒物質です。プロピレンオキシドを取り扱うときは、標準的な操作手順に従ってください。
  7. 組織からプロピレンオキシドを除去し、プロピレンオキシドと樹脂の1:1混合物2mLを組織に追加します。RTのドラフト内の真空下で一晩放置します。
    注意: 樹脂は人体にとって危険な物質です。樹脂を取り扱う際は、ラボの標準操作手順に従ってください。
  8. 組織からのプロピレンオキシドと樹脂の1:1混合物を2mLの純粋な樹脂に置き換えます。RTのドラフト内の真空下で一晩放置します。
  9. 組織を樹脂に埋め込みます。マウス識別ラベルを鉛筆で、樹脂を一滴型に入れます。ティッシュをレジン滴の上に置きます。金型に樹脂を充填し、ドラフト内のRTで1時間真空下に置きます。
  10. ラベルと標本を細い先端の鉗子で再配置し、後眼窩セクションの後側を上にします。ドラフト内のオーブンで65°Cで一晩金型を放置します。
  11. 金型をオーブンから取り出します。金型を冷ましてベンチトップでRTします。型からブロックを取り外します。
    注: これで、ブロックをトリミングする準備が整いました。
  12. 樹脂ブロックをかみそりの刃で形作り、台形にします。視神経乳頭が見えるまでミクロトームを使用して樹脂ブロックをトリミングします。ダイヤモンドナイフを使用して、厚さ0.5μmの樹脂ブロックから半薄切片を切り取ります。
    注:ミクロトーム切片27に関する公開されたプロトコルは次のとおりです。必要に応じて、樹脂ブロックから厚さ0.5 μmの半薄切片を採取して染色し、サンプルの完全性を評価することができます。
  13. トリミングした各ブロックから厚さ70 nmの超薄切片をウルトラミクロトームで切り取ります。400メッシュの薄いバー銅グリッド上の厚さ70nmの超薄切片を収集します。グリッドをグリッド収納ボックスに入れ、マウス識別でスロットにラベルを付けます。
    注:これは、ウルトラミクロトーム切片28に関する公開されたプロトコルです。
  14. グリッドを2%酢酸ウラニルで5分間染色し、次に3.5%クエン酸鉛溶液でドラフト内のRTで5分間染色します。
    注意: 酢酸ウラニルとクエン酸鉛は有害物質です。これらの物質を取り扱うときは、標準的な操作手順に従ってください。
  15. 透過型電子顕微鏡を用いて、銅グリッドのグリッド線がRPEとBrMと交差する倍率15,000倍で各試料の画像を取得します。
    注:セクションごとに少なくとも20〜35枚の画像、サンプルごとに40〜70枚の画像が必要です。
  16. 研究のサンプルの画像でBLamDの高さを定量化します。
    1. フィジー ImageJ プログラムを開きます。サンプルセクションからFiji ImageJタスクバーにすべての画像をドラッグします。画像がピクセルではなくμmでキャリブレーションされていることを確認します。
    2. 画像内のBLamDの高さを測定します。フィジーImageJタスクバーの ストレート アイコンをクリックします。BrMの弾性単層から画像内の最も高い堆積物の上部まで線をクリックしてドラッグします(補足図8)。Fiji ImageJ メニュー バーの [ 解析>計測 ] をクリックして、画像の BLamD の高さを取得します。
      注:画像にBLamDがない場合は、BrMの弾性単層からRPEの基底層まで線を引きます。
    3. BLamDの高さをスプレッドシートに転送し、マウス識別でラベルを付けます。
  17. スプレッドシートで、遺伝子型ごとのBLamD身長の累積頻度とマウスあたりのBLamD身長の平均を計算します。BLamDの高さの平均について統計分析を実行して、研究のグループ間に有意差があるかどうかを判断します。

3. 共焦点顕微鏡によるマウスRPEの評価

  1. マウスから目を集める。ステップ1.3に記載した手順に従ってマウスを安楽死させる。手順1.5を使用して目を除核します。湾曲した鉗子を使用して、2 mLの1x PBSとマウス識別を含む2 mLマイクロチューブに目を入れます。
    注:光受容体とRPE頂端プロセスの相互デジタル化により、共焦点顕微鏡によるRPEのより良い視覚化が可能になるため、マウスを暗順応させないでください。
  2. マウスの目をすぐにきれいにして解剖し、マウスの後眼窏を生成します。
    注:後部アイカップは、神経網膜を含まないため、後部セグメントとは異なります。
    1. 解剖顕微鏡下で1x PBSを含むシャーレに眼を移します(補足図9A)。
    2. ステップ1.8.2(補足図9B)で説明されているように、眼球から脂肪と筋肉を取り除きます。
    3. 11番のメスの刃で眼球の角膜をニックします。手順1.8.3(補足図9C)で詳しく説明されているように、角膜と虹彩を取り除きます。
    4. 先端の細かい鉗子でレンズを引き出します。先端の細かい鉗子を2つ取り、神経網膜を後部からそっと分離します。
    5. 後眼窯から取り外すために、視神経乳頭の神経網膜を注意深く切断します(補足図9D)。
    6. 後眼球を、マウス識別付きの500 μLの1x PBSを含む新しい2 mLマイクロチューブに入れます。
  3. 後部アイカップをメタノール(MeOH)で固定します(補足図10)。
    注: 手順 3.3 の完了には約 2 時間 40 分かかります。
    1. 500 μLのMeOHを組織に加えます。シェーカーで75 rpmでRTで5分間インキュベートします。
    2. 組織から500μLの溶液を取り除き、500μLのMeOHを加えます。シェーカー上で75 rpmで5分間、RTで5分間インキュベートします。 この手順をもう一度繰り返します。
    3. 組織から溶液全体を取り除き、500μLのMeOHを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで少なくとも2時間インキュベートします。
      注意: ステップ3.3.3の代わりに、後部アイカップをMeOH中で4°Cの部屋で75rpmのシェーカーで一晩インキュベートすることができます。
    4. 500 μLの1x PBSを組織に加えます。シェーカーで75 rpmでRTで5分間インキュベートします。
    5. 組織から500 μLの溶液を取り除き、500 μLの1x PBSを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで5分間インキュベートします。 この手順をもう一度繰り返します。
    6. 組織から溶液全体を取り除き、500 μLの1x PBSと交換します。
      注意: 組織はMeOHによって完全に固定されており、4°Cの冷蔵庫に少なくとも1か月間保管できます。
  4. 後眼珠の免疫蛍光染色を行い、RPEのタイトジャンクションと核を可視化します(補足図11)。
    1. サンプルから500 μLの1x PBSを取り除き、1x PBS溶液に希釈した10%正常ロバ血清100 μLを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで30分間インキュベートします。
    2. 希釈した10%正常ロバ血清溶液をサンプルから取り出し、1x PBSでウサギポリクローナル抗ゾヌラオクルーデンス-1(ZO-1)抗体の1:50希釈液を100 μL加えます。サンプルを4°Cの部屋に移し、75 rpmのシェーカーで一晩インキュベートします。
    3. サンプルから抗体希釈液を取り除き、2 mLの1x PBSを加えます。シェーカーで75 rpmでRTで10分間インキュベートします。 この手順をさらに 2 回繰り返します。
    4. サンプルから1x PBSを取り除きます。488 蛍光色素標識タグを有するロバ抗ウサギ IgG 抗体の 1:250 希釈液と 1:250 希釈液の 4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) を 1x PBS でサンプルに加えます。サンプルをアルミホイルで覆い、シェーカー上で75 rpmでRTで2時間インキュベートします。
      注意: 光退色を防ぐために、サンプルはアルミホイルで完全に覆う必要があります。
    5. サンプルから抗体およびDAPI希釈液を除去します。サンプルに2 mLの1x PBSを加え、アルミホイルで再び覆い、シェーカー上で75 rpmでRTで10分間インキュベートします。 この手順をさらに 3 回繰り返します。
      注:RPEのタイトジャンクションと核は、それぞれ完全に標識され、染色されています。
  5. 後部アイカップを顕微鏡スライドに取り付けます。
    1. 顕微鏡スライドにマウス識別のラベルを付けます。後眼球を、脈絡膜側を下に向けて解剖顕微鏡下の顕微鏡スライドに移します。後眼球に1x PBSを1滴加えて、乾燥を防ぎます(補足図12)。
    2. 11番のメスの刃を使用して、基本的な方向(つまり、北、東、南、西)に対応する4つの象限を生成する4つのスポットで後眼窬を切断します。後部アイカップの周囲から組織で過剰な1xPBSを軽くたたきます。ラクダのヘアブラシと先端の細い鉗子で後眼碗をそっと平らにします(補足図12)。
      注意: 結果として得られる製品は、現在RPEフラットマウントとして知られています。
    3. RPEフラットマウントに封入媒体を一滴加え、その上にカバーガラスを置きます。透明なマニキュアを塗ってカバーガラスを密封し、閉じた引き出しの中でRTで少なくとも30分間乾燥させます。スライドをスライドキャリアボックスに置き、ボックスを4°Cの冷蔵庫に保管します。
      注意: RPEフラットマウントに気泡が入らないように注意してください。RPEフラットマウントは、2週間の時間枠内でイメージングできます。
  6. RPEフラットマウントの視神経を囲む4つの象限のそれぞれの画像を、各サンプルの20倍の倍率で共焦点顕微鏡で取得します。RPEフラットマウントイメージの例については、 補足図13Aを参照してください。
    注意: RPEフラットマウントの寸法の違いを補正するために、複数の画像を撮影して積み重ねるRPEフラットマウントのzスタックイメージングを実行する必要がある場合があります。
  7. 各RPEフラットマウントイメージ内のRPEセルのタイトジャンクションをトレースします。トレースされたRPEフラットマウントイメージの例は、 補足図13Bにあります。
    1. フィジー ImageJ プログラムを開きます。RPE フラットマウントイメージをフィジー ImageJ タスクバーにドラッグします。画像がピクセル単位ではなくマイクロメートル単位でキャリブレーションされていることを確認します。
    2. Fiji ImageJタスクバーのオーバーレイブラシツールアイコンをダブルクリックして、ブラシ幅を3、透明度を0、色を赤に設定します。オーバーレイブラシツールウィンドウの閉じるボタンをクリックします。
    3. オーバーレイブラシツールアイコンをクリックします。完全に画像内にあるすべてのRPEセルのタイトジャンクションをクリックしてドラッグします。
      注意: トレースミスが発生した場合は、オーバーレイブラシツールアイコンをダブルクリックし、[オーバーレイブラシツール]ウィンドウの[元に戻す]ボックスをクリックして、画像からトレースミスを削除します。
    4. Fiji ImageJ タスクバーの 長方形 アイコンをクリックします。画像をクリックして、画像の周囲をドラッグします。Fiji ImageJ メニュー バーの [ 編集>クリア ] をクリックして、トレースされた線を保持し、画像から青と緑の色を削除します。
    5. マウスの識別、象限の位置(つまり、北、南、東、または西)、およびCPサフィックスラベルを使用して、トレースイメージを適切な場所に保存します。
      メモ: 手順 3.7.4 を完了する前に RPE トレースイメージを保存しないでください。
  8. 各サンプルのRPE細胞面積を計算します。
    1. RPEエリア分析からファイルを保存する場所を指定するには、パソコンのデスクトップ画面にフォルダを作成します。各RPEトレースイメージのサブフォルダを生成し、マウス識別と象限位置(北、南、東、または西)でサブフォルダにラベルを付けます。
    2. セルプロファイラプログラムをインストールして開きます29.Ikeda_RPE面積計算器.cpproj (補足コーディング ファイル 1) プロジェクト ファイルをダウンロードします。セルプロファイラーのプログラムメニューバーで >ファイルプロジェクトを開く をクリックして、Ikeda_RPE面積計算機.cpprojファイルを開きます。
    3. 1 つの RPE トレース イメージを Cell Profiler プログラム ウィンドウの [イメージ>ここにファイルとフォルダーをドロップ ] ボックスにドラッグします。
    4. フォルダの場所を、RPE トレースイメージに対応する Cell Profiler プログラムに入力します。Cell Profilerプログラムウィンドウの左下隅にある出力設定ボタンをクリックし、[デフォルトの入力フォルダー]テキストボックスと[デフォルトの出力フォルダー]テキストボックスにフォルダーの場所を入力します。
    5. セルプロファイラープログラムウィンドウの左下隅にある[画像の分析]ボタンをクリックします。分析が完了すると、画面に[分析完了]ウィンドウが表示されます。[分析の完了]ウィンドウの[OK]ボタンをクリックします。
      注: この操作により、csv ファイルと jpeg 画像が生成されます。csv ファイルには、トレース イメージ内の RPE セルの領域が含まれます。jpeg画像はRPEトレース画像に対応し、各RPEセルには番号が付けられます(補足図13C)。
    6. RPE 領域を csv ファイルからスプレッドシートに転送します。スプレッドシートにマウス識別のラベルを付けます。
    7. csv ファイル内の各 RPE 領域が jpeg 画像内の完全にトレースされた RPE セルにリンクしていることを確認して、データの品質管理調査を実行します。完全にトレースされたRPEセルに対応しない値をスプレッドシートから削除します。
    8. セルプロファイラプログラムに戻ります。「 ファイルとフォルダをここにドロップ 」ボックスで RPE トレース・イメージ名を右クリックし 、「リストをクリア 」を選択して、Cell Profiler プログラムからイメージを削除します。
    9. 手順3.8.3〜3.8.8を繰り返して、サンプルの残りの3つのRPEトレース画像のRPEサイズを計算します。
  9. スプレッドシート内の各サンプルのRPEセルサイズ平均を定量化します。
  10. スプレッドシート内の各サンプルのRPE細胞密度を定量化します。RPEセル密度を計算するには、象限当たりのRPE細胞の総数を、セルプロファイラプログラムによって検出された象限当たりのRPE細胞の総面積で割る。サンプルあたり4つの象限からRPE細胞密度の平均を決定します。
  11. 各サンプルのRPEフラットマウントあたりの多核RPE細胞の数を定量化します。手順 1.15.1-1.15.3 で説明したように、Fiji ImageJ プログラム内の Cell Counter アプリケーションを使用して、サンプルの 4 つの象限で 3 つ以上の核を持つ RPE 細胞の数をカウントします。
  12. RPE細胞のサイズと密度の平均、および多核RPE細胞の数について統計分析を実行して、研究のグループ間に有意差があるかどうかを判断します。

結果

この記事に記載されているRPE表現型プロトコルの完成により、AMDのマウスモデルで一般的に観察される構造的RPE異常の定量的分析が可能になります。このプロトコルの有効性を確認するために、ニワトリベータアクチンプロモーター(Tmem135 TG)30によって駆動されるWT Tmem135を過剰発現するトランスジェニックマウスや、高齢のC57BL/6Jマウス31,32

ディスカッション

本稿では、マウスモデルの構造的RPE病理を評価するための表現型プロトコールについて紹介しました。光、透過電子、共焦点顕微鏡など、さまざまなイメージング技術のために眼を処理するために必要な手順と、これらのイメージング方法で観察される典型的な病状の定量について説明しました。Tmem135 TGおよび24ヶ月齢のWTマウスはRPE病理30,31,32

開示事項

このプロトコルの著者には、開示や利益相反はありません。

謝辞

著者らは、木下聡とウィスコンシン大学(UW)の病理学研究所(TRIP)におけるトランスレーショナルリサーチイニシアチブが、光学顕微鏡用に組織を調製してくれたことに感謝したいと思います。このコアは、ウィスコンシン大学炭素がんセンターのUW病理学および検査医学部門(P30 CA014520)、およびNIH所長室(S10OD023526)によってサポートされています。共焦点顕微鏡は、UW生化学基金の支援を受けて設立されたUW生化学光学コアで実施されました。この研究は、国立眼科研究所からの助成金によっても支援されました(R01EY022086から池田敦;R01EY031748からC.ボウズリックマンへ。P30EY016665をUWの眼科および視覚科学科に。デュークアイセンターへのP30EY005722。NIH T32EY027721からM.ランドウスキーへ。F32EY032766からM.ランドウスキーへ)、ティモシーウィリアムトラウト会長(池田A)、FFBフリーファミリーAMDアワード(C.ボウズリックマン);失明を防ぐための研究(デュークアイセンター)からの無制限の助成金。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2PolyScientiifc R&D CompanyS1619
100 Capacity Slide BoxTwo are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol MDS Warehouse2292-CASECan be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer LocksQosina11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubesGenesee Scientific 24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute MoldElectron Microscopy Sciences70165
24 inch PVC Tubing with Luer EndsFisher ScientificNC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh GridsElectron Microscopy SciencesT400-Cu
95% EthanolMDS Warehouse2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)VWR56616-031
Adjustable 237 ml  Spray BottleVWR23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe NeedleSigma-Aldrich Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip WidthRoboz Surgical InstrumentRS-5211Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair BrushElectron Microscopy Sciences65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension ClampsFisher Scientific 05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support StandFisher Scientific 11-474-207
Cell Prolifer ProgramAvailable to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Colorfrost Microscope Slides LavenderVWR10118-956
Computer
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
Distilled H20Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55Roboz Surgical InstrumentRS-4984Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid HolderElectron Microscopy Sciences71147-01
EPON 815 ResinElectron Microscopy Sciences14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow DyeFisher Scientific 22050460Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting MediaFisher Scientific22-110-610Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light SourceDolan-Jenner IndustriesMi-150Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ ProgramAvailable to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook ConnectorThermo Scientific  14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%Electron Microscopy Sciences16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop ShakerTwo are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag LabelsElectron Microscopy Sciences77564-05
Lead CitrateElectron Microscopy Sciences17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlipsThermo Fisher Scientific22X22I24788001LSUse these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's HematoxylinVWR100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5600Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
MethanolFisher Scientific A412-4
MiceAny AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall LengthRoboz Surgical InstrumentRS-5913Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey SerumSouthernBiotech0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel BladesVWR21909-380
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences19150
Paraformaldehyde, 32%Electron Microscopy Sciences15714-S
Pencil
Petri DishVWR 21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 AntibodyThermo Fisher Scientific402200
Propylene OxideElectron Microscopy Sciences20412
Razor BladeVWR10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y AlcoholicVWR89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent MarkerStaples642736
Slide Rack for StainingGrainger49WF31
Squared Cover Glass SlipsFisher Scientific 12-541B
Staining Dish with CoverGrainger49WF30Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe Thermo Scientific S7510-50Use only the syringe barrel.
TimerFisher1464917
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000Use for mounting RPE flat mounts. 
XyleneFisher Scientific 22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light MicroscopeThis microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting MicroscopeElectron Microscopy Sciences65575-02

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