Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Zusammenfassung

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Zusammenfassung

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine schwächende Netzhauterkrankung in alternden Bevölkerungen. Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysfunktion des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein wichtiges pathobiologisches Ereignis bei AMD ist. Um die Mechanismen zu verstehen, die zu einer RPE-Dysfunktion führen, können Mausmodelle von Forschern verwendet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mäuse RPE-Pathologien entwickeln können, von denen einige in den Augen von Personen beobachtet werden, bei denen AMD diagnostiziert wurde. Hier beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung von RPE-Pathologien in Mäusen. Dieses Protokoll umfasst die Präparation und Auswertung von Netzhautquerschnitten mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sowie von RPE-Flachfassungen mittels konfokaler Mikroskopie. Wir beschreiben detailliert die häufigsten Arten von murinen RPE-Pathologien, die mit diesen Techniken beobachtet werden, und Möglichkeiten, sie durch unvoreingenommene Methoden für statistische Tests zu quantifizieren. Als Proof-of-Concept verwenden wir dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die RPE-Pathologien zu quantifizieren, die bei Mäusen mit Überexpression des Transmembranproteins 135 (Tmem135) und gealterten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurden. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Standardmethoden zur RPE-Phänotypisierung mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler zu präsentieren, die Mausmodelle der AMD verwenden.

Einleitung

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft¹. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD² ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten³. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle^4,5 und Mäuse ^6,7,8. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurden standardisierte Protokolle und Qualitätskontrollkriterien für RPE-Zellkulturmodelle^{beschrieben 4}, jedoch wurde in keinem Bericht versucht, die Phänotypisierung des RPE in Mausmodellen zu standardisieren. Tatsächlich fehlt in vielen Veröffentlichungen zu Mausmodellen der AMD eine vollständige Beschreibung des RPE oder eine Quantifizierung der RPE-Pathologien in ihnen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Standard-RPE-Phänotypisierungsmethoden mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler mit AMD-Mausmodellen zu präsentieren.

Frühere Veröffentlichungen haben das Vorhandensein mehrerer RPE-Pathologien bei Mäusen durch drei bildgebende Verfahren festgestellt. Die Lichtmikroskopie ermöglicht es Forschern beispielsweise, die grobe Morphologie der murinen Netzhaut zu betrachten (Abbildung 1A) und RPE-Pathologien wie RPE-Verdünnung, Vakuolisierung und Migration zu erkennen. Die RPE-Ausdünnung in einem AMD-Mausmodell wird durch eine Abweichung der RPE-Höhe von den jeweiligen Kontrollen veranschaulicht (Abbildung 1B). Die RPE-Vakuolisierung kann in zwei separate Kategorien unterteilt werden: Mikrovakuolisierung (Abbildung 1C) und Makrovakuolisierung (Abbildung 1D). Die RPE-Mikrovakuolisierung wird durch das Vorhandensein von Vakuolen im RPE zusammengefasst, die seine Gesamthöhe nicht beeinflussen, während die Makrovakuolisierung durch das Vorhandensein von Vakuolen angezeigt wird, die in die äußeren Segmente der Photorezeptoren hineinragen. Die RPE-Migration wird durch das fokale Pigmentaggregat oberhalb der RPE-Monoschicht in einem Netzhautquerschnitt unterschieden (Abbildung 1E). Es sollte beachtet werden, dass migrierende RPE-Zellen in AMD-Spenderaugen Immunreaktivität gegenüber Immunzellmarkern wie dem Cluster of Differentiation 68 (CD68)⁹ aufweisen und Immunzellen darstellen könnten, die RPE-Trümmer verschlingen, oder RPE, die sich einer^{Transdifferenzierung} unterziehen9. Ein weiteres bildgebendes Verfahren, die sogenannte Transmissionselektronenmikroskopie, kann es den Forschern ermöglichen, die Ultrastruktur des RPE und seiner Basalmembran sichtbar zu machen (Abbildung 2A). Mit dieser Technik kann die vorherrschende Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen identifiziert werden, die als basale laminare Ablagerung (BLamD) bekannt ist (Abbildung 2B)¹⁰. Schließlich kann die konfokale Mikroskopie die Struktur von RPE-Zellen durch die Abbildung von RPE-Flachhalterungen aufdecken (Abbildung 3A). Mit dieser Methode kann die RPE-Dysmorphie, die Abweichung des RPE von seiner klassischen Wabenform (Abbildung 3B), aufgedeckt werden. Es kann auch die RPE-Mehrkernbildung erkennen, d. h. das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen innerhalb einer RPE-Zelle (Abbildung 3C). Für eine Zusammenfassung der Arten von RPE-Pathologien, die in aktuellen AMD-Mausmodellen vorhanden sind, verweisen wir Forscher auf diese Übersichtsarbeiten aus der Literatur ^6,7.

Forscher, die AMD untersuchen, sollten sich der Vor- und Nachteile der Verwendung von Mäusen zur Untersuchung von RPE-Pathologien vor dem Phänotypisierungsprotokoll bewusst sein. Mäuse zeichnen sich durch ihre relativ kurze Lebensdauer und Kosteneffizienz sowie ihre genetische und pharmakologische Manipulierbarkeit aus. Mäuse weisen auch degenerative RPE-Veränderungen auf, einschließlich RPE-Migration, Dysmorphie und Mehrkernbildung, die in AMD-Spenderaugen beobachtet werden 11,12,13,14,15,16,17; Dies deutet darauf hin, dass ähnliche Mechanismen der Entwicklung dieser RPE-Pathologien bei Mäusen und Menschen zugrunde liegen könnten. Es gibt jedoch wesentliche Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Mausstudien auf die menschliche AMD einschränken. Erstens haben Mäuse keine Makula, eine anatomisch unterschiedliche Region der menschlichen Netzhaut, die für die Sehschärfe notwendig ist und bei AMD bevorzugt betroffen ist. Zweitens werden einige RPE-Pathologien bei Mäusen, wie z. B. RPE-Verdünnung und Vakuolisierung, typischerweise nicht in AMD-Spenderaugen beobachtet¹⁸. Drittens entwickeln Mäuse keine Drusen, ein Kennzeichen der AMD-Pathologie¹⁹. Drusen sind lipid- und proteinhaltige Ablagerungen mit sehr wenigen Basalmembranproteinen, die sich zwischen der RPE-Basallamina und der inneren kollagenen Schicht der Bruchschen Membran (BrM) ^bilden19. Drusen unterscheiden sich sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer anatomischen Lage von BLamD, der häufigen Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen. BLamDs sind alters- und stressabhängige extrazelluläre Matrix-angereicherte Anomalien, die sich zwischen der RPE-Basallamina von BrM und den basalen Infoldings des RPE²⁰ bilden. Interessanterweise haben BLamDs sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen eine ähnliche Proteinzusammensetzung und ein ähnliches Aussehen ^6,10,21. Neuere Arbeiten deuten darauf hin, dass BLamDs in der Pathobiologie der AMD eine Rolle spielen können, indem sie das Fortschreiten der AMD in ihre späteren Stadien beeinflussen^18,22; Daher können diese Ablagerungen erkranktes RPE in der Netzhaut der Maus darstellen. Das Wissen um diese Vorteile und Einschränkungen ist für Forscher, die daran interessiert sind, Ergebnisse aus Mausstudien auf AMD zu übertragen, von entscheidender Bedeutung.

In diesem Protokoll diskutieren wir die Methoden zur Vorbereitung der Augen auf Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie zur Visualisierung von RPE-Pathologien. Wir beschreiben auch, wie RPE-Pathologien für statistische Tests unvoreingenommen quantifiziert werden können. Als Proof-of-Concept verwenden wir das RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die strukturellen RPE-Pathologien zu untersuchen, die in transmembranprotein 135- (Tmem135) überexprimierenden Mäusen und gealterten Wildtyp (WT) C57BL/6J Mäusen beobachtet wurden. Zusammenfassend ist es unser Ziel, die Phänotypisierungsmethodik zur Charakterisierung des RPE in AMD-Mausmodellen zu beschreiben, da derzeit keine Standardprotokolle verfügbar sind. Forscher, die daran interessiert sind, Pathologien der Photorezeptoren oder der Aderhaut zu untersuchen und zu quantifizieren, die auch in AMD-Mausmodellen betroffen sind, finden dieses Protokoll möglicherweise nicht nützlich für ihre Studien.

Protokoll

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Wisconsin-Madison genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Auswertung des RPE der Maus mittels Lichtmikroskopie

1. Stellen Sie in einer Glasflasche einen Fixierpuffer mit einer Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd bei Raumtemperatur (RT) her.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert höchstens 14 ml Fixierpuffer pro Maus.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd sind gefährliche Stoffe. Bitte befolgen Sie bei der Arbeit mit diesen Stoffen die Standardarbeitsanweisungen.
2. Bereiten Sie ein Perfusionssystem mit Schwerkraftzufuhr auf einer saugfähigen Unterlage für die Herzperfusion in einem Abzug vor (ergänzende Abbildung 1A).
   1. Geben Sie 40 ml des Fixierpuffers in den Spritzenzylinder des Perfusionssystems (ergänzende Abbildung 1B).
   2. Drehen Sie das Ventil, bis es parallel zur Schlauchleitung ist, damit der Puffer durch die Schlauchleitung fließen kann (ergänzende Abbildung 1C). Spülen Sie die Leitung mit Puffer, bis alle Luftblasen von der Leitung entfernt sind.
   3. Drehen Sie das Ventil, bis es senkrecht zur Schlauchleitung steht, um zu verhindern, dass der Puffer in die Schlauchleitung fließt (ergänzende Abbildung 1D).
      Anmerkungen: Das Perfusionssystem ist jetzt einsatzbereit.
3. Euthanasieren Sie die Maus, indem Sie sie in eine Kohlendioxid (CO 2) -Kammer legen und CO₂ mit einer Durchflussrate von 30 % des Kammervolumens pro Minute in die Kammer fließen lassen. Sobald die Maus aufhört zu atmen, lassen Sie CO₂ mindestens 1 Minute lang in die Kammer strömen. Vergewissern Sie sich, dass die Maus tot ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   HINWEIS: Euthanasie durch Injektion pharmakologischer Wirkstoffe kann in diesem Protokoll als Alternative zur CO_{2 -} Inhalation verwendet werden.
4. Führen Sie eine Herzdurchblutung an der euthanasierten Maus durch.
   1. Legen Sie die Maus mit dem Bauch nach oben in ein flaches Tablett in der Nähe des Perfusionssystems. Besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol (EtOH).
   2. Machen Sie vier Schnitte, um die Bauchhöhle freizulegen (ergänzende Abbildung 2A).
      1. Machen Sie mit einer gebogenen Schere und einer Pinzette einen 5 cm tieferen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke auf der äußersten linken Seite der Maus, die sich direkt unter dem Brustkorb befindet.
      2. Fahren Sie mit einem 3 cm langen medialen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke der Maus fort, der oben am unteren Schnitt beginnt.
      3. Machen Sie einen weiteren 5 cm unteren Schnitt am Ende des medialen Schnitts durch die Haut und Bauchdecke auf der äußersten rechten Seite der Maus direkt unter dem Brustkorb.
      4. Machen Sie einen weiteren 3 cm medialen Schnitt, um den Bauchhautlappen mit einer gebogenen Pinzette zu entfernen.
   3. Durchtrennen Sie das Zwerchfell und das Brustbein, um das Herz freizulegen (ergänzende Abbildung 2B).
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, das Herz, die Arterien und die Venen nicht einzuschneiden. Das Einschneiden dieser führt zu einer ineffizienten Herzdurchblutung.
   4. Führen Sie die Messnadel in die linke Herzkammer ein. Drehen Sie das Ventil, bis es parallel zur Schlauchleitung ist. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer gebogenen Schere durch, damit Blut und Fixiermittel aus dem Herzen austreten können (ergänzende Abbildung 2C).
   5. Lassen Sie 10 ml Fixierpuffer mindestens 1-2 Minuten lang in die Maus eindringen oder bis die Leber blass wird und kein Blut mehr aus dem rechten Vorhof fließt. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, drehen Sie das Ventil, bis es senkrecht zur Schlauchleitung steht, um den Durchfluss des Puffers zu stoppen.
5. Entkernen Sie die Augen der Maus nach der Herzdurchblutung.
   1. Nehmen Sie die Maus aus der flachen Schale und legen Sie die Maus auf die saugfähige Unterlage in einem Abzug. Richten Sie den Kopf der Maus so aus, dass das linke Auge dem Experimentator zugewandt ist und das rechte Auge nicht sichtbar ist. Markieren Sie die obere Seite des Auges mit einem Gewebemarkierungsfarbstoff.
   2. Drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger vorsichtig um die Augenhöhle nach unten, um eine Vorwölbung des Auges aus der Augenhöhle zu bewirken (ergänzende Abbildung 3A).
   3. Nehmen Sie eine gebogene Schere und halten Sie sie mit der Klinge in einem 30°-Winkel zur Augenhöhle. Schneiden Sie mit der gebogenen Schere in einem Winkel von 30° um das Auge herum (ergänzende Abbildung 3B).
      Anmerkungen: Es ist in Ordnung, überschüssiges Gewebe aus der Augenhöhle zu schneiden, um die Integrität des Augapfels zu erhalten.
   4. Entfernen Sie den Augapfel mit einer gebogenen Pinzette vom Kopf und legen Sie ihn auf eine saugfähige Unterlage. Schneiden Sie die Hornhaut mit einer Skalpellklinge Nummer 11 ein und legen Sie das Auge mit einer gebogenen Pinzette in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit 2 ml Fixierpuffer. Beschriften Sie das 2-ml-Mikroröhrchen mit der Mausidentifikation und "links", um das linke Auge anzuzeigen.
      Anmerkungen: Die Kerbe in der Hornhaut ermöglicht es dem Fixiermittel, leicht in das Auge einzudringen, um es besser zu erhalten.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.4 für das rechte Auge.
6. Lassen Sie die Augen über Nacht in einem Schüttler in einem Raum bei 4 °C (C) bei einer Geschwindigkeit von 75 Umdrehungen pro Minute (U/min) in Fixierpuffer inkubieren.
7. Ersetzen Sie den Fixierpuffer durch 2 ml 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS). Inkubieren Sie die Augen in 1x PBS für 10 min auf einem Shaker bei RT und 75 U/min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
8. Reinigen und sezieren Sie die Augen, um hintere Segmente zu erzeugen.
   HINWEIS: Das hintere Segment ist der Augapfel der Maus mit der neuralen Netzhaut, RPE, Aderhaut und Sklera ohne Hornhaut, Iris und Linse.
   1. Das Auge wird unter einem Präpariermikroskop in eine mit 1x PBS gefüllte Petrischale gelegt (ergänzende Abbildung 4A).
   2. Heben Sie Fett und Muskeln vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze vom Augapfel ab. Schneiden Sie das Fett und die Muskeln vorsichtig mit einer Mikropräparierschere in paralleler Richtung zum Augapfel ab, bis der Augapfel eine gleichmäßige bläulich-schwarze Farbe hat (ergänzende Abbildung 4B).
      Anmerkungen: Schneiden Sie nicht in senkrechter Richtung, da dies den Augapfel beschädigt. Wenn sich der Gewebemarkierungsfarbstoff während der Verarbeitung löst, beschriften Sie die obere Seite des Augapfels sofort.
   3. Setzen Sie eine Pinzette mit feiner Spitze an der Hornhautpunktionsstelle an. Schneiden Sie mit einer Mikropräparierschere um den Umfang der Hornhaut, beginnend an der Einstichstelle, um die Hornhaut und die Iris aus dem Augapfel zu entfernen (ergänzende Abbildung 4C).
   4. Nehmen Sie eine Pinzette mit feiner Spitze und entfernen Sie die Linse vorsichtig aus dem Augapfel, um den hinteren Augenabschnitt freizulegen (ergänzende Abbildung 4D).
   5. Legen Sie den hinteren Augenabschnitt wieder in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit 2 ml 1x PBS. Lagern Sie den hinteren Augenabschnitt im Kühlschrank bei 4 °C.
      HINWEIS: Hintere Segmente können vor der Weiterverarbeitung viele Wochen in 1x PBS bei 4 °C verbleiben.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.8, um die Augen anderer Mäuse in der Studie vorzubereiten.
10. Verarbeiten und betten Sie eines der hinteren Segmente jeder Maus zum Schneiden in Paraffin ein. Stellen Sie sicher, dass die obere Seite des hinteren Augenabschnitts oben liegt.
    HINWEIS: Die Autoren verlassen sich bei der Durchführung dieser Aufgaben auf das Labor der University of Wisconsin-Madison (UW) Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP). Hier sind veröffentlichte Protokolle, die eine ähnliche Paraffinverarbeitungs- und Einbettungsmethode verwenden^23,24.
11. Kürzen und schneiden Sie jeden Paraffinblock, um einen 5 μm dicken Netzhautabschnitt zu erhalten, der den Sehnervenkopf umfasst, sowie vier weitere 5 μm dicke Netzhautabschnitte, die 250 μm voneinander entfernt sind. Beschriften Sie die Folien mit der Mauskennung und der Seriennummer des Seriennummernabschnitts (z. B. 1, 2, 3, 4 oder 5). Bewahren Sie die Objektträger in einem Objektträgerkasten auf.
    HINWEIS: Die Autoren verlassen sich auf das UW TRIP-Labor für ihre Dienste bei der Paraffinschnittierung. Hier sind veröffentlichte Protokolle, die eine ähnliche Paraffin-Schnittmethode verwenden^25,26.
12. Färben Sie die Objektträger, die Netzhautschnitte enthalten, mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Ein Protokoll der H&E-Färbung finden Sie in der ergänzenden Abbildung 5.
    Anmerkungen: Alle Schritte des H&E-Färbeverfahrens müssen in einem Abzug durchgeführt werden.
13. Sammeln Sie zusammengesetzte Bilder von H&E-gefärbten Netzhautschnitten mit einem Maßstabsbalken unter Verwendung eines Lichtmikroskops bei 20-facher Vergrößerung.
14. Quantifizieren Sie die RPE-Dicke in den Netzhautbildern, die den Sehnervenkopf für jede Probe enthalten.
    1. Laden Sie das Programm Fiji ImageJ herunter und öffnen Sie es. Ziehen Sie alle zusammengefügten Netzhautbilder, die den Sehnervenkopf enthalten, in die Fiji ImageJ-Taskleiste. Stellen Sie sicher, dass der Bildmaßstab in μm und nicht in Pixeln kalibriert ist.
       HINWEIS: Der Bildmaßstab befindet sich in der oberen linken Ecke des Fensters, das ein Netzhautbild im Programm Fiji ImageJ enthält. Wenn die Skalierung in Pixeln eingestellt ist, lesen Sie bitte die Bedienungsanleitung des Fiji ImageJ-Programms, um Pixel in μm umzuwandeln.
    2. Markieren Sie in jedem Bild alle 300 μm vom Rand des Sehnervenkopfes bis zum Ende der Netzhaut (Ora serrata). Klicken Sie auf das gerade Symbol in der Fiji ImageJ-Taskleiste. Klicken und ziehen Sie eine Linie vom Rand des Sehnervenkopfes in Richtung der Ora serrata, die 300 μm lang ist. Klicken Sie auf das Pinselwerkzeug in der Fiji ImageJ-Taskleiste und klicken Sie auf das Ende der 300-μm-Linie, um sie zu markieren.
    3. Messen Sie die RPE-Dicke in jedem markierten Intervall. Klicken Sie auf das gerade Symbol in der Fiji ImageJ-Taskleiste. Klicken Sie auf eine Linie, und ziehen Sie sie von oben nach unten (ergänzende Abbildung 6). Klicken Sie in der Menüleiste von Fiji ImageJ auf Analyze > Measure , um die RPE-Dicke zu erhalten.
    4. Übertragen Sie die RPE-Dickenmessungen in eine Tabelle und beschriften Sie die Spalte, die die Messwerte enthält, mit der Maus. Beschriften Sie eine zusätzliche Spalte mit "Markiertes Intervall" und geben Sie den Abstand zu den Sehnervenwerten ein (z. B. 300, 600, 900 usw.).
       HINWEIS: Das erste Messintervall entspricht einer Entfernung von 300 μm vom Sehnerv, das zweite Messintervall entspricht einer Entfernung von 600 μm usw.
15. Quantifizieren Sie die Inzidenzraten der RPE-Pathologie auf der Grundlage der Netzhautbilder für jede Probe.
    1. Öffnen Sie das Programm Fiji ImageJ.
    2. Öffnen Sie die Anwendung Cell Counter im Programm Fiji ImageJ. Klicken Sie auf Plugins > Analyze > Cell Counter in der Menüleiste von Fiji ImageJ. Ziehen Sie ein Netzhautbild in die Fiji ImageJ-Taskleiste und klicken Sie im Fenster Cell Counter auf Initialisieren.
    3. Zählen Sie die Anzahl der RPE-Pathologien pro Netzhautabschnitt mit der Anwendung Cell Counter. Klicken Sie unter Zähler auf Typ 1 und dann auf alle Mikrovakuolisierungsereignisse im Bild. Klicken Sie unter Zähler auf Typ 2 und dann auf alle Makrovakuolisierungsereignisse im Bild. Klicken Sie unter Zähler auf Typ 3 und dann auf alle einzelnen Migrationsereignisse im Bild.
    4. Übertragen Sie die Nummern der RPE-Pathologien in eine Tabelle. Beschriften Sie die Zeilen entweder mit Mikrovakuolisierung, Makrovakuolisierung oder Migration und die Spalte mit Mausidentifikation.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.15.2 bis 1.15.4 für weitere Bilder des Beispiels. Ermitteln Sie den Durchschnitt der Anzahl der RPE-Pathologien pro Probe und teilen Sie ihn durch fünf, um die Inzidenzrate jeder RPE-Pathologie für die Probe in der Tabelle zu berechnen.
16. Führen Sie statistische Analysen der RPE-Dicken in jedem Intervall und der Inzidenzraten der RPE-Pathologie durch, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der Studie gibt.

2. Auswertung von Maus-RPE mittels Transmissionselektronenmikroskopie

1. Schneiden Sie die anderen hinteren Segmente, die nach den Schritten 1,5-1,9 ergeben sind, mit einer Rasierklinge durch die obere Markierung in zwei Abschnitte. Markieren Sie die obere Seite der geschnittenen hinteren Segmente mit Gewebemarkierungsfarbstoff. Trennen Sie die geschnittenen hinteren Segmente in neue 2-ml-Mikroröhrchen, die 2 ml 1x PBS und Mausidentifikation enthalten.
   HINWEIS: Das hintere Maussegment ist zu groß, um es in einem Stück zu bearbeiten, und muss für die transmissionselektronenmikroskopische Verarbeitung in zwei Hälften geschnitten werden.
2. Spülen Sie das Gewebe mit 2 ml 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,2. 10 Minuten bei RT auf dem Labortisch inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.
3. Ersetzen Sie den 0,1 M Cacodylatpuffer durch 2 ml 2%iges Osmiumtetroxid (OsO₄), verdünnt in 0,1 M Cacodylatpuffer. 1,5 h bei RT im Abzug inkubieren.
   ACHTUNG: OsO₄ ist eine giftige Substanz. Bitte befolgen Sie die Standardarbeitsanweisungen, wenn Sie mit OsO₄ arbeiten.
4. Spülen Sie die Taschentücher mit 2 ml 0,1 M Cacodylatpuffer für 10 min bei RT im Abzug. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
5. Entwässern Sie das Gewebe mit abgestuften EtOH-Verdünnungen von 50 % bis 100 % bei RT im Abzug. Ein Protokoll für das Dehydratationsverfahren finden Sie in der ergänzenden Abbildung 7.
6. Entfernen Sie 100% EtOH aus dem Gewebe und geben Sie 2 ml Propylenoxid in das Gewebe. Bei RT im Abzug 15 min inkubieren. Entfernen Sie das Propylenoxid aus den Taschentüchern und geben Sie 2 ml frisches Propylenoxid in die Taschentücher. Bei RT im Abzug 15 min inkubieren.
   ACHTUNG: Propylenoxid ist eine giftige Substanz. Bitte befolgen Sie die Standardarbeitsanweisungen, wenn Sie mit Propylenoxid arbeiten.
7. Entfernen Sie Propylenoxid aus den Taschentüchern und geben Sie 2 ml einer 1:1-Mischung aus Propylenoxid und Harz in die Taschentücher. Über Nacht unter Vakuum im Abzug bei RT stehen lassen.
   VORSICHT: Harz ist eine gefährliche Substanz für den Menschen. Bitte befolgen Sie bei der Arbeit mit Kunstharz die Standardarbeitsanweisungen des Labors.
8. Ersetzen Sie die 1:1-Mischung aus Propylenoxid und Harz aus Taschentüchern durch 2 ml reines Harz. Über Nacht unter Vakuum im Abzug bei RT belassen.
9. Betten Sie das Gewebe in Harz ein. Legen Sie ein Etikett mit Mauskennzeichnung in Bleistift und einen Tropfen Harz in die Form. Positionieren Sie das Gewebe auf dem Harztropfen. Füllen Sie die Form mit Harz und stellen Sie sie für 1 h bei RT im Abzug unter Vakuum.
10. Positionieren Sie die Etiketten und Proben mit einer Pinzette mit feiner Spitze, wobei die hintere Seite des hinteren Augenmuschelabschnitts oben liegt. Lassen Sie die Form über Nacht bei 65 °C in einem Ofen im Abzug stehen.
11. Nehmen Sie die Formen aus dem Ofen. Lassen Sie die Formen auf dem Tischtisch auf RT abkühlen. Nehmen Sie die Blöcke aus den Formen.
    HINWEIS: Die Blöcke sind jetzt bereit zum Trimmen.
12. Formen Sie die Harzblöcke mit einer Rasierklinge zu einem Trapez. Schneiden Sie die Harzblöcke mit einem Mikrotom ab, bis der Sehnervenkopf sichtbar ist. Fahren Sie mit einem Diamantmesser fort, um halbdünne Abschnitte mit einer Dicke von 0,5 μm aus den Harzblöcken zu schneiden.
    HINWEIS: Hier ist ein veröffentlichtes Protokoll zur Mikrotomschnittierung²⁷. Falls gewünscht, können 0,5 μm dicke halbdünne Schnitte aus den Harzblöcken entnommen und gefärbt werden, um die Integrität der Probe zu bewerten.
13. Schneiden Sie mit einem Ultramikrotom einen 70 nm dicken, ultradünnen Schnitt aus jedem beschnittenen Block aus. Sammeln Sie einen 70 nm dicken, ultradünnen Schnitt auf einem 400-maschigen Dünnstab-Kupfergitter. Legen Sie das Gitter in eine Gitteraufbewahrungsbox und beschriften Sie den Steckplatz mit der Mauskennung.
    HINWEIS: Hier ist ein veröffentlichtes Protokoll zur Ultramikrotom-Schnittung²⁸.
14. Färben Sie die Gitter 5 min lang mit 2%igem Uranylacetat und dann 5 min mit 3,5%iger Bleicitratlösung bei RT im Abzug.
    ACHTUNG: Uranylacetat und Bleicitrat sind gefährliche Stoffe. Bitte befolgen Sie bei der Arbeit mit diesen Stoffen die Standardarbeitsanweisungen.
15. Mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei einer 15.000-fachen Vergrößerung erhalten Sie Bilder für jede Probe, bei der sich die Gitterlinien des Kupfergitters mit RPE und BrM schneiden.
    HINWEIS: Es sollten mindestens 20 bis 35 Bilder pro Abschnitt und 40 bis 70 Bilder pro Probe vorhanden sein.
16. Quantifizieren Sie die BLamD-Höhen in den Bildern für die Proben in der Studie.
    1. Öffnen Sie das Programm Fiji ImageJ. Ziehen Sie alle Bilder aus dem Beispielabschnitt in die Fiji ImageJ-Taskleiste. Stellen Sie sicher, dass die Bilder in μm und nicht in Pixeln kalibriert sind.
    2. Messen Sie die BLamD-Höhe in den Bildern. Klicken Sie auf das gerade Symbol in der Fiji ImageJ-Taskleiste. Klicken Sie auf eine Linie, und ziehen Sie sie von der elastischen Schicht von BrM bis zur Oberseite der höchsten Ablagerung im Bild (ergänzende Abbildung 8). Klicken Sie in der Menüleiste von Fiji ImageJ auf Analysieren > Messen , um die BLamD-Höhe im Bild abzurufen.
       HINWEIS: Wenn im Bild keine BLamDs vorhanden sind, ziehen Sie eine Linie von der elastischen Lamina des BrM zur Basallamina des RPE.
    3. Übertragen Sie die BLamD-Höhen in eine Tabelle und beschriften Sie sie mit der Maus.
17. Berechnen Sie die kumulativen Häufigkeiten der BLamD-Höhen pro Genotyp und die Durchschnittswerte der BLamD-Höhen pro Maus in der Tabelle. Führen Sie eine statistische Analyse der Durchschnittswerte der BLamD-Höhen durch, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der Studie gibt.

3. Evaluierung des RPE der Maus mittels konfokaler Mikroskopie

1. Sammle Augen von den Mäusen. Euthanasieren Sie die Mäuse gemäß dem in Schritt 1.3 beschriebenen Verfahren. Entkernen Sie die Augen mit Schritt 1.5. Legen Sie die Augen mit einer gebogenen Pinzette in ein 2-ml-Mikroröhrchen mit 2 ml 1x PBS und Mausidentifikation.
   HINWEIS: Passen Sie die Mäuse nicht dunkel an, da die Interdigitalisierung der Photorezeptoren und der apikalen RPE-Fortsätze eine bessere Visualisierung des RPE durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.
2. Reinigen und präparieren Sie die Mausaugen sofort, um die hinteren Augenmuscheln der Maus zu erzeugen.
   HINWEIS: Die hintere Augenmuschel unterscheidet sich vom hinteren Augenabschnitt, da sie die neuronale Netzhaut nicht enthält.
   1. Das Auge wird unter einem Präpariermikroskop in eine Petrischale mit 1x PBS überführt (ergänzende Abbildung 9A).
   2. Entfernen Sie Fett und Muskeln aus dem Augapfel, wie in Schritt 1.8.2 beschrieben (ergänzende Abbildung 9B).
   3. Schneiden Sie die Hornhaut des Augapfels mit einer Skalpellklinge mit der Nummer 11 ein. Entfernen Sie die Hornhaut und die Iris, wie in Schritt 1.8.3 beschrieben (ergänzende Abbildung 9C).
   4. Ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette mit feiner Spitze heraus. Nehmen Sie zwei Pinzetten mit feiner Spitze und trennen Sie vorsichtig die Neuralnetzhaut vom hinteren Segment.
   5. Schneiden Sie vorsichtig die Neuralnetzhaut am Sehnervenkopf durch, um sie aus der hinteren Augenmuschel zu entfernen (ergänzende Abbildung 9D).
   6. Setzen Sie die hintere Augenmuschel in ein neues 2-ml-Mikroröhrchen ein, das 500 μl 1x PBS mit Mausidentifikation enthält.
3. Fixieren Sie die hinteren Augenmuscheln mit Methanol (MeOH) (ergänzende Abbildung 10).
   HINWEIS: Schritt 3.3 dauert ca. 2 h und 40 min.
   1. Geben Sie 500 μl MeOH in das Gewebe. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren.
   2. Entfernen Sie die 500 μl der Lösung aus dem Gewebe und fügen Sie 500 μl MeOH hinzu. 5 min auf einem Shaker bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
   3. Entfernen Sie die gesamte Lösung aus dem Gewebe und fügen Sie 500 μl MeOH hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für mindestens 2 h bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Alternativ zu Schritt 3.3.3 kann die hintere Augenmuschel über Nacht in MeOH auf einem Shaker bei 75 U/min in einem 4 °C-Raum inkubiert werden.
   4. Geben Sie 500 μl 1x PBS in das Gewebe. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren.
   5. Entfernen Sie die 500 μl der Lösung aus dem Gewebe und fügen Sie 500 μl 1x PBS hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 5 min bei RT inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
   6. Entfernen Sie die gesamte Lösung aus dem Gewebe und ersetzen Sie sie durch 500 μl 1x PBS.
      HINWEIS: Die Taschentücher werden durch das MeOH vollständig fixiert und können mindestens 1 Monat im 4 °C Kühlschrank aufbewahrt werden.
4. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung der hinteren Augenmuscheln durch, um Tight Junctions und Kerne des RPE sichtbar zu machen (ergänzende Abbildung 11).
   1. Entfernen Sie die 500 μl 1x PBS aus den Proben und fügen Sie 100 μl verdünntes 10%iges normales Eselsserum in 1x PBS-Lösung hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 30 min bei RT inkubieren.
   2. Entfernen Sie die verdünnte 10%ige normale Eselsserumlösung aus den Proben und fügen Sie 100 μl einer 1:50-Verdünnung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen Zonula Occludens-1 (ZO-1) in 1x PBS hinzu. Die Proben werden in einen 4 °C-Raum überführt und über Nacht auf einem Schüttler bei 75 U/min inkubiert.
   3. Entfernen Sie die Antikörperverdünnung aus den Proben und fügen Sie 2 ml 1x PBS hinzu. Auf einem Schüttler bei 75 U/min für 10 min bei RT inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal.
   4. Entfernen Sie das 1x PBS aus den Proben. Den Proben werden 100 μl einer 1:250-Verdünnung eines Esel-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers mit einem 488-Fluorophor-konjugierten Tag und einer 1:250-Verdünnung von 4',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) in 1x PBS zugegeben. Decken Sie die Proben mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie auf einem Schüttler bei 75 U/min für 2 h bei RT.
      Anmerkungen: Die Proben müssen vollständig mit Aluminiumfolie bedeckt sein, um ein Ausbleichen zu verhindern.
   5. Entfernen Sie die Antikörper- und DAPI-Verdünnungen aus den Proben. Geben Sie 2 ml 1x PBS zu den Proben, bedecken Sie sie wieder mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie auf einem Schüttler bei 75 U/min für 10 Minuten bei RT. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal.
      HINWEIS: Die Tight Junctions und Kerne des RPE sind nun vollständig markiert bzw. gefärbt.
5. Montieren Sie die hinteren Augenmuscheln auf Objektträgern.
   1. Beschriften Sie einen Objektträger mit einer Mauskennung. Übertragen Sie die hintere Augenmuschel mit der Aderhautseite nach unten auf einen Objektträger unter einem Präpariermikroskop. Geben Sie einen Tropfen 1x PBS in die hintere Augenmuschel, um ein Austrocknen zu verhindern (ergänzende Abbildung 12).
   2. Schneiden Sie die hintere Augenmuschel mit einer Skalpellklinge mit der Nummer 11 an vier Stellen ab, die vier Quadranten ergeben, die den Himmelsrichtungen entsprechen (d. h. Norden, Osten, Süden und Westen). Tupfen Sie überschüssiges PBS mit Gewebe vom Umfang der hinteren Augenmuschel ab. Glätten Sie die hintere Augenmuschel vorsichtig mit einer Kamelhaarbürste und einer Pinzette mit feiner Spitze (ergänzende Abbildung 12).
      HINWEIS: Das resultierende Produkt wird jetzt als RPE-Flachhalterung bezeichnet.
   3. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in die RPE-Flachhalterung und legen Sie ein Deckglas darauf. Tragen Sie klaren Fingernagellack auf, um das Deckglas zu versiegeln, und lassen Sie es mindestens 30 Minuten bei RT in einer geschlossenen Schublade trocknen. Legen Sie die Objektträger in eine Objektträgerbox und bewahren Sie die Box im 4 °C warmen Kühlschrank auf.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass keine Blasen auf die flache RPE-Halterung gelangen. RPE-Flachmontierungen können innerhalb eines Zeitrahmens von 2 Wochen abgebildet werden.
6. Erhalten Sie ein Bild von jedem der vier Quadranten, die den Sehnerv des RPE-Flachbajonetts umgeben, auf einem konfokalen Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung für jede Probe. Ein Beispiel für ein RPE-Flatmount-Bild finden Sie in der ergänzenden Abbildung 13A.
   HINWEIS: Es kann erforderlich sein, eine Z-Stapel-Bildgebung der flachen RPE-Halterungen durchzuführen, bei der mehrere Bilder aufgenommen und gestapelt werden, um Maßunterschiede der flachen RPE-Halterung auszugleichen.
7. Zeichnen Sie die Tight Junctions der RPE-Zellen in jedem RPE-Flatmount-Bild nach. Ein Beispiel für ein nachgezeichnetes RPE-Flatmount-Bild finden Sie in der ergänzenden Abbildung 13B.
   1. Öffnen Sie das Programm Fiji ImageJ. Ziehen Sie ein RPE-Flatmount-Image in die Fiji ImageJ-Taskleiste. Stellen Sie sicher, dass das Bild in Mikrometern und nicht in Pixeln kalibriert ist.
   2. Doppelklicken Sie auf das Symbol des Overlay-Pinselwerkzeugs in der Fiji ImageJ-Taskleiste, um die Pinselbreite auf 3, die Transparenz auf 0 und die Farbe auf Rot festzulegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schließen" im Fenster "Überlagerungspinsel-Werkzeug".
   3. Klicken Sie auf das Symbol für das Überlagerungspinsel-Werkzeug . Klicken und ziehen Sie auf die Tight Junctions aller RPE-Zellen, die sich vollständig im Bild befinden.
      HINWEIS: Falls ein Nachzeichnungsfehler gemacht wird, doppelklicken Sie auf das Symbol des Überlagerungspinselwerkzeugs und klicken Sie im Fenster des Überlagerungspinselwerkzeugs auf das Feld Rückgängig, um den Nachzeichnungsfehler aus dem Bild zu entfernen.
   4. Klicken Sie auf das Rechtecksymbol in der Taskleiste von Fiji ImageJ. Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie es um den Rand des Bildes. Klicken Sie in der Menüleiste von Fiji ImageJ auf Bearbeiten > Löschen , um die nachgezeichneten Linien beizubehalten und alle blauen und grünen Farben aus dem Bild zu entfernen.
   5. Speichern Sie das Trace-Bild an einem geeigneten Ort mit Mausidentifikation, Quadrantenposition (d. h. Norden, Süden, Osten oder Westen) und einer CP-Suffixbezeichnung.
      HINWEIS: Speichern Sie das RPE-Ablaufverfolgungsbild nicht, bevor Sie Schritt 3.7.4 abgeschlossen haben.
8. Berechnen Sie die RPE-Zellflächen für jede Stichprobe.
   1. Legen Sie einen Speicherort für die Dateien aus der RPE-Bereichsanalyse fest, indem Sie einen Ordner auf dem Desktopbildschirm des Computers erstellen. Generieren Sie Unterordner für jedes RPE-Trace-Image und beschriften Sie die Unterordner mit der Mausidentifikation sowie der Quadrantenposition (d. h. Norden, Süden, Osten oder Westen).
   2. Installieren und öffnen Sie das Cell Profiler-Programm²⁹. Laden Sie die Projektdatei Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1) herunter. Öffnen Sie die Datei Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj, indem Sie in der Menüleiste des Cell Profiler-Programms auf Datei > Projekt öffnen klicken.
   3. Ziehen Sie ein RPE-Trace-Bild in das Feld Image > Drop Files and Folders Here im Programmfenster Cell Profiler.
   4. Geben Sie den Speicherort des Ordners in das Cell Profiler-Programm ein, der dem RPE-Trace-Image entspricht. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgabeeinstellungen in der unteren linken Ecke des Cell Profiler-Programmfensters und geben Sie den Speicherort des Ordners in die Textfelder Standardeingabeordner und Standardausgabeordner ein.
   5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bilder analysieren in der unteren linken Ecke des Cell Profiler-Programmfensters. Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, wird auf dem Bildschirm das Fenster Analyse abgeschlossen angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK im Fenster Analyse abgeschlossen .
      HINWEIS: Diese Aktion generiert eine CSV-Datei und ein JPEG-Bild. Die CSV-Datei enthält die Bereiche für die RPE-Zellen innerhalb des Trace-Bildes. Das JPEG-Bild entspricht dem RPE-Trace-Bild, bei dem jede RPE-Zelle mit einer Zahl beschriftet ist (ergänzende Abbildung 13C).
   6. Übertragen Sie die RPE-Bereiche aus der CSV-Datei in eine Tabelle. Beschriften Sie die Tabelle mit der Mauskennung.
   7. Führen Sie eine Qualitätskontrolle der Daten durch, indem Sie bestätigen, dass jeder RPE-Bereich in der CSV-Datei mit einer vollständig nachgezeichneten RPE-Zelle in einem JPEG-Bild verknüpft ist. Entfernen Sie alle Werte aus der Tabelle, die nicht den vollständig verfolgten RPE-Zellen entsprechen.
   8. Kehren Sie zum Cell Profiler-Programm zurück. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Namen des RPE-Ablaufverfolgungsbilds im Feld Dateien und Ordner hier ablegen, und wählen Sie Liste löschen aus, um das Bild aus dem Cell Profiler-Programm zu entfernen.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 3.8.3 bis 3.8.8, um die RPE-Größen für die verbleibenden drei RPE-Trace-Bilder der Probe zu berechnen.
9. Quantifizieren Sie die RPE-Zellengrößendurchschnitte für jede Stichprobe in der Tabelle.
10. Quantifizieren Sie die RPE-Zelldichten für jede Probe in der Tabelle. Um die RPE-Zelldichte zu berechnen, dividieren Sie die Gesamtzahl der RPE-Zellen pro Quadrant durch die Gesamtfläche der RPE-Zellen pro Quadrant, die vom Cell Profiler-Programm erkannt wurde. Bestimmen Sie den Durchschnitt der RPE-Zelldichten aus den vier Quadranten pro Probe.
11. Quantifizieren Sie die Anzahl der mehrkernigen RPE-Zellen pro RPE-Flachhalterung für jede Probe. Verwenden Sie die Anwendung Cell Counter im Programm Fiji ImageJ, wie in den Schritten 1.15.1 bis 1.15.3 beschrieben, um die Anzahl der RPE-Zellen mit mehr als drei Kernen in vier Quadranten der Probe zu zählen.
12. Führen Sie statistische Analysen der durchschnittlichen RPE-Zellgröße und -dichte sowie der Anzahl der mehrkernigen RPE-Zellen durch, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen in der Studie gibt.

Ergebnisse

Die Vervollständigung des in diesem Artikel beschriebenen RPE-Phänotypisierungsprotokolls bietet eine quantitative Analyse der strukturellen RPE-Anomalien, die häufig in Mausmodellen der AMD beobachtet werden. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu bestätigen, verwendeten wir es bei Mäusen, von denen bekannt ist, dass sie RPE-Pathologien aufweisen, einschließlich transgener Mäuse, die WT Tmem135 überexprimieren, angetrieben durch den Huhn-Beta-Aktin-Promotor (Tmem135 TG)30, und gealterte C57BL/6J-Mäuse...

Diskussion

In diesem Artikel haben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung der strukturellen RPE-Pathologien von Mausmodellen vorgestellt. Wir beschrieben die Schritte, die für die Verarbeitung der Augen für verschiedene bildgebende Verfahren wie Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie erforderlich sind, sowie die Quantifizierung typischer Pathologien, die mit diesen bildgebenden Verfahren beobachtet werden. Wir haben die Wirksamkeit unseres RPE-Phänotypisierungsprotokolls durch die Unters...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02