연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

요약

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

초록

연령 관련 황반변성(AMD)은 고령화 인구에서 쇠약하게 만드는 망막 장애입니다. 망막 색소 상피(RPE)의 기능 장애는 AMD의 주요 병리학적 사건으로 널리 알려져 있습니다. RPE 기능 장애로 이어지는 메커니즘을 이해하기 위해 연구자들은 마우스 모델을 활용할 수 있습니다. 이전 연구에 의해 마우스가 RPE 병리를 일으킬 수 있다는 것이 확인되었으며, 그 중 일부는 AMD 진단을 받은 개인의 눈에서 관찰됩니다. 여기에서는 마우스의 RPE 병리를 평가하기 위한 표현형 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 광학 현미경 및 투과 전자 현미경을 사용한 망막 단면의 준비 및 평가와 컨포칼 현미경에 의한 RPE 플랫 마운트의 준비 및 평가가 포함됩니다. 우리는 이러한 기술에 의해 관찰되는 쥐 RPE 병리의 일반적인 유형과 통계적 테스트를 위한 편견 없는 방법을 통해 이를 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 개념 증명으로 이 RPE 표현형 프로토콜을 사용하여 막횡단 단백질 135(Tmem135)를 과발현하는 마우스와 노화된 야생형 C57BL/6J 마우스에서 관찰된 RPE 병리를 정량화합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 AMD의 마우스 모델을 사용하는 과학자들을 위한 편견 없는 정량적 평가와 함께 표준 RPE 표현형 방법을 제시하는 것입니다.

서문

연령 관련 황반변성(AMD)은 55세 이상의 인구에게 영향을 미치는 흔한 실명 질환입니다¹. 많은 연구자들은 망막 색소 상피(RPE) 내의 기능 장애가 AMD²의 초기이자 중요한 병리생물학적 사건이라고 믿습니다. RPE는 인접한 광수용체와 맥락막 혈관의 항상성을 유지하는 역할을 하는 분극 세포의 단층이다³. 세포 배양 모델 ^4,5 및 마우스 ^6,7,8을 포함하여 RPE 내에서 질병 관련 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 모델이 존재합니다. 최근 보고서에서는 RPE 세포 배양 모델⁴에 대한 표준화된 프로토콜과 품질 관리 기준을 설명했지만, 마우스 모델에서 RPE의 표현형을 표준화하려는 시도는 없었다. 사실, AMD의 마우스 모델에 대한 많은 출판물에는 RPE에 대한 완전한 설명이나 RPE 병리의 정량화가 부족합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 AMD 마우스 모델을 사용하는 과학자들을 위해 편견 없는 정량적 평가와 함께 표준 RPE 표현형 분석 방법을 제시하는 것입니다.

이전 간행물에서는 세 가지 이미징 기술을 통해 마우스에서 여러 RPE 병리의 존재에 주목했습니다. 예를 들어, 연구자들은 광학 현미경을 통해 쥐 망막의 전체적인 형태를 볼 수 있으며(그림 1A) RPE 얇아짐, 공포화 및 이동과 같은 RPE 병리를 감지할 수 있습니다. AMD 마우스 모델의 RPE 얇아짐은 해당 컨트롤에서 RPE 높이의 편차로 예시됩니다(그림 1B). RPE vacuolization은 미세 vacuolization (그림 1C)과 macrovacuolization (그림 1D)의 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. RPE 미세 공화는 전체 높이에 영향을 미치지 않는 RPE의 액포의 존재로 요약되는 반면, 거대 공화는 광 수용체의 바깥 부분으로 돌출 된 액포의 존재로 표시됩니다. RPE 이동은 망막 단면에서 RPE 단층 위의 색소의 초점 응집체로 구별됩니다(그림 1E). AMD 공여자의 눈에서 이동하는 RPE 세포는 분화 클러스터 68 (CD68)9과 같은 면역 세포 마커에 대한 면역반응성을 나타내며, RPE 파편을 삼키는 면역 세포 또는 형질전환⁹을 겪고 있는 RPE를 나타낼 수 있다는 점에 유의해야 한다. 투과 전자 현미경이라고 하는 또 다른 이미징 기술을 통해 연구자들은 RPE와 기저막의 미세 구조를 시각화할 수 있습니다(그림 2A). 이 기술은 기저 층류 퇴적물(BLamD)로 알려진 마우스의 우세한 하위 RPE 침전물을 식별할 수 있습니다(그림 2B)¹⁰. 마지막으로, 컨포칼 현미경은 이미징 RPE 플랫 마운트를 통해 RPE 세포의 구조를 밝힐 수 있습니다(그림 3A). 이 방법은 RPE가 고전적인 벌집 모양에서 벗어난 RPE 이형성을 밝힐 수 있습니다(그림 3B). 또한 RPE 세포 내에 3개 이상의 핵이 존재하는 RPE 다핵형성을 감지할 수 있습니다(그림 3C). 현재 AMD 마우스 모델에 존재하는 RPE 병리의 유형에 대한 요약을 위해, 본 발명자들은 문헌 ^6,7의 이러한 문헌을 참조한다.

AMD를 연구하는 연구원은 표현형 프로토콜 이전에 RPE 병리를 조사하기 위해 마우스를 사용하는 것의 장점과 단점을 알고 있어야 합니다. 마우스는 상대적으로 짧은 수명과 비용 효율성, 유전적 및 약리학적 조작 가능성 때문에 유리합니다. 마우스는 또한 AMD 기증자 눈 11,12,13,14,15,16,17에서 관찰되는 RPE 이동^, 이형성 및 다핵 형성을 포함한 RPE 퇴행성 변화를 나타냅니다. 이것은 유사한 메커니즘이 생쥐와 인간에서 이러한 RPE 병리의 발달의 기초가 될 수 있음을 시사합니다. 그러나 마우스 연구의 번역 가능성을 인간 AMD로 제한하는 주요 차이점이 있습니다. 첫째, 마우스는 AMD에서 우선적으로 영향을 받는 시력에 필요한 인간 망막의 해부학적으로 구별되는 영역인 황반을 가지고 있지 않습니다. 둘째, 생쥐의 RPE 희석 및 공포화와 같은 일부 RPE 병리는 일반적으로 AMD 기증자의 눈에서 나타나지 않는다¹⁸. 셋째, 생쥐는 AMD 병리의 특징인 드루젠(drusen)을 발달시키지 않는다¹⁹. 드루젠은 RPE 기저층과 Bruch 막(BrM)의 내부 콜라겐 층 사이에 형성되는 기저막 단백질이 거의 없는 지질 및 단백질 함유 침전물입니다¹⁹. Drusen은 생쥐의 일반적인 하위 RPE 침전물인 BLamD와 구성과 해부학적 위치 모두에서 다릅니다. BLamD는 BrM의 RPE 기저층과 RPE²⁰의 기저 접힘 사이에 형성되는 연령 및 스트레스 의존적 세포외 기질 풍부 이상입니다. 흥미롭게도, BLamD는 생쥐와 인간 모두에서 유사한 단백질 조성과 외관을 가지고 있다 ^6,10,21. 최근 연구에 따르면 BLamD는 AMD의 후기 단계로의 진행에 영향을 미침으로써 AMD의 병리학에서 작용할 수 있습니다^18,22; 따라서 이러한 침전물은 마우스 망막에서 병든 RPE를 나타낼 수 있습니다. 이러한 이점과 한계에 대한 지식은 마우스 연구의 결과를 AMD로 번역하는 데 관심이 있는 연구자에게 매우 중요합니다.

이 프로토콜에서는 RPE 병리를 시각화하기 위해 빛, 투과 전자 및 컨포칼 현미경에 대해 눈을 준비하는 방법에 대해 논의합니다. 또한 통계적 테스트를 위해 편향되지 않은 방식으로 RPE 병리를 정량화하는 방법을 설명합니다. 개념 증명으로 우리는 RPE 표현형 프로토콜을 사용하여 막횡단 단백질 135-(Tmem135) 과발현 마우스와 노화된 야생형(WT) C57BL/6J 마우스에서 관찰된 구조적 RPE 병리를 조사합니다. 요약하면, 현재 사용 가능한 표준 프로토콜이 없기 때문에 AMD 마우스 모델에서 RPE를 특성화하기 위한 표현형 방법론을 설명하는 것을 목표로 합니다. AMD 마우스 모델에서도 영향을 받는 광수용체 또는 맥락막의 병리를 검사하고 정량화하는 데 관심이 있는 연구원은 이 프로토콜이 연구에 유용하지 않을 수 있습니다.

프로토콜

동물 피험자와 관련된 모든 절차는 위스콘신-매디슨 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서를 준수합니다.

1. 광학 현미경에 의한 마우스 RPE 평가

1. 유리병에 실온(RT)에서 최종 농도가 2%인 파라포름알데히드와 2%의 글루타르알데히드를 갖는 고정액 완충액을 만듭니다.
   참고: 이 프로토콜에는 마우스당 최대 14mL의 고정 완충액이 필요합니다.
   주의 : 파라포름알데히드와 글루타르알데히드는 유해 물질입니다. 이러한 물질로 작업할 때는 표준 작동 절차를 따르십시오.
2. 흄 후드의 심장 관류를 위한 흡수성 언더패드에 중력 공급 관류 시스템을 준비합니다(보충 그림 1A).
   1. 고정 완충액 40mL를 관류 시스템의 주사기 배럴에 넣습니다(보충 그림 1B).
   2. 버퍼가 튜빙 라인을 통해 흐를 수 있도록 튜빙 라인과 평행이 될 때까지 밸브를 돌립니다(보충 그림 1C). 라인에서 모든 기포가 제거될 때까지 버퍼로 라인을 세척합니다.
   3. 버퍼가 튜빙 라인으로 흐르는 것을 막기 위해 튜빙 라인에 수직이 될 때까지 밸브를 돌립니다(보충 그림 1D).
      알림: 이제 관류 시스템을 사용할 준비가 되었습니다.
3. 마우스를 이산화탄소(CO2) 챔버에 넣어 안락사시키고_CO2가 분당 챔버 부피의 30%의 유속으로 챔버 내로 흐르도록 한다. 마우스가 호흡을 멈추면_CO2가 최소 1분 동안 챔버 내로 흐르도록 합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 마우스가 작동하지 않는지 확인합니다.
   참고: 약리학적 제제 주입을 통한 안락사는 이 프로토콜에서 CO₂ 흡입의 대안으로 사용될 수 있습니다.
4. 안락사 된 마우스에서 심장 관류를 수행하십시오.
   1. 복부가 위를 향하도록 관류 시스템 근처의 얕은 트레이에 마우스를 옮깁니다. 복부에 70 % 에탄올 (EtOH)을 뿌립니다.
   2. 복강을 노출시키기 위해 4개의 절개를 합니다(보충 그림 2A).
      1. 흉곽 바로 아래에 있는 마우스의 가장 왼쪽에 있는 피부와 복벽을 통해 구부러진 가위와 집게를 사용하여 5cm 하부 절단을 만듭니다.
      2. 하부 절개 상단에서 시작하는 마우스의 피부와 복벽을 통해 3cm 내측 절개를 진행합니다.
      3. 흉곽 바로 아래 마우스의 가장 오른쪽에 있는 피부와 복벽을 통해 내측 절단 끝을 5cm 더 하부로 자릅니다.
      4. 구부러진 집게로 복부 피부 플랩을 제거하기 위해 3cm 내측 절개를 더 합니다.
   3. 횡격막과 흉골을 절단하여 심장을 노출시킵니다(보충 그림 2B).
      알림: 심장, 동맥 및 정맥에 흠집이 나지 않도록 주의하십시오. 이것들을 흠집내는 것은 비효율적 인 심장 관류로 이어질 것입니다.
   4. 게이지 바늘을 심장의 좌심실에 삽입합니다. 밸브 라인과 평행이 될 때까지 밸브를 돌립니다. 혈액과 고정제가 심장에서 빠져나갈 수 있도록 구부러진 가위로 우심방을 자릅니다(보충 그림 2C).
   5. 10mL의 고정 완충액이 최소 1-2분 동안 또는 간이 옅어지고 우심방에서 혈액이 흘러나오지 않을 때까지 마우스에 침투하도록 합니다. 관류가 완료되면 밸브 밸브가 튜브 라인에 수직이 될 때까지 돌려 버퍼의 흐름을 멈춥니다.
5. 심장 관류 후 마우스에서 눈을 적출합니다.
   1. 얕은 트레이에서 마우스를 꺼내고 흄 후드의 흡수성 언더패드에 마우스를 놓습니다. 왼쪽 눈이 실험자를 향하고 오른쪽 눈이 보이지 않도록 마우스 머리의 방향을 지정합니다. 눈의 위쪽에 티슈 마킹 염료로 주석을 답니다.
   2. 엄지와 검지로 눈 소켓 주위를 부드럽게 눌러 눈 소켓에서 눈이 돌출되도록 합니다(보충 그림 3A).
   3. 구부러진 가위를 가지고 눈 소켓에서 30° 각도로 칼날로 잡습니다. 구부러진 가위로 눈 주위를 30° 각도로 자릅니다(보충 그림 3B).
      알림: 안구의 무결성을 유지하기 위해 안와에서 과도한 조직을 잘라내는 것은 괜찮습니다.
   4. 구부러진 집게로 머리에서 안구를 제거하고 흡수성 언더 패드에 놓습니다. 11번 메스 칼날로 각막에 닉을 긋고 구부러진 집게가 있는 눈을 2mL의 고정 완충액이 있는 2mL 마이크로튜브에 넣습니다. 2mL 마이크로튜브에 마우스 ID와 '왼쪽'이라는 라벨을 붙여 왼쪽 눈을 나타냅니다.
      참고: 각막의 흠집은 고정제가 눈에 쉽게 침투하여 더 잘 보존할 수 있도록 합니다.
   5. 오른쪽 눈에 대해 1.5.1-1.5.4단계를 반복합니다.
6. 눈이 4°C(C) 방의 셰이커에서 분당 75회전(rpm)의 속도로 고정액 완충액에서 밤새 배양되도록 합니다.
7. 고정 완충액을 2mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 교체합니다. RT 및 75 rpm의 진탕기 상에서 10분 동안 1x PBS에서 눈을 인큐베이션한다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
8. 눈을 깨끗이 씻고 해부하여 뒤쪽 세그먼트를 생성합니다.
   참고: 후방 분절은 각막, 홍채 및 수정체를 제외한 신경 망막, RPE, 맥락막 및 공막이 있는 마우스 안구입니다.
   1. 해부 현미경으로 1x PBS로 채워진 페트리 접시에 눈을 놓습니다(보충 그림 4A).
   2. 끝이 가는 집게로 안구에서 지방과 근육을 부드럽게 들어 올립니다. 안구가 균일한 청록색이 될 때까지 안구와 평행한 방향으로 미세 해부 가위로 지방과 근육을 조심스럽게 다듬습니다(보충 그림 4B).
      알림: 안구를 손상시키므로 수직 방향으로 절단하지 마십시오. 또한 가공 중 조직 마킹 염료가 벗겨지면 즉시 안구의 위쪽에 주석을 답니다.
   3. 각막 천자 부위에 끝이 가는 집게를 놓습니다. 안구에서 각막과 홍채를 제거하기 위해 미세 해부 가위로 천자 부위에서 시작하여 각막 주변을 자릅니다(보충 그림 4C).
   4. 끝이 가는 집게를 잡고 안구에서 렌즈를 부드럽게 제거하여 뒤쪽 부분을 만듭니다(보충 그림 4D).
   5. 후방 세그먼트를 2mL의 1x PBS가 있는 2mL 마이크로튜브에 다시 넣습니다. 뒤쪽 부분은 4°C 냉장고에 보관하십시오.
      참고: 후방 세그먼트는 추가 처리 전에 몇 주 동안 4°C에서 1x PBS에 남아 있을 수 있습니다.
9. 1.3-1.8 단계를 반복하여 연구에 참여한 다른 마우스의 눈을 준비합니다.
10. 절편을 위해 각 마우스의 후방 세그먼트 중 하나를 파라핀에 처리하고 포함합니다. 뒤쪽 세그먼트의 위쪽 면이 위쪽에 있는지 확인하십시오.
    참고: 저자는 이러한 작업을 수행하기 위해 UW(University of Wisconsin-Madison) TRIP(Translational Research Initiatives in Pathology) 실험실에 의존합니다. 여기에 유사한 파라핀 처리 및 포매 방법을 사용하는 공개된 프로토콜이 있다^23,24.
11. 각 파라핀 블록을 다듬고 절편하여 시신경두를 포함하는 5μm 두께의 망막 절편과 서로 250μm 떨어져 있는 4개의 추가 5μm 두께의 망막 절편을 얻습니다. 슬라이드에 마우스 ID와 일련 섹션 번호(예: 1, 2, 3, 4 또는 5)로 레이블을 지정합니다. 슬라이드를 슬라이드 상자에 저장합니다.
    참고: 저자는 파라핀 절편 서비스를 위해 UW TRIP 실험실에 의존합니다. 여기에 유사한 파라핀 절편 방법을 사용하는 공개된 프로토콜이 있다^25,26.
12. 망막 절편이 포함된 슬라이드를 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 얼룩지게 합니다. H&E 염색의 프로토콜은 보충 도 5에서 찾을 수 있다.
    참고: H&E 염색 절차의 모든 단계는 흄 후드에서 완료되어야 합니다.
13. 20x 배율의 광학 현미경을 사용하여 스케일 바가 있는 H&E 염색 망막 절편의 스티칭 이미지를 수집합니다.
14. 각 샘플에 대한 시신경두를 포함하는 망막 이미지에서 RPE 두께를 정량화합니다.
    1. Fiji ImageJ 프로그램을 다운로드하여 엽니다. 시신경두가 포함된 모든 스티칭된 망막 이미지를 Fiji ImageJ 작업 표시줄로 드래그합니다. 이미지 배율이 픽셀이 아닌 μm 단위로 보정되었는지 확인합니다.
       참고: 이미지 눈금은 Fiji ImageJ 프로그램에서 망막 이미지가 포함된 창의 왼쪽 상단 모서리에 있습니다. 눈금이 픽셀 단위로 설정된 경우 Fiji ImageJ 프로그램의 사용 설명서를 참조하여 픽셀을 μm로 변환하십시오.
    2. 시신경 머리 가장자리에서 망막 끝(ora serrata)까지 각 이미지에서 300μm 간격으로 표시합니다. Fiji ImageJ 작업 표시줄에서 직선 아이콘을 클릭합니다. 시신경두의 가장자리에서 길이 300μm의 ora serrata 쪽으로 선을 클릭하고 끕니다. Fiji ImageJ 작업 표시줄에서 그림판 도구를 클릭하고 300μm 선의 끝을 클릭하여 표시합니다.
    3. 표시된 각 간격에서 RPE 두께를 측정합니다. Fiji ImageJ 작업 표시줄에서 직선 아이콘을 클릭합니다. RPE의 상단에서 하단으로 라인을 클릭하고 드래그합니다(보충 그림 6). Fiji ImageJ 메뉴 표시줄에서 Analyze > Measure 를 클릭하여 RPE 두께를 구합니다.
    4. RPE 두께 측정값을 스프레드시트로 전송하고 측정값이 포함된 열에 마우스 식별로 레이블을 지정합니다. 추가 열에 'Marked Interval'이라는 레이블을 지정하고 시신경 값에서 떨어진 거리(예: 300, 600, 900 등)를 입력합니다.
       알림: 첫 번째 측정 간격은 시신경에서 300μm 떨어진 곳에 해당하고 두 번째 측정 간격은 600μm 떨어진 곳에 해당합니다.
15. 각 샘플의 망막 이미지를 기반으로 RPE 병리 발생률을 정량화합니다.
    1. Fiji ImageJ 프로그램을 엽니다.
    2. Fiji ImageJ 프로그램 내에서 Cell Counter 응용 프로그램을 엽니 다. Fiji ImageJ 메뉴 표시줄에서 Plugins > Analyze > Cell Counter를 클릭합니다. 망막 이미지를 Fiji ImageJ 작업 표시줄로 드래그하고 셀 카운터 창에서 초기화를 클릭합니다.
    3. Cell Counter 응용 프로그램을 사용하여 망막 섹션당 RPE 병리의 수를 계산합니다. 카운터(Counters)에서 유형 1(Type 1)을 클릭한 다음 이미지의 모든 마이크로바쿠올레이션 이벤트(all microvacuolization events)를 클릭합니다. 카운터(Counters)에서 유형 2(Type 2)를 클릭한 다음 이미지의 모든 매크로 vacuolization 이벤트를 클릭합니다. Counters(카운터)에서 Type 3(유형 3)을 클릭한 다음 이미지의 모든 개별 마이그레이션 이벤트를 클릭합니다.
    4. RPE 병리의 번호를 스프레드시트로 전송합니다. 행에는 microvacuolization, macrovacuolization 또는 migration으로 레이블을 지정하고 열에 mouse identification으로 레이블을 지정합니다.
    5. 샘플의 다른 이미지에 대해 1.15.2-1.15.4단계를 반복합니다. 샘플당 RPE 병리 수를 평균화하고 5로 나누어 스프레드시트의 샘플에 대한 각 RPE 병리의 발생률을 계산합니다.
16. 각 간격의 RPE 두께와 RPE 병리 발생률에 대한 통계 분석을 수행하여 연구에서 그룹 간에 유의미한 차이가 있는지 확인합니다.

2. 투과전자현미경에 의한 마우스 RPE 평가

1. 1.5-1.9 단계 후에 산출 된 다른 후방 세그먼트를 면도날로 상위 마크를 통해 반으로 자릅니다. 절편된 후방 세그먼트의 위쪽 면에 조직 마킹 염료로 주석을 답니다. 절단된 후방 세그먼트를 2mL의 1x PBS 및 마우스 식별이 포함된 새로운 2mL 마이크로튜브로 분리합니다.
   참고: 마우스 후방 세그먼트는 너무 커서 한 조각으로 처리할 수 없으며 투과 전자 현미경 처리를 위해 반으로 잘라야 합니다.
2. 2mL의 0.1M 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)으로 조직을 헹굽니다. 벤치 탑의 RT에서 10 분 동안 배양합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
3. 0.1M 카코디레이트 완충액을 0.1M 카코디레이트 완충액에 희석된 2% 사산화오스뮴(_OsO4) 2mL로 교체합니다. 흄 후드의 RT에서 1.5 시간 동안 배양합니다.
   주의 : OsO₄ 는 독성 물질입니다. OsO₄로 작업할 때는 표준 작동 절차를 따르십시오.
4. 흄 후드의 RT에서 10분 동안 2mL의 0.1M 카코딜레이트 완충액으로 조직을 헹굽니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
5. 흄 후드의 RT에서 50%에서 100% 범위의 눈금이 매겨진 EtOH 희석액으로 조직을 탈수합니다. 탈수 절차에 대한 프로토콜은 보충 그림 7에서 찾을 수 있습니다.
6. 조직에서 100% EtOH를 제거하고 2mL의 프로필렌 옥사이드를 조직에 추가합니다. 흄 후드의 RT에서 15분 동안 배양합니다. 조직에서 프로필렌 옥사이드를 제거하고 신선한 프로필렌 옥사이드 2mL를 티슈에 추가합니다. 흄 후드의 RT에서 15분 동안 배양합니다.
   주의 : 프로필렌 옥사이드는 독성 물질입니다. 프로필렌 옥사이드로 작업할 때 표준 작동 절차를 따르십시오.
7. 티슈에서 프로필렌 옥사이드를 제거하고 프로필렌 옥사이드와 수지의 1:1 혼합물 2mL를 티슈에 추가합니다. RT의 흄 후드에 진공 상태에서 밤새 두십시오.
   주의 : 수지는 인체에 유해한 물질입니다. 수지로 작업할 때는 실험실의 표준 작동 절차를 따르십시오.
8. 프로필렌 옥사이드와 티슈의 수지의 1:1 혼합물을 순수 수지 2mL로 교체합니다. RT의 흄 후드에 진공 상태에서 밤새 두십시오.
9. 수지에 조직을 삽입하십시오. 연필로 마우스 식별이 있는 라벨을 붙이고 수지 한 방울을 금형에 넣습니다. 수지 방울에 조직을 놓습니다. 금형에 수지를 채우고 흄 후드의 RT에서 1시간 동안 진공 상태에 두십시오.
10. 끝이 가는 집게로 라벨과 표본의 위치를 조정하고 후방 아이컵 섹션의 뒤쪽이 위에 오도록 합니다. 금형을 흄 후드의 오븐에 65°C에서 밤새 그대로 두십시오.
11. 오븐에서 금형을 제거합니다. 금형을 벤치탑에서 RT로 식히십시오. 금형에서 블록을 제거합니다.
    알림: 이제 블록을 트리밍할 준비가 되었습니다.
12. 면도날로 수지 블록을 성형하여 사다리꼴을 만듭니다. 시신경 머리가 보일 때까지 마이크로 톰을 사용하여 수지 블록을 다듬습니다. 다이아몬드 나이프를 사용하여 0.5μm 두께의 수지 블록에서 반박형 부분을 절단합니다.
    참고: 다음은 마이크로톰 절편²⁷에 대한 게시된 프로토콜입니다. 원하는 경우 수지 블록에서 0.5μm 두께의 반박막 섹션을 수집하고 염색하여 샘플의 무결성을 평가할 수 있습니다.
13. 울트라마이크로톰을 사용하여 트리밍된 각 블록에서 70nm 두께의 초박형 섹션을 자릅니다. 400 메쉬 박막 구리 그리드에서 70nm 두께의 초박형 섹션을 수집합니다. 그리드를 그리드 보관 상자에 넣고 마우스 ID로 슬롯에 레이블을 지정합니다.
    참고: 다음은 울트라마이크로톰 절편²⁸에 대해 발표된 프로토콜입니다.
14. 2% 우라닐 아세테이트로 그리드를 5분 동안 염색한 다음 흄 후드의 RT에서 3.5% 구연산 납 용액으로 5분 동안 염색합니다.
    주의 : 우라닐 아세테이트와 구연산 납은 유해 물질입니다. 이러한 물질로 작업할 때는 표준 작동 절차를 따르십시오.
15. 15,000x 배율의 투과 전자 현미경을 사용하여 각 샘플에 대한 이미지를 얻으며, 여기서 구리 그리드의 그리드 라인이 RPE와 BrM을 교차합니다.
    참고: 섹션당 최소 20-35개의 이미지가 있어야 하고 샘플당 40-70개의 이미지가 있어야 합니다.
16. 연구의 샘플에 대한 이미지에서 BLamD 높이를 정량화합니다.
    1. Fiji ImageJ 프로그램을 엽니다. 샘플 섹션의 모든 이미지를 Fiji ImageJ 작업 표시줄로 끕니다. 이미지가 픽셀이 아닌 μm 단위로 보정되었는지 확인합니다.
    2. 이미지에서 BLamD 높이를 측정합니다. Fiji ImageJ 작업 표시줄에서 직선 아이콘을 클릭합니다. BrM의 탄성 층에서 이미지를 가장 높은 퇴적물의 맨 위로 선을 클릭하고 드래그합니다(보충 그림 8). Fiji ImageJ 메뉴 모음에서 분석 > 측정을 클릭하여 이미지의 BLamD 높이를 가져옵니다.
       참고: 이미지에 BLamD가 없는 경우 BrM의 탄성 층에서 RPE의 기저층까지 선을 그립니다.
    3. BLamD 높이를 스프레드시트로 전송하고 마우스 식별이 가능한 레이블을 지정합니다.
17. 스프레드시트에서 유전자형당 BLamD 높이의 누적 빈도와 마우스당 BLamD 높이의 평균을 계산합니다. BLamD 높이의 평균에 대한 통계 분석을 수행하여 연구에서 그룹 간에 유의한 차이가 있는지 확인합니다.

3. 공초점 현미경을 통한 마우스 RPE 평가

1. 생쥐에서 눈을 모으십시오. 단계 1.3에 기술된 절차에 따라 마우스를 안락사시킨다. 1.5 단계를 사용하여 눈을 적출하십시오. 구부러진 집게를 사용하여 2mL의 1x PBS 및 마우스 식별이 있는 2mL 마이크로튜브에 눈을 넣습니다.
   참고: 광수용체와 RPE 정점 과정의 상호 디지털화를 통해 공초점 현미경을 통해 RPE를 더 잘 시각화할 수 있으므로 마우스를 어둡게 적응시키지 마십시오.
2. 마우스 눈을 즉시 세척하고 해부하여 마우스 후방 아이컵을 생성합니다.
   참고: 후방 아이컵은 신경 망막을 포함하지 않기 때문에 후방 안구와 다릅니다.
   1. 해부 현미경 하에서 1x PBS를 함유하는 페트리 접시로 눈을 옮깁니다(보충 그림 9A).
   2. 단계 1.8.2에 설명된 대로 안구에서 지방과 근육을 제거합니다(보충 그림 9B).
   3. 숫자 11 메스 블레이드로 안구의 각막을 닉네임. 1.8.3단계(보충 그림 9C)에 설명된 대로 각막과 홍채를 제거합니다.
   4. 끝이 가는 집게로 렌즈를 당겨 빼냅니다. 끝이 가는 두 개의 집게를 잡고 신경 망막을 뒤쪽 부분과 부드럽게 분리합니다.
   5. 후방 아이컵에서 제거하기 위해 시신경두의 신경 망막을 조심스럽게 절단합니다(보충 그림 9D).
   6. 마우스 식별이 가능한 2x PBS 500μL가 들어 있는 새 1mL 마이크로튜브에 후방 아이컵을 넣습니다.
3. 후방 아이컵을 메탄올(MeOH)로 고정합니다(보충 그림 10).
   참고: 3.3단계를 완료하는 데 약 2시간 40분이 걸립니다.
   1. 500 μL의 MeOH를 조직에 첨가한다. RT에서 5분 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다.
   2. 조직에서 500 μL의 용액을 제거하고 500 μL의 MeOH를 첨가한다. RT에서 5분 동안 75rpm의 셰이커에서 5분 동안 배양합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
   3. 조직에서 전체 용액을 제거하고 500 μL의 MeOH를 첨가한다. RT에서 최소 2시간 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다.
      참고: 단계 3.3.3의 대안으로, 후방 아이컵은 4°C 방에서 75rpm의 셰이커에서 MeOH에서 밤새 배양할 수 있습니다.
   4. 500 μL의 1x PBS를 조직에 추가합니다. RT에서 5분 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다.
   5. 조직에서 500 μL의 용액을 제거하고 500 μL의 1x PBS를 추가합니다. RT에서 5분 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
   6. 조직에서 전체 용액을 제거하고 500μL의 1x PBS로 교체합니다.
      알림: 조직은 MeOH에 의해 완전히 고정되며 최소 4개월 동안 1°C 냉장고에 보관할 수 있습니다.
4. 후방 안구재의 면역형광 염색을 수행하여 RPE의 긴밀한 접합부와 핵을 시각화합니다(보충 그림 11).
   1. 샘플에서 500μL의 1x PBS를 제거하고 1x PBS 용액에 희석된 10% 정상 당나귀 혈청 100μL를 추가합니다. RT에서 30분 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다.
   2. 샘플에서 희석된 10% 정상 당나귀 혈청 용액을 제거하고 1x PBS에 토끼 다클론 항-Zonula Occludens-1(ZO-1) 항체의 1:50 희석액 100μL를 추가합니다. 샘플을 4°C 방으로 옮기고 75rpm의 진탕기에서 밤새 배양합니다.
   3. 샘플에서 항체 희석액을 제거하고 2mL의 1x PBS를 추가합니다. RT에서 10분 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
   4. 샘플에서 1x PBS를 제거합니다. 488 형광단 접합 태그가 있는 당나귀 항-토끼 IgG 항체의 1:250 희석액 100μL와 1x PBS의 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride(DAPI)의 1:250 희석액을 샘플에 추가합니다. 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 RT에서 2시간 동안 75rpm의 셰이커에서 배양합니다.
      알림: 샘플은 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 완전히 덮어야 합니다.
   5. 샘플에서 항체 및 DAPI 희석액을 제거합니다. 샘플에 1x PBS 2mL를 추가하고, 알루미늄 호일로 다시 덮고, RT에서 10분 동안 75rpm의 셰이커에서 인큐베이션합니다.
      알림: RPE의 단단한 접합부와 핵은 이제 각각 완전히 레이블이 지정되고 염색됩니다.
5. 후방 아이컵을 현미경 슬라이드에 장착합니다.
   1. 현미경 슬라이드에 마우스 식별로 레이블을 지정합니다. 맥락막 쪽이 아래를 향하도록 해부 현미경 아래의 현미경 슬라이드에 후방 아이컵을 옮깁니다. 후방 아이컵이 건조해지는 것을 방지하기 위해 1x PBS 한 방울을 추가합니다(보충 그림 12).
   2. 기본 방향(즉, 북쪽, 동쪽, 남쪽 및 서쪽)에 해당하는 4개의 사분면을 생성하는 4개의 지점에서 숫자 11 메스 블레이드를 사용하여 후방 아이컵을 자릅니다. 후방 안구 주변의 조직으로 초과 1x PBS를 두드려줍니다. 낙타 빗과 끝이 가는 집게로 후방 아이컵을 부드럽게 평평하게 합니다(보충 그림 12).
      알림: 결과 제품은 이제 RPE 플랫 마운트로 알려져 있습니다.
   3. RPE 플랫 마운트에 마운팅 매체 한 방울을 추가하고 그 위에 커버슬립을 놓습니다. 투명한 매니큐어를 발라 커버슬립을 밀봉하고 닫힌 서랍에서 RT에서 최소 30분 동안 건조시킵니다. 슬라이드를 슬라이드 캐리어 상자에 넣고 상자를 4°C 냉장고에 보관합니다.
      알림: RPE 플랫 마운트에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. RPE 플랫 마운트는 2주 이내에 이미지화할 수 있습니다.
6. 각 샘플에 대해 20x 배율로 컨포칼 현미경에서 RPE 플랫 마운트의 시신경을 둘러싸고 있는 4개의 사분면 각각의 이미지를 얻습니다. RPE 플랫 마운트 이미지의 예는 보충 그림 13A에서 찾을 수 있습니다.
   알림: RPE 플랫 마운트의 치수 차이를 보상하기 위해 여러 이미지를 촬영하고 쌓는 RPE 플랫 마운트의 z-스택 이미징을 수행해야 할 수도 있습니다.
7. 각 RPE 플랫 마운트 이미지 내에서 RPE 셀의 긴밀한 접합을 추적합니다. 추적된 RPE 플랫 마운트 이미지의 예는 보충 그림 13B에서 찾을 수 있습니다.
   1. Fiji ImageJ 프로그램을 엽니다. RPE 플랫 마운트 이미지를 Fiji ImageJ 작업 표시줄로 끕니다. 이미지가 픽셀이 아닌 마이크로미터 단위로 보정되었는지 확인합니다.
   2. Fiji ImageJ 작업 표시줄에서 오버레이 브러시 도구 아이콘을 두 번 클릭하여 브러시 너비를 3으로, 투명도를 0으로, 색상을 빨간색으로 설정합니다. Overlay Brush Tool 창에서 Close 버튼을 클릭합니다.
   3. Overlay Brush Tool 아이콘을 클릭합니다. 이미지 내에 완전히 있는 모든 RPE 셀의 밀접한 접합부를 클릭하고 끕니다.
      참고: 추적 실수가 있는 경우 오버레이 브러시 도구 아이콘을 두 번 클릭하고 오버레이 브러시 도구 창에서 실행 취소 상자를 클릭하여 이미지에서 추적 실수를 제거합니다.
   4. Fiji ImageJ 작업 표시줄에서 사각형 아이콘을 클릭합니다. 이미지를 클릭하고 이미지 주변을 끕니다. Fiji ImageJ 메뉴 모음에서 편집 > 지우기 를 클릭하여 추적된 선을 유지하고 이미지에서 파란색과 녹색을 제거합니다.
   5. 마우스 식별, 사분면 위치(예: 북쪽, 남쪽, 동쪽 또는 서쪽) 및 CP 접미사 레이블이 있는 적절한 위치에 추적 이미지를 저장합니다.
      참고: 3.7.4단계를 완료하기 전에 RPE 추적 이미지를 저장하지 마십시오.
8. 각 샘플에 대한 RPE 셀 면적을 계산합니다.
   1. 컴퓨터 바탕 화면에 폴더를 만들어 RPE 영역 분석에서 파일을 저장할 위치를 지정합니다. 각 RPE 추적 이미지에 대한 하위 폴더를 생성하고 마우스 식별 및 사분면 위치(예: 북쪽, 남쪽, 동쪽 또는 서쪽)로 하위 폴더에 레이블을 지정합니다.
   2. Cell Profiler 프로그램²⁹를 설치하고 엽니다. Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj(Supplementary Coding File 1) 프로젝트 파일을 다운로드합니다. 셀 프로파일러 프로그램 메뉴 모음에서 파일 > 프로젝트 열기 를 클릭하여 Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj 파일을 엽니다.
   3. 하나의 RPE 추적 이미지를 Cell Profiler 프로그램 창의 Image > Drop Files and Folders Here 상자로 끕니다.
   4. RPE 추적 이미지에 해당하는 Cell Profiler 프로그램에 폴더의 위치를 입력합니다. Cell Profiler 프로그램 창의 왼쪽 하단에 있는 Output Settings 버튼을 클릭하고 Default Input Folder 및 Default Output Folder 텍스트 상자에 폴더 위치를 입력합니다.
   5. Cell Profiler 프로그램 창의 왼쪽 하단에 있는 Analyze Images 버튼을 클릭합니다. 분석이 완료되면 화면에 분석 완료 창이 나타납니다. 분석 완료(Analysis Complete) 창에서 확인(OK) 버튼을 클릭합니다.
      참고: 이 작업은 csv 파일 및 jpeg 이미지를 생성합니다. csv 파일에는 추적 이미지 내의 RPE 셀 영역이 포함됩니다. jpeg 이미지는 RPE 추적 이미지에 해당하며 각 RPE 셀에는 숫자가 표시됩니다(보충 그림 13C).
   6. csv 파일의 RPE 영역을 스프레드시트로 전송합니다. 스프레드시트에 마우스 ID로 레이블을 지정합니다.
   7. csv 파일의 각 RPE 영역이 jpeg 이미지의 완전히 추적된 RPE 셀에 연결되는지 확인하여 데이터의 품질 관리 조사를 수행합니다. 스프레드시트에서 완전히 추적된 RPE 셀에 해당하지 않는 값을 제거합니다.
   8. 셀 프로파일러 프로그램으로 돌아갑니다. 여기에 파일 및 폴더 삭제 상자에서 RPE 추적 이미지 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 목록 지우기 를 선택하여 셀 프로파일러 프로그램에서 이미지를 제거합니다.
   9. 3.8.3-3.8.8단계를 반복하여 샘플의 나머지 3개의 RPE 추적 이미지에 대한 RPE 크기를 계산합니다.
9. 스프레드시트의 각 샘플에 대한 RPE 셀 크기 평균을 정량화합니다.
10. 스프레드시트의 각 샘플에 대한 RPE 셀 밀도를 정량화합니다. RPE 셀 밀도를 계산하려면 사분면당 총 RPE 셀 수를 Cell Profiler 프로그램에서 감지한 사분면당 RPE 셀의 총 영역으로 나눕니다. 샘플당 4개의 사분면에서 RPE 셀 밀도의 평균을 결정합니다.
11. 각 샘플에 대해 RPE 플랫 마운트당 다핵 RPE 세포의 수를 정량화합니다. 1.15.1-1.15.3 단계에서 설명한 대로 Fiji ImageJ 프로그램 내의 Cell Counter 응용 프로그램을 사용하여 샘플의 4사분면에 3개 이상의 핵이 있는 RPE 세포의 수를 계산합니다.
12. RPE 세포 크기 및 밀도 평균과 다핵 RPE 세포의 수에 대한 통계 분석을 수행하여 연구에서 그룹 간에 유의미한 차이가 있는지 확인합니다.

결과

이 기사에 설명된 RPE 표현형 프로토콜의 완성은 AMD의 마우스 모델에서 일반적으로 관찰되는 구조적 RPE 이상에 대한 정량적 분석을 제공합니다. 이 프로토콜의 효과를 확인하기 위해 우리는 닭 베타-액틴 프로모터(Tmem135 TG)³⁰ 및 노화된 C57BL/6J 마우스^31,32에 의해 구동되는 WT Tmem135를 과발현하는 형질전환 마우스를 포함하여...

토론

이 기사에서는 마우스 모델의 구조적 RPE 병리를 평가하기 위한 표현형 프로토콜을 소개했습니다. 우리는 빛, 투과 전자 및 컨포칼 현미경을 포함한 다양한 이미징 기술을 위해 눈을 처리하는 데 필요한 단계와 이러한 이미징 방법을 통해 관찰되는 일반적인 병리의 정량화에 대해 설명했습니다. 우리는 Tmem135 TG 및 24개월 된 WT 마우스를 검사하여 RPE 표현형 프로토콜의 효과를 입증했?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02