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摘要

超声疗法 （SDT） 是聚焦超声 （FUS） 的一种应用，它使超敏剂能够引发肿瘤，从而在超声处理过程中提高敏感性。不幸的是，目前缺乏胶质母细胞瘤 （GBM） 的临床治疗，导致患者的长期生存率低。SDT 是一种很有前途的方法，可以有效、无创和肿瘤特异性的方式治疗 GBM。与周围的脑实质相比，超声增敏剂优先进入肿瘤细胞。在声敏剂存在下应用FUS会产生反应性氧化物质，导致细胞凋亡。尽管这种疗法先前已在临床前研究中被证明是有效的，但缺乏既定的标准化参数。标准化方法对于优化这种临床前和临床使用的治疗策略是必要的。在本文中，我们详细介绍了使用磁共振引导的 FUS （MRgFUS） 在临床前 GBM 啮齿动物模型中执行 SDT 的方案。MRgFUS是该协议的一个重要特征，因为它允许特异性靶向脑肿瘤，而无需侵入性手术（例如，开颅手术）。这里使用的台式设备可以通过点击MRI图像上的目标，在三维空间中聚焦到特定位置，使目标选择成为一个简单的过程。该协议将为研究人员提供MRgFUS SDT的标准化临床前方法，并增加了更改和优化转化研究参数的灵活性。

Discussion

GBM患者需要新的治疗和有效的治疗方案。该协议概述了一种临床前 FUS 介导的 GBM 治疗，目前正在进行广泛的临床转化研究。尽管SDT具有令人兴奋的潜力，但在临床前环境中仍有许多需要理解和优化的地方。

该协议最重要的组成部分之一是利用 MR 引导的 FUS 靶向肿瘤以获得最大疗效。使用模型，可以创建一个 3D 坐标空间，其中可以为轴向 MRI 切片的每个像素分配一个坐标。然后，在MR图像上选择超声处理位置的简单程序会通知换能器瞄准的位置。所使用的临床前FUS系统具有高度的通用性，适用于需要靶向特定病理学位置（如肿瘤）的情况，包括没有影像学确认就很难靶向的更深的肿瘤。使用钆作为造影剂，可以清晰地显示肿瘤，使用户在选择靶点时能够做出明智的决定。与许多其他治疗方法相比，SDT的优势在于它是一种肿瘤特异性疗法。低强度 FUS 应仅针对肿瘤组织，同时保持健康的脑实质相对不变 3,8。

该实验的结果突出了该协议的优势如何导致与SDT文献中其他发现相似的治疗结果。 图 5 显示，在治疗当天后的短短 24 小时内，治疗队列中的肿瘤生长速度减慢。虽然使用这种小样本量微不足道，但大量动物可能会产生显着性。这种肿瘤生长的延迟类似于Wu等人（2019）关于该主题的开创性论文中显示的内容，该论文在治疗动物中显示出肿瘤生长随着时间的推移而减慢，以及生存时间增加9。

设计该方案时考虑的因素包括动物品系、肿瘤类型和声敏剂选择。出于多种原因，选择无胸腺裸鼠用于该协议。首先，裸鼠更容易超声处理，因为没有毛发会阻止任何衰减。此外，由于缺乏免疫系统，可以植入患者来源的异种移植物 （PDX），从而使肿瘤模型更接近临床情况。使用无胸腺模型的缺点是无法表征免疫系统，因此在这些研究中不会测量任何 SDT 产生的免疫反应10。选择的肿瘤细胞系是侵袭性且快速生长的PDX细胞系。治疗的时间非常重要，因为必须验证肿瘤的建立，但肿瘤负荷不应充满颅半球。不同的细胞系需要不同的孵育时间才能获得最佳大小的肿瘤，以进行临床前实验。在该方案中，5-ALA被用作声敏剂，因为它在GBM肿瘤中具有优先摄取性，这在先前的实验中已 在体外 证实了该细胞系（未发表的数据）。可以替代和测试其他声敏剂，以确定最适合功效和安全性的化合物。最后，在注射 5-ALA 后 3 小时开始治疗，因为先前的文献表明这是注射剂量5 的最佳时间。

该协议中选择的FUS参数（每个目标位置在515kHz下10 W /cm 2 2分钟）是根据对先前文献和初步实验的回顾决定的4,9。选择覆盖整个肿瘤的超声处理点网格，以便在整个肿瘤中产生ROS效应。这里使用的强度高于其他出版物，但在短时间跨度内，预计不会导致任何与温度相关的不良影响，因为高达 25 W/cm2 的强度已成功用于小鼠模型，没有明显的副作用11。重要的是，文献中没有发表标准化或优化的FUS参数集。因此，可以调整此处报告的特定值以确定最佳参数集，从而在保持安全性的同时最大限度地减少肿瘤组织。此外，由于不同的细胞系具有不同程度的血管化和缺氧，因此可能需要调整这种治疗。我们已经显示，在SDT治疗的24小时内，肿瘤生长总体减少（图5），尽管需要优化参数，并且需要测试更多的动物以确定这种治疗的最大效果。治疗后的MRI扫描显示，FUS治疗在健康组织中没有出现病变，其作用局限于肿瘤组织（图6）。还有机会将 SDT 与其他 FUS 技术相结合，例如瞬时透化血脑屏障，以最大限度地提高肿瘤 5-ALA 的摄取12。该方案可以通过执行各种组织学技术来进一步补充，以检查结构水平的安全性和有效性。可以进行苏木精和伊红 （H&E） 染色以检查结构或肿瘤损伤13，而末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 （TUNEL） 染色可以检查细胞凋亡14。无论如何，该方案提供了一种安全的肿瘤特异性治疗，即使在治疗后24小时也会出现明显的变化，这通过比较用SDT治疗的肿瘤和未治疗的肿瘤的生长速率以及比较超声处理前后的肿瘤切片是显而易见的。

对于任何协议，总有一些缺点或局限性需要权衡。当前协议的主要限制是时间和费用。同时，该协议的优点之一是其自动聚焦目标。为了完成这一集中的程序，需要对每只动物进行MRI扫描，以确保肿瘤的靶向正确，这一过程既耗时又昂贵。此外，根据所需的焦点数量，即使只有几只动物，执行该协议的时间也可能是数小时，导致实验动物数量低。尽管存在这些缺点，但与开放手术方案相比，这种有针对性的无创方案仍然是一种可行的选择。

总之，该方案显示了SDT治疗在治疗后24小时内减少大脑肿瘤生长的能力，同时在临床前小鼠模型中保持健康的神经组织。有必要研究SDT的有效性并优化各种参数以增加ROS的产生，以使这种治疗在临床上适用。应探索使用特殊和差别疗法作为无创治疗模式的新途径。

披露声明

作者声明，该研究是在没有任何可被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。Amir Manbachi 为 BK Medical （GE Healthcare）、Neurosonics Medical 任教和咨询，并且是多项正在申请专利的 FUS 技术的发明者。贝蒂·泰勒（Betty Tyler）获得了美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，并且是加速联合疗法*的共同所有人。Ashvattha Therapeutics Inc.还授权了她的一项专利，她是Peabody Pharmaceuticals的股东（*包括股权或期权）。

致谢

作者感谢美国国家科学基金会 （NSF） STTR 第 1 阶段奖 （#: 1938939）、ASME 国防高级研究计划局 （DARPA） 奖 （#: N660012024075） 和约翰霍普金斯临床和转化研究所 （ICTR） 临床研究学者计划 （KL2） 的资金支持，该计划由美国国立卫生研究院 （NIH） 国家促进转化科学中心 （NCATS） 管理。这些细胞是从梅奥医学教育和研究基金会购买的，并由其提供。

参考文献

  1. Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
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  5. Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105(2021).
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  9. Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465(2019).
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