Method Article
טיפול סונודינמי לטיפול בגליובלסטומה מולטיפורמה במודל עכבר באמצעות מערכת אולטרסאונד ניידת ממוקדת ספסל
Abstract
טיפול סונודינמי (SDT) הוא יישום של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המאפשר לסוכן סונוסנסיטיזציה לגידולים ראשוניים לרגישות מוגברת במהלך סוניקציה. למרבה הצער, הטיפולים הקליניים הנוכחיים לגליובלסטומה (GBM) לוקים בחסר, מה שמוביל לשיעורי הישרדות נמוכים לטווח ארוך בקרב חולים. SDT היא שיטה מבטיחה לטיפול בגליובלסטומה באופן יעיל, לא פולשני וספציפי לגידול. Sonosensitizers עדיף להיכנס תאים סרטניים לעומת parenchyma המוח שמסביב. היישום של FUS בנוכחות סוכן sonosensitizing מייצר מינים חמצון תגובתי וכתוצאה מכך אפופטוזיס. למרות שטיפול זה הוכח בעבר כיעיל במחקרים פרה-קליניים, חסרים פרמטרים סטנדרטיים מבוססים. שיטות סטנדרטיות נחוצות כדי לייעל אסטרטגיה טיפולית זו לשימוש פרה-קליני וקליני. במאמר זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול לביצוע SDT במודל מכרסם GBM פרה-קליני באמצעות FUS מונחה תהודה מגנטית (MRgFUS). MRgFUS הוא תכונה חשובה של פרוטוקול זה, מכיוון שהוא מאפשר מיקוד ספציפי של גידול במוח ללא צורך בניתוחים פולשניים (למשל, קרניוטומיה). מכשיר הספסל המשמש כאן יכול להתמקד במיקום ספציפי בתלת מימד על ידי לחיצה על מטרה בתמונת MRI, מה שהופך את בחירת המטרה לתהליך פשוט. פרוטוקול זה יספק לחוקרים שיטה פרה-קלינית מתוקננת עבור MRgFUS SDT, עם גמישות נוספת לשנות ולמטב פרמטרים למחקר תרגומי.
Discussion
אפשרויות טיפול חדשות ויעילות נחוצות לחולים עם GBM. פרוטוקול זה התווה טיפול פרה-קליני בתיווך FUS עבור GBM שנמצא כעת בחקירה מקיפה לתרגום קליני. למרות של-SDT יש פוטנציאל מרגש, יש עדיין הרבה מה להבין ולייעל במסגרת הפרה-קלינית.
אחד המרכיבים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הוא שימוש ב- FUS מונחה MR כדי למקד את הגידול ליעילות מרבית. באמצעות פאנטום ניתן ליצור מרחב קואורדינטות תלת-ממדי, שבו ניתן להקצות לכל פיקסל של פרוסות MRI ציריות קואורדינטה. לאחר מכן, הליך פשוט של בחירת מיקום הסוניקציה בתמונת MR מודיע למתמר לאן לכוון. מערכת FUS הפרה-קלינית המשמשת היא רב-תכליתית ביותר וישימה כאשר יש צורך להתמקד במיקומים של פתולוגיה ספציפית כגון גידול, כולל גידולים עמוקים יותר שיהיה קשה להתמקד בהם ללא אישור הדמיה. באמצעות גדוליניום כסוכן ניגוד, יש הדמיה ברורה של הגידול, המאפשר למשתמש לקבל החלטות מושכלות בעת בחירת מטרות. היתרון שיש ל-SDT על פני טיפולים רבים אחרים הוא שמדובר בטיפול ספציפי לגידול. FUS בעוצמה נמוכה צריך להתמקד רק ברקמת הגידול, תוך השארת פרנכימה בריאה במוח יחסית ללא נגיעה 3,8.
תוצאות ניסוי זה מדגישות כיצד היתרונות של פרוטוקול זה יכולים להוביל לתוצאות טיפוליות הדומות לממצאים אחרים בספרות עבור SDT. איור 5 מראה שבתוך 24 שעות בלבד לאחר יום הטיפול, חלה האטה בצמיחת הגידול בקבוצה שטופלה. למרות שאין משמעות בשימוש בגודל מדגם קטן זה, משמעות עשויה לגרום למספר גדול יותר של בעלי חיים. עיכוב זה בצמיחת הגידול דומה למה שהוצג במאמר החלוצי בנושא זה על ידי Wu et al. (2019), אשר הציג האטה בצמיחת הגידול לאורך זמן בבעלי חיים מטופלים, כמו גם זמני הישרדות מוגברים9.
שיקולים שנעשו בעת תכנון פרוטוקול זה כללו זן בעלי חיים, סוג הגידול ובחירת סוכן sonosensitizing . עכברים עירומים אתימיים נבחרו לפרוטוקול זה מסיבות רבות. ראשית, העכבר העירום קל יותר לסוניקציה מכיוון שחוסר השיער מונע כל הנחתה. כמו כן, היעדר מערכת חיסונית מאפשר השתלה של xenografts נגזר המטופל (PDXs) כך מודל הגידול דומה יותר למצב הקליני. החיסרון בשימוש במודל אתימי הוא שלא ניתן לאפיין את מערכת החיסון, ולכן כל תגובה חיסונית הנוצרת על ידי SDT לא תימדד במחקרים אלה10. קו הגידול שנבחר הוא קו PDX אגרסיבי וצומח במהירות. זמן הטיפול חשוב מאוד מכיוון שיש לאמת את הקמת הגידול, אך נטל הגידול לא צריך למלא את חצי כדור הגולגולת. קווי תאים שונים דורשים זמני דגירה שונים כדי להשיג גידול בגודל אופטימלי לניסויים פרה-קליניים. בפרוטוקול זה, 5-ALA שימש כסונוסנסיטיזר בגלל ספיגתו המועדפת בגידולי GBM, אשר אושרה במבחנה עבור קו תאים זה בניסויים קודמים (נתונים שלא פורסמו). ניתן להחליף ולבדוק sonosensitizers אחרים כדי לקבוע את התרכובת המתאימה ביותר ליעילות ובטיחות. לבסוף, הטיפול החל 3 שעות לאחר הזרקת 5-ALA, שכן ספרות קודמת הראתה כי זהו הזמן האופטימלי עם מינוןהזרקה 5.
פרמטרי FUS שנבחרו בפרוטוקול זה (10 ואט/ס"מ 2 למשך2 דקות ב-515 קילוהרץ בכל מיקום מטרה) נקבעו על סמך סקירת ספרות קודמת וניסויים ראשוניים 4,9. רשת של נקודות סוניקציה המכסה את הגידול כולו נבחרה על מנת ליצור את אפקט ROS לאורך הגידול כולו. האינטנסיביות בה נעשה שימוש כאן גבוהה יותר מפרסומים אחרים, אך בטווח זמן קצר, הדבר אינו צפוי להוביל להשפעות שליליות הקשורות לטמפרטורה, שכן עוצמות של עד 25 ואט/ס"מ2 שימשו בהצלחה במודל עכבר ללא תופעות לוואי משמעותיות11. חשוב לציין, לא פורסמה בספרות קבוצה סטנדרטית או ממוטבת של פרמטרים של FUS. לכן, ניתן להתאים את הערכים הספציפיים המדווחים כאן כדי לקבוע את מערכת הפרמטרים האופטימלית, מה שמוביל להפחתה מקסימלית של רקמת הגידול תוך שמירה על בטיחות. בנוסף, מכיוון שלקווי תאים שונים יש רמות שונות של כלי דם והיפוקסיה, ייתכן שיהיה צורך להתאים טיפול זה. הראינו ירידה כללית בצמיחת הגידול (איור 5) תוך 24 שעות מהטיפול ב-SDT, אף על פי שהפרמטרים צריכים להיות אופטימליים ולחיות נוספות צריכות להיבדק כדי לקבוע את ההשפעה המרבית של הטיפול הזה. סריקות MRI לאחר הטיפול לא מראות שום הופעה של נגעים שנוצרו על-ידי טיפול FUS ברקמה בריאה, עם השפעה מקומית לרקמת הגידול (איור 6). יש גם הזדמנות לשלב SDT עם טכניקות FUS אחרות, כגון חדירה זמנית של מחסום הדם-מוח, כדי למקסם את ספיגת 5-ALA בגידול12. פרוטוקול זה ניתן להשלים עוד יותר על ידי ביצוע טכניקות היסטולוגיה שונות כדי לבדוק בטיחות ויעילות ברמה המבנית. ניתן לבצע כתם המטוקסילין ואוזין (H&E) כדי לבדוק נזק מבני או גידולי13, ואילו כתם מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) ניתן לבצע כדי לבדוק אפופטוזיסתאי 14. בכל מקרה, פרוטוקול זה מציג טיפול בטוח וספציפי לגידול שבו השינויים מורגשים אפילו 24 שעות לאחר הטיפול, דבר שניתן לראות על ידי השוואת קצב הצמיחה של גידולים שטופלו ב- SDT וגידולים לא מטופלים, כמו גם השוואת פרוסות גידול לפני ואחרי סוניקציה.
בכל פרוטוקול, תמיד יש חסרונות או מגבלות שצריך לשקול. המגבלה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא זמן והוצאות. בינתיים, אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא המטרה הממוקדת האוטומטית שלו. כדי לבצע הליך ממוקד זה, יש לבצע סריקות MRI עבור כל בעל חיים בנפרד כדי להבטיח כי המיקוד של הגידול נכון, תהליך שיכול להיות גם זמן רב וגם יקר. בנוסף, בהתאם למספר המוקדים הרצוי, משך הזמן לביצוע פרוטוקול זה יכול להיות שעות אפילו עבור בעלי חיים בודדים, וכתוצאה מכך מספר נמוך של בעלי חיים ניסיוניים. למרות חסרונות אלה, פרוטוקול לא פולשני ממוקד זה נותר העדפה אפשרית בהשוואה לאפשרויות ניתוח פתוחות.
לסיכום, פרוטוקול זה הראה את היכולת של טיפול SDT להפחית את צמיחת הגידול במוח תוך 24 שעות מהטיפול תוך שמירה על רקמה עצבית בריאה במודל עכבר פרה-קליני. מחקרים על היעילות של SDT ואופטימיזציה של הפרמטרים השונים כדי להגדיל את ייצור ROS נחוצים כדי להפוך את הטיפול הזה מתאים קלינית. יש לבחון דרכים חדשות לשימוש ב-SDT כמודל טיפולי לא פולשני.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי. אמיר מנבצ'י מלמד ומייעץ עבור BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, והוא ממציא במספר טכנולוגיות FUS הממתינות לפטנט. בטי טיילר קיבלה מימון מחקר מה-NIH והיא בעלים שותפה של Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. גם רשמה את אחד הפטנטים שלה, והיא בעלת מניות עבור Peabody Pharmaceuticals (*כולל מניות או אופציות).
Acknowledgements
המחברים מודים על תמיכת מימון מפרס STTR שלב 1 של הקרן הלאומית למדע (NSF) (#: 1938939), על ידי פרס ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (#: N660012024075), ותוכנית חוקרי המחקר הקליני של מכון ג'ונס הופקינס למחקר קליני ותרגומי (ICTR's) (KL2), המנוהלת על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS) של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). התאים נרכשו וסופקו על ידי קרן מאיו לחינוך רפואי ומחקר.
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105(2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986(2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429(2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791(2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465(2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354(2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140(2022).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved