Terapia sonodinâmica no tratamento de glioblastoma multiforme em modelo de camundongo utilizando sistema portátil de ultrassom focalizado de bancada

Novas opções terapêuticas e eficazes de tratamento são necessárias para pacientes com GBM. Este protocolo delineou um tratamento pré-clínico mediado por FUS para GBM que está atualmente passando por extensa investigação para tradução clínica. Embora a TSD tenha um potencial empolgante, ainda há muito a ser compreendido e otimizado no cenário pré-clínico.

Um dos componentes mais importantes desse protocolo é a utilização da USF guiada por RM para atingir o tumor para máxima eficácia. Usando um fantasma, um espaço de coordenadas 3D pode ser criado, onde cada pixel de cortes axiais de ressonância magnética pode ser atribuído a uma coordenada. Em seguida, um procedimento simples de selecionar o local de sonicação na imagem de RM informa ao transdutor para onde mirar. O sistema de USF pré-clínico usado é altamente versátil e aplicável quando se precisa direcionar locais de patologia específica, como um tumor, incluindo tumores de localização mais profunda, que seriam difíceis de atingir sem confirmação por imagem. Usando o gadolínio como agente de contraste, há uma clara visualização do tumor, permitindo que o usuário tome decisões informadas na escolha dos alvos. A vantagem que a TSD tem sobre muitos outros tratamentos é que é uma terapia tumor-específica. O USF de baixa intensidade deve atingir apenas o tecido tumoral, deixando o parênquima cerebral normal relativamente intocado ^3,8.

Os resultados deste experimento destacam como as vantagens desse protocolo podem levar a resultados terapêuticos semelhantes a outros achados da literatura para a TPD. A Figura 5 mostra que, em menos de 24 h após o dia do tratamento, houve uma desaceleração do crescimento tumoral na coorte tratada. Embora insignificante usando este pequeno tamanho amostral, a significância pode resultar em um número maior de animais. Esse atraso no crescimento tumoral é semelhante ao que foi demonstrado no artigo pioneiro sobre o assunto de Wu et al (2019), que exibiu crescimento tumoral desacelerado ao longo do tempo em animais tratados, bem como aumento do tempo de sobrevida⁹.

As considerações que foram feitas ao elaborar este protocolo incluíram cepa animal, tipo de tumor e seleção de agentes sonossensibilizantes. Camundongos atímicos nus foram escolhidos para este protocolo por múltiplas razões. Primeiro, o rato nude é mais fácil de sonicar, pois a falta de cabelo impede qualquer atenuação. Além disso, a falta de um sistema imunológico permite a implantação de xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) para que o modelo tumoral se assemelhe mais à situação clínica. A desvantagem do uso de um modelo atímico é que o sistema imunológico não pode ser caracterizado, de modo que qualquer resposta imune gerada pela SDT não será medida nesses estudos¹⁰. A linhagem tumoral escolhida é uma linhagem PDX agressiva e de crescimento rápido. O tempo de tratamento é muito importante, pois o estabelecimento do tumor deve ser verificado, mas a carga tumoral não deve preencher o hemisfério craniano. Diferentes linhagens celulares requerem diferentes tempos de incubação para alcançar um tumor de tamanho ideal para experimentação pré-clínica. Neste protocolo, o 5-ALA foi utilizado como sonosensibilizador devido à sua captação preferencial em tumores de GBM, o que foi confirmado in vitro para esta linhagem celular em experimentos anteriores (dados não publicados). Outros sonosensibilizadores podem ser substituídos e testados para determinar o composto mais adequado para eficácia e segurança. Finalmente, o tratamento foi iniciado 3 h após a injeção de 5-ALA, pois a literatura prévia mostrou que este é o momento ideal com essa dose de injeção⁵.

Os parâmetros do USF escolhidos nesse protocolo (10 W/^cm2 por 2 min a 515 kHz em cada local alvo) foram decididos com base em revisão da literatura prévia e experimentos^iniciais4,9. Uma grade de pontos de sonicação cobrindo todo o tumor foi escolhida para gerar o efeito ROS em todo o tumor. A intensidade utilizada aqui é maior do que outras publicações, mas, em um curto espaço de tempo, não se espera que isso leve a efeitos adversos relacionados à temperatura, uma vez que intensidades de até 25 W/^cm2 têm sido usadas com sucesso em um modelo de camundongo sem efeitos colaterais significativos¹¹. É importante ressaltar que nenhum conjunto padronizado ou otimizado de parâmetros do USF foi publicado na literatura. Portanto, os valores específicos que são relatados aqui podem ser ajustados para determinar o conjunto ótimo de parâmetros, levando à redução máxima do tecido tumoral, mantendo a segurança. Além disso, como diferentes linhagens celulares têm diferentes níveis de vascularização e hipóxia, esse tratamento pode precisar ser ajustado. Demonstramos uma diminuição geral do crescimento tumoral (Figura 5) dentro de 24 h após o tratamento com TSF, embora os parâmetros precisem ser otimizados e mais animais precisem ser testados para determinar o efeito máximo desse tratamento. A RM pós-tratamento não mostra aparecimento de lesões criadas pelo tratamento com USF em tecido normal, com efeito localizado no tecido tumoral (Figura 6). Há também a oportunidade de combinar a TFS com outras técnicas de USF, como a permeabilização transitória da barreira hematoencefálica, para maximizar a captação de 5-ALA no^tumor12. Este protocolo pode ser complementado com a realização de várias técnicas histológicas para verificar a segurança e eficácia a nível estrutural. Uma coloração de hematoxilina e eosina (H&E) pode ser realizada para verificar danos estruturais ou tumorais¹³, enquanto uma coloração terminal de desoxinucleotidiltransferase dUTP nick end (TUNEL) pode ser realizada para verificar apoptose celular¹⁴. Independentemente disso, este protocolo apresenta um tratamento seguro e específico para o tumor, onde as alterações são perceptíveis mesmo 24 h após o tratamento, o que é aparente comparando-se a taxa de crescimento de tumores tratados com SDT e tumores não tratados, bem como comparando-se cortes tumorais antes e após a sonicação.

Com qualquer protocolo, sempre há desvantagens ou limitações que precisam ser ponderadas. A principal limitação do protocolo atual é o tempo e o custo. Enquanto isso, uma das vantagens desse protocolo é sua mira focada automatizada. Para realizar esse procedimento focado, exames de ressonância magnética precisam ser feitos para cada animal individualmente para garantir que o alvo do tumor esteja correto, um processo que pode ser demorado e caro. Além disso, dependendo do número de pontos focais desejados, o tempo para a realização deste protocolo pode ser de horas para apenas alguns animais, resultando em baixo número de animais experimentais. Apesar dessas desvantagens, este protocolo não invasivo direcionado continua sendo uma preferência viável quando comparado às opções de cirurgia aberta.

Em conclusão, este protocolo mostrou a capacidade do tratamento com SDT de diminuir o crescimento tumoral no cérebro dentro de 24 h de tratamento, mantendo o tecido neural saudável em um modelo pré-clínico de camundongo. Estudos sobre a efetividade da TPF e otimização dos diversos parâmetros para aumentar a produção de ERO são necessários para tornar esse tratamento clinicamente adequado. Novos caminhos devem ser explorados para o uso da TSF como modelo terapêutico não invasivo.

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses. Amir Manbachi leciona e presta consultoria para a BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical e é inventor de várias tecnologias FUS com patente pendente. Betty Tyler tem financiamento de pesquisa do NIH e é coproprietária da Accelerating Combination Therapies*. também licenciou uma de suas patentes, e ela é acionista da Peabody Pharmaceuticals (*inclui ações ou opções).

Os autores agradecem o apoio financeiro do National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), do ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) e do Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR's) Clinical Research Scholars Program (KL2), administrado pelo National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). As células foram compradas e fornecidas pela Mayo Foundation for Medical Education and Research.