Terapia sonodinamica per il trattamento del glioblastoma multiforme in un modello murino utilizzando un sistema portatile ad ultrasuoni focalizzato da banco

Sono necessarie nuove opzioni terapeutiche ed efficaci per i pazienti con GBM. Questo protocollo ha delineato un trattamento preclinico mediato da FUS per il GBM che è attualmente in fase di indagine approfondita per la traduzione clinica. Sebbene la SDT abbia un potenziale entusiasmante, c'è ancora molto da capire e ottimizzare in ambito preclinico.

Uno dei componenti più importanti di questo protocollo è l'utilizzo di FUS guidato da risonanza magnetica per colpire il tumore per la massima efficacia. Utilizzando un fantoccio, è possibile creare uno spazio di coordinate 3D, in cui a ogni pixel delle sezioni assiali di risonanza magnetica può essere assegnata una coordinata. Quindi, una semplice procedura di selezione della posizione di sonicazione sull'immagine RM informa il trasduttore su dove puntare. Il sistema FUS preclinico utilizzato è altamente versatile e applicabile quando è necessario mirare a sedi di patologia specifica come un tumore, compresi i tumori a sede più profonda che sarebbero difficili da colpire senza la conferma dell'imaging. Utilizzando il gadolinio come agente di contrasto, c'è una chiara visualizzazione del tumore, consentendo all'utente di prendere decisioni informate nella scelta dei bersagli. Il vantaggio che la SDT ha rispetto a molti altri trattamenti è che si tratta di una terapia specifica per il tumore. La FUS a bassa intensità dovrebbe colpire solo il tessuto tumorale, lasciando relativamente intatto il parenchima cerebrale sano ^3,8.

I risultati di questo esperimento evidenziano come i vantaggi di questo protocollo possano portare a risultati terapeutici simili ad altri risultati in letteratura per la SDT. La Figura 5 mostra che entro 24 ore dal giorno del trattamento, c'è stato un rallentamento della crescita del tumore nella coorte trattata. Sebbene insignificante utilizzando questa piccola dimensione del campione, la significatività potrebbe risultare con un numero maggiore di animali. Questo ritardo nella crescita del tumore è simile a quello mostrato nell'articolo pionieristico su questo argomento di Wu et al. (2019), che ha mostrato una crescita del tumore rallentata nel tempo negli animali trattati, nonché un aumento dei tempi di sopravvivenza⁹.

Le considerazioni che sono state fatte durante la progettazione di questo protocollo includevano il ceppo animale, il tipo di tumore e la selezione dell'agente sonosensibilizzante. I topi nudi atimici sono stati scelti per questo protocollo per diversi motivi. Innanzitutto, il topo nudo è più facile da sonicare poiché la mancanza di peli impedisce qualsiasi attenuazione. Inoltre, la mancanza di un sistema immunitario consente l'impianto di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) in modo che il modello tumorale assomigli più da vicino alla situazione clinica. Lo svantaggio dell'utilizzo di un modello atimico è che il sistema immunitario non può essere caratterizzato, quindi qualsiasi risposta immunitaria generata da SDT non sarà misurata in questi studi¹⁰. La linea tumorale scelta è una linea PDX aggressiva e in rapida crescita. Il momento del trattamento è molto importante perché l'instaurazione del tumore deve essere verificata, ma il carico tumorale non deve riempire l'emisfero cranico. Diverse linee cellulari richiedono tempi di incubazione diversi per ottenere un tumore di dimensioni ottimali per la sperimentazione preclinica. In questo protocollo, il 5-ALA è stato utilizzato come sonosensibilizzante a causa del suo assorbimento preferenziale nei tumori del GBM, che è stato confermato in vitro per questa linea cellulare in esperimenti precedenti (dati non pubblicati). Altri sonosensibilizzanti possono essere sostituiti e testati per determinare il composto più adatto per efficacia e sicurezza. Infine, il trattamento è stato iniziato 3 ore dopo l'iniezione di 5-ALA, poiché la letteratura precedente ha dimostrato che questo è il momento ottimale con quel dosaggio di iniezione⁵.

I parametri FUS scelti in questo protocollo (10 W/cm 2 per² min a 515 kHz in ogni posizione target) sono stati decisi sulla base di una revisione della letteratura precedente e di esperimenti iniziali ^4,9. È stata scelta una griglia di punti di sonicazione che copre l'intero tumore per generare l'effetto ROS in tutto il tumore. L'intensità utilizzata qui è superiore a quella di altre pubblicazioni, ma in un breve lasso di tempo, non si prevede che ciò porti ad effetti negativi legati alla temperatura, poiché intensità fino a 25 W/cm² sono state utilizzate con successo in un modello murino senza effetti collaterali significativi¹¹. È importante sottolineare che in letteratura non è stato pubblicato alcun set standardizzato o ottimizzato di parametri FUS. Pertanto, i valori specifici qui riportati possono essere regolati per determinare l'insieme ottimale di parametri, portando alla massima riduzione del tessuto tumorale mantenendo la sicurezza. Inoltre, poiché diverse linee cellulari hanno diversi livelli di vascolarizzazione e ipossia, potrebbe essere necessario modificare questo trattamento. Abbiamo mostrato una diminuzione complessiva della crescita tumorale (Figura 5) entro 24 ore dal trattamento con SDT, anche se i parametri devono essere ottimizzati e più animali devono essere testati per determinare l'effetto massimo di questo trattamento. Le scansioni MRI post-trattamento non mostrano la comparsa di lesioni create dal trattamento con FUS nel tessuto sano, con l'effetto localizzato al tessuto tumorale (Figura 6). C'è anche l'opportunità di combinare la SDT con altre tecniche FUS, come la permeabilizzazione transitoria della barriera emato-encefalica, per massimizzare l'assorbimento di 5-ALA nel tumore¹². Questo protocollo può essere ulteriormente integrato eseguendo varie tecniche istologiche per verificarne la sicurezza e l'efficacia a livello strutturale. Una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) può essere eseguita per verificare la presenza di danni strutturali o tumorali¹³, mentre una colorazione terminale con deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labeling (TUNEL) può essere eseguita per verificare l'apoptosi cellulare¹⁴. Indipendentemente da ciò, questo protocollo presenta un trattamento sicuro e specifico per il tumore in cui i cambiamenti sono evidenti anche 24 ore dopo il trattamento, il che è evidente confrontando il tasso di crescita dei tumori trattati con SDT e dei tumori non trattati, nonché confrontando le fette tumorali prima e dopo la sonicazione.

Con qualsiasi protocollo, ci sono sempre svantaggi o limitazioni che devono essere soppesati. Il limite principale dell'attuale protocollo è il tempo e i costi. Nel frattempo, uno dei vantaggi di questo protocollo è la sua mira focalizzata automatizzata. Per realizzare questa procedura mirata, è necessario eseguire scansioni MRI per ogni singolo animale per garantire che il targeting del tumore sia corretto, un processo che può richiedere tempo e denaro. Inoltre, a seconda del numero di punti focali desiderati, la quantità di tempo per eseguire questo protocollo potrebbe essere di ore anche per pochi animali, con conseguente basso numero di animali sperimentali. Nonostante questi inconvenienti, questo protocollo mirato non invasivo rimane una preferenza fattibile rispetto alle opzioni di chirurgia aperta.

In conclusione, questo protocollo ha mostrato la capacità del trattamento SDT di ridurre la crescita del tumore nel cervello entro 24 ore dal trattamento, mantenendo il tessuto neurale sano in un modello murino preclinico. Gli studi sull'efficacia della SDT e l'ottimizzazione dei vari parametri per aumentare la produzione di ROS sono necessari per rendere questo trattamento clinicamente idoneo. Dovrebbero essere esplorate nuove strade per l'uso della SDT come modello terapeutico non invasivo.

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi. Amir Manbachi insegna e fa consulenza per BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical ed è inventore di una serie di tecnologie FUS in attesa di brevetto. Betty Tyler ha ricevuto finanziamenti per la ricerca dal NIH ed è co-proprietaria di Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. ha anche concesso in licenza uno dei suoi brevetti ed è azionista di Peabody Pharmaceuticals (*include azioni o opzioni).

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), dell'ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) e del Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR's) Clinical Research Scholars Program (KL2), amministrato dal National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Le cellule sono state acquistate e fornite dalla Mayo Foundation for Medical Education and Research.