循环死亡 （DCD） 肝脏循环死亡 （DCD） 后通过灌注和原位肝移植保存猪捐献

摘要

该协议概述了利用可变温度控制机器灌注 （MP） 建立猪模型以保存供体肝脏的方法，然后进行原位肝移植 （OLTx）。旨在提高循环死亡 （DCD） 肝脏后使用供体捐献的 OLTx 成功率，并建立稳定的模型。

摘要

传统的静态冷藏 （SCS） 加剧了 DCD 肝脏的缺血性损伤，导致移植受者出现严重的并发症。为了解决这个问题，MP 技术在供体肝脏保存方面的临床应用正在进行中。同时，工作重点是开发各种 MP 仪器，并通过相关的动物模型实验进行验证。有效的大型动物试验在临床应用中起着关键作用。然而，DCD 肝脏的 离体 保存和猪移植程序的挑战仍然存在。这些障碍包括解决供体肝脏的长期保存问题、进行活力测试、减轻缺血性损伤和缩短肝末期。使用可变温度控制的 MP 设备有助于通过顺序双低温氧合机灌注 （DHOPE） 和正常机灌注 （NMP） 模式延长 DCD 肝脏的保存。该方案通过提高 DCD 肝脏的质量、优化吻合技术和减少肝末期的持续时间来增强猪 OLTx 模型。

引言

肝移植仍然是终末期肝病和特定肝癌的唯一治愈性治疗方法。尽管在采购、保存、手术技术和移植后免疫抑制方面取得了重大进展，但由于缺乏合适的供体器官，等待名单上的患者死亡率仍然存在显着。主要挑战在于保存从 DCD 获得的肝脏，因为这些器官需要专门的护理来减轻缺血性损伤¹。 离体 肝机灌注提供了一种独特的方法，可以在移植前保存和评估 DCD 肝移植物²。临床试验强调了采用低温或常温条件的标准和扩展标准供体对标准和扩展标准供体进行 离体 肝机灌注的可行性和安全性³。重要的是， 离体肝 机灌注期间的治疗干预已显示出减少缺血再灌注损伤 （IRI） 的前景⁴。

为了延长保存时间和提高 DCD 肝移植物的质量，正在进行的动物实验旨在优化 MP 设备的性能并改进离体肝脏保存的方法⁵。猪 OLTx 是临床导向研究的最佳模型，验证了 MP 的防腐剂质量。然而，猪 OLTx 肝期供体的缺血性损伤、血流动力学不稳定和肠道充血共同影响猪模型的存活率 ^6,7。

在以下方案中，使用集成 NMP 和 DHOPE 模式的可变温度控制 MP 装置来保存猪的 DCD 肝脏。与传统 SCS 相比，该装置有助于延长 DCD 肝脏的 离体 保存并减轻供体肝脏的缺血性损伤。该仪器可确保温度调节，支持长距离运输，并提供仿生灌注以及对供体质量的动态和准确评估。该方案包含利用顺序 DHOPE-NMP 模式和猪 OLTx 的 DCD 肝脏保存稳定模型的所有信息，包括灌注设置的过渡、优化吻合技术和肝末期的程序。

研究方案

所有动物实验均按照《实验动物管理条例》（中华人民共和国科学技术部，2017 年）进行。使用巴马雌性微型猪 （40-45 kg）。该研究方案得到了中国人民解放军南方战区总医院机构动物护理和使用委员会的批准。移植前将猪饲养在研究设施中 1 周，然后在实验前 12 小时禁食但可以自由饮水。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 获得捐赠者

1. 麻醉和镇痛的诱导:以 0.02 mg/kg 的剂量肌肉注射阿托品。随后，在 2-3.5 mg/kg 范围内肌肉注射 Zoletil 50 以诱导镇静。对于镇痛，以 2 mg/kg 的剂量静脉内施用盐酸曲马多。
2. 使用插入外缘耳静脉的 24 G 蝶形套管，以 2-3 mg/kg/h 的速度静脉输注异丙酚，诱导全身麻醉。
3. 将猪仰卧在手术台上。进行气管插管和机械通气。 通过 放置在尾部的脉搏血氧仪对心率和血氧饱和度进行持续监测。将蒸发器中异氟醚的浓度设置为 2%。
4. 涂抹 3% 碘溶液对该区域的皮肤进行消毒。让碘溶液自然风干后，用 70% 酒精擦去。重复消毒过程 3 次。
5. 进行了中线剖腹手术，横向向右延伸。将肝脏从韧带附着物中释放出来，隔离胆管，并在结扎后切断十二指肠附近。
6. 仔细从周围组织中解剖肝动脉 （HA） 和门静脉 （PV）。动员腹腔轴并追踪到腹主动脉。
7. 解剖腹主动脉 （AA） 和下腔静脉 （IVC） 以促进血液采集。静脉推注肝素钠 （25,000 U） 进行抗凝治疗。
8. 依次插管 AA 和 IVC，并将血液收集到酸柠檬酸盐葡萄糖袋中，用于后续用于 NMP（约 1800-2000 mL）。用特定的导管安装 PV。将收集的血液储存在 4 °C 的温度下。
9. 通过心内输注氯化钾 （20 mEq） 诱导心脏骤停。
   注意:从心脏骤停开始的时间间隔记录为热缺血时间 （WIT）。肝脏经过 30 分钟的 WIT 而不进行任何操作，然后用 2 L 冷高渗柠檬酸盐腺嘌呤溶液原 位 冲洗腹主动脉 （AA） 和门静脉 （PV）。
10. 切除肝脏，确保所有剩余的血管都很长。保留一段腹主动脉组织用于动脉插管。用特定的导管安装 PV。
11. 将肝脏放入冰上的无菌器官袋中。结扎肝脏的所有远端动脉分支并插管胆总管。

2. 使用 DHOPE 模式启动

1. 将门静脉导管和腹主动脉连接到 MP 装置。用 1.5 L 威斯康星大学机器灌注液（UW-MPS，见 材料表）灌注肝脏，富含肝素钠 （6250 U） 和头孢西丁钠 （1 g）。
2. 设置灌注参数，使 HA 在压力控制下保持在 25 mmHg，而 PV 在 200 mL/min 的流量控制下。以 1 L/min 的速率连续将 100% 氧气泵入灌注液中，确保氧饱和度。
   注:该系统在整个灌注过程中自动监测和记录关键参数，例如灌注液温度、HA 和 PV 压力以及流速。
3. 将灌注模式设置为 4°C 的温度。灌注肝移植物 8 小时（图 1）。

3. NMP 模式灌注

1. 将机器灌注装置过渡到 NMP 模式。将系统温度升高到 37 °C。 用 2 L 由全血和机器灌注液组成的混合物灌注机器。
2. 在 4 °C 下用 1.5 L 生理盐水冲洗供体，然后放入装有冰的碗中。更换灌注液并为 NMP 模式灌注同一台机器。加热阶段完成 10 分钟后，将肝脏转移到设备中（图 1）。
3. 在肝脏放置之前，建立流向门静脉和肝动脉的恒定氧气流量。将吸入氧 （FiO2） 的分数保持在 60%。
4. 将动脉灌注压设置为 80/60 mmHg（收缩压/舒张压）。将门静脉灌注设置为 0.5 mL/min/g（肝脏重量）的恒定流量，然后在第一个小时后将其增加到 0.75 mL/min/g（肝脏重量）。
5. 在 NMP 的整个 6 小时内，始终如一地监测压力、流速和温度等参数。 通过 每隔 1 小时对灌注液进行生化评估进行活力测试，包括血气分析、乳酸、血糖和肝功能。

4. 受者肝切除术

1. 向受体猪肌肉注射 Zoletil 50 （2-3.5 mg/kg） 和阿托品 （0.02 mg/kg）。静脉注射盐酸曲马多 （2 mg/kg） 用于疼痛管理。
2. 通过静脉输注异丙酚 （2-3 mg/kg/h） 诱导全身麻醉。然后将猪仰卧在配备加热垫的手术台上。异氟醚蒸发器设置为 2%。
3. 进行中线剖腹手术，向右横向延伸。用无菌毛巾盖住大肠和小肠。便于放置腹部牵开器，以获得完全可见。
4. 将肝脏从韧带附着物中解放出来。隔离胆管、结扎和切断。逆行解剖肝动脉直至胃十二指肠动脉的分裂。使用 Bulldog 夹将肝总动脉夹在胃十二指肠动脉的近端。从粘附组织中释放门静脉 （PV） 并将其夹在远端。
5. 夹住腔静脉的上侧，然后在隔膜侧解剖腔静脉的上部，保留一些肝内腔静脉组织用于后续缝合。腔静脉的下部也进行了类似的处理，保留了腔静脉上的一些肝组织。切除肝脏。
6. 通过静脉注射 500 mg 剂量的甲泼尼龙进行免疫抑制。

5. 原位移植物放置和血管吻合术

1. 从机器灌注装置中取出供体肝脏。用特定的导管安装 PV，然后在 4 °C 下从 PV 导管灌注冷盐水。在 4 °C 下从 PV 导管灌注 5% 白蛋白和冷盐水。这个过程对于排血和肝脏冷却至关重要。
2. 将专用导管插入门静脉并通过结扎固定，然后再切除受者的原始肝脏，从而能够连接到供体 PV 上的匹配导管。同时，夹住供体移植物的下腔静脉（图 2B）。
3. 使用双臂 4-0 单丝聚丙烯缝合线对肝上腔静脉进行端到端吻合术。
4. 用匹配的插管连接门静脉的两端以恢复血流。插入前将肝素盐水冲洗到套管中。门静脉的间歇性开放和下腔静脉的暂时松解有助于残余灌注液的冲洗。
5. 从肝上腔中取出夹子，并用 4-0 单丝聚丙烯缝合线对下腔静脉进行端对端吻合。
6. 用 10 mL 肝素盐水冲洗供体肝动脉，并在远端放置一个额外的 bulldog 夹以防止背出血。使用 7-0 单丝聚丙烯缝合线进行端到端吻合术。
7. 将导管插入供体和受体端的胆道中，用导管牢固缝合以确保位置稳定。
8. 取出门静脉导管。使用 4-0 单丝聚丙烯缝合线对门静脉进行端到端吻合。

6. 移植后护理和监测

1. 将受体猪的通风再保持 2 小时。
2. 打开重症监护病房的空调，提高室内温度。使用加热垫为猪保暖。
3. 定期采集血样，以每隔 24 小时检测血气和肝肾功能。
4. 用肝素盐水密封留置针头。必须妥善管理猪耳静脉的留置针头，以免在猪移动后脱落。
5. 一旦猪能够完全呼吸，就终止通风。
6. 将受体猪放回猪舍，将其放在约 10 厘米高的木床上，直到从麻醉中醒来。木床底部垫有毛巾，以防止尿液在动物身体周围积聚，并通过猪圈内的 24 小时加热器保持温度。
7. 从 POD 1 以 250 mg 的初始剂量注射甲泼尼龙，然后逐渐减少剂量以进行免疫抑制。
8. 在 POD 1 上静脉注射止痛药（丁丙诺啡 0.01-0.05 mg/kg）。肌肉注射曲马多 POD2-POD5 （每 12 小时 100 mg/kg）。从 POD 2 开始每天两次口服头孢菌素 （2 mg/kg），并添加营养液。饮水不受限制。
9. 手术后约 5 天切除静脉通道。
10. 观察尿量和尿液颜色。观察手术后粪便的颜色变化。
11. 如果猪患有持续性酸中毒、低血糖、出血或肝功能衰竭的迹象，请处死猪。
12. 在 OLTx 后 5 天通过在深度异氟醚麻醉 （5%，>2.5 MAC） 下放血进行安乐死。

7. SCS 控制猪模型技术

1. 采用与上述相同的麻醉程序。使用相同的肝素化方法解剖腹主动脉 （AA） 和下腔静脉 （IVC） 以帮助血液引流。依次插管 AA 和 IVC。通过心内输注氯化钾 （20 mEq） 快速诱导心脏骤停。
2. WIT 30 分钟后立即获得供体肝脏，保留来自近端肝下腔静脉的足够组织。
3. 将肝移植物放入保存袋中，将其浸入威斯康星大学（UW）的冷溶液中，在4°C下保存8小时。
4. 将肝脏在 NMP 中于 37 °C 保存 6 小时，同时直接用另一个 froup 进行 OLTx（图 1）。

结果

DCD 肝脏在移植到受体猪之前接受了 DHOPE-NMP 手术作为保护措施。DHOPE-NMP 的程序如下:第一阶段将 WIT 为 30 min 的 DCD 肝脏 （n = 8） 在 DHOPE 中保存 8 h，然后转移到 NMP 模式再保存 6 h。随后，这些移植物用于猪受体的 LT。描述 组和协议的示意图如图 1 所示。移植手术中涉及的主要步骤的示意图如图 2A-D 所?...

讨论

肝脏 MP 目前广泛用于临床试验，但仍然需要使用大型动物模型进行进一步的临床前研究 ^5,6。猪 OLTx 带来了导致成功率低的重大挑战。这些挑战包括供体的热缺血、解剖学变化以及对腔静脉和门静脉长时间夹闭的不耐受 ^7,8。植入阶段仍然是 DCD 供体猪 OLTx 的重大障碍，肠充血、静脉回...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A