Сохранение донорства свиней после смерти печени от кровообращения (DCD) путем перфузии и ортотопической трансплантации печени

Резюме

В этом протоколе изложена методология создания модели свиньи с использованием аппаратной перфузии (МП) с регулируемой температурой для сохранения донорской печени с последующей ортотопической трансплантацией печени (OLTx). Он направлен на повышение уровня успешности OLTx с использованием донорского донорства после смерти от кровообращения (DCD) печени и создание стабильной модели.

Аннотация

Обычное статическое хранение в холоде (SCS) усугубляет ишемическое повреждение печени DCD, что приводит к тяжелым осложнениям для реципиентов трансплантата. Для решения этой проблемы ведется клиническое применение технологии МП для сохранения донорской печени. В то же время усилия сосредоточены на разработке различных инструментов МП, проверенных с помощью соответствующих экспериментов на животных моделях. Эффективные испытания на крупных животных играют ключевую роль в клиническом применении. Тем не менее, сохраняются проблемы с сохранением ex vivo печени DCD и процедурой трансплантации свиней. Эти препятствия включают в себя решение проблемы длительного сохранения донорской печени, проведение тестов на жизнеспособность, облегчение ишемических повреждений и сокращение ангепатической фазы. Использование устройства МП с регулируемой температурой способствует длительному сохранению печени DCD за счет последовательных режимов двойной гипотермической кислородонасыщенной машинной перфузии (DHOPE) и нормотермической машинной перфузии (NMP). Этот протокол улучшает модель OLTx у свиней за счет улучшения качества печени DCD, оптимизации техники анастомоза и сокращения продолжительности ангепатической фазы.

Введение

Трансплантация печени остается единственным методом лечения терминальной стадии заболевания печени и отдельных видов рака печени. Несмотря на значительные достижения в области закупок, сохранения, оперативных методов и посттрансплантационной иммуносупрессии, сохраняется заметный уровень смертности среди пациентов, находящихся в листе ожидания, из-за нехватки подходящих донорских органов. Основная проблема заключается в сохранении печени, полученной в результате DCD, поскольку эти органы требуют специализированной помощи для смягчения ишемических повреждений¹. Аппаратная перфузия печени ex vivo предлагает уникальный метод как для сохранения, так и для оценки трансплантатов печени DCD перед трансплантацией². Клинические испытания подчеркнули целесообразность и безопасность аппаратной перфузии печени ex vivo для доноров как со стандартными, так и с расширенными критериями, используя либо гипотермические, либо нормотермические условия³. Важно отметить, что терапевтические вмешательства во время аппаратной перфузии печени ex vivo показали многообещающие результаты в снижении ишемии-реперфузионного повреждения (ИРИ)⁴.

В целях продления срока хранения и повышения качества трансплантатов печени DCD, проводимые эксперименты на животных направлены на оптимизацию производительности устройств МП и совершенствование метода сохранения печени ex vivo ⁵. Porcine OLTx служит оптимальной моделью для клинически ориентированных исследований, подтверждающих качество консервантов МП. Тем не менее, ишемическое повреждение донора, гемодинамическая нестабильность и кишечный застой во время ангепатической фазы свиного OLTx в совокупности влияют на выживаемость свиной модели ^6,7.

Устройство MP с переменной температурой, которое интегрирует режимы NMP и DHOPE, было использовано для сохранения печени DCD свиньи в соответствии с последующим протоколом. Это устройство способствует пролонгированному ex vivo сохранению печени DCD и облегчает ишемическое повреждение донорской печени по сравнению с традиционными SCS. Аппарат обеспечивает регулирование температуры, поддерживает транспортировку на большие расстояния и обеспечивает бионическую перфузию наряду с динамической и точной оценкой качества донора. Протокол содержит всю информацию для стабильной модели сохранения печени DCD с использованием последовательного режима DHOPE-NMP с последующим OLTx свиней, включая переход настроек перфузии, оптимизацию техники анастомоза и процедуру ангепатической фазы.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Постановлением об управлении экспериментальными животными (Министерство науки и технологий Китайской Народной Республики, 2017 г.). Использовались самки миниатюрных свиней Bama (40-45 кг). Протокол исследования был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Главного госпиталя Южного командования театра военных действий НОАК, Китай. Свиньи содержались в исследовательском центре в течение 1 недели до трансплантации, а затем голодали, но со свободным доступом к воде в течение 12 ч до эксперимента. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Привлечение доноров

1. Индукция анестезии и обезболивания: Ввести атропин внутримышечно в дозировке 0,02 мг/кг. Затем вводят Золетил 50 внутримышечно в диапазоне 2-3,5 мг/кг для индуцирования седативного эффекта. Для обезболивания следует ввести Трамадола гидрохлорид внутривенно в дозе 2 мг/кг.
2. Вызвать общую анестезию путем внутривенного вливания пропофола в дозе 2-3 мг/кг/ч с помощью канюли-бабочки 24 G, вставленной во внешнюю краевую ушную вену.
3. Расположите свинью лежа на хирургическом столе. Проводят эндотрахеальную интубацию и искусственную вентиляцию легких. Непрерывный мониторинг частоты сердечных сокращений и сатурации кислорода осуществляется с помощью пульсоксиметрии, помещенной на хвост. Установите концентрацию изофлурана в вапорайзере на уровне 2%.
4. Нанесите 3% раствор йода для дезинфекции кожи в этой области. Дав раствору йода высохнуть на воздухе естественным путем, сотрите его 70% спиртом. Повторите процесс дезинфекции три раза.
5. Выполнена лапаротомия по средней линии, расширенная латерально вправо. Освободите печень от связочных прикреплений, изолируйте желчный проток и разрежьте рядом с двенадцатиперстной кишкой после перевязки.
6. Осторожно рассеките печеночную артерию (ГК) и воротную вену (ВП) от окружающих тканей. Мобилизуйте чревную ось и проведите к брюшной аорте.
7. Рассеките брюшную аорту (АА) и нижнюю полую вену (НПВ) для облегчения сбора крови. Введение внутривенного болюса гепарина натрия (25 000 ЕД) для антикоагулянтной терапии.
8. Канюлировать АА и НПВ последовательно и собрать кровь в кислотно-цитратные мешочки с декстрозой для последующего использования при НМП (примерно 1800-2000 мл). Установите на ЛВ специальный катетер. Собранную кровь хранить при температуре 4 °C.
9. Вызвать остановку сердца путем внутрисердечной инфузии хлорида калия (20 мг-экв).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Временной интервал, начинающийся с остановки сердца, записывается как время теплой ишемии (WIT). Печень подвергается 30-минутной ВИТ без каких-либо манипуляций с последующей промывкой in situ через брюшную аорту (АА) и воротную вену (ПВ) 2 л холодного раствора гипертонического цитрата аденина.
10. Удалите печень, убедившись, что все остальные сосуды длинные. Сохраните участок ткани брюшной аорты для канюляции артерий. Установите на ЛВ специальный катетер.
11. Поместите печень в стерильный мешок для органов на льду. Перевязывают все дистальные артериальные ветви печени и канюлируют общий желчный проток.

2. Инициация в режиме DHOPE

1. Подключите катетер воротной вены и брюшной аорты к аппарату МП. Перфузируют печень 1,5 л раствора для машинной перфузии Висконсинского университета (UW-MPS, см. Таблицу материалов), обогащенного гепарином натрия (6250 ЕД) и цефокситином натрия (1 г).
2. Установите параметры перфузии, чтобы ГК поддерживалась под давлением на уровне 25 мм рт.ст., а ФВ под контролем расхода на уровне 200 мл/мин. Обеспечьте насыщение кислородом путем непрерывной закачки 100% кислорода в перфузат со скоростью 1 л/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система автономно контролирует и регистрирует ключевые параметры, такие как температура перфузата, давление HA и PV, а также скорость потока на протяжении всего процесса перфузии.
3. Установите режим перфузии при температуре 4°С. Перфузируйте печеночный трансплантат в течение 8 ч (рис. 1).

3. Перфузия в режиме NMP

1. Переведите аппаратное перфузионное устройство в режим NMP. Поднимите температуру системы до 37 °C. Заправьте аппарат 2 л смесью, состоящей из цельной крови и перфузата аппаратной перфузии.
2. Промойте донора 1,5 л обычного физиологического раствора при температуре 4 °C и поместите в миску со льдом. Замените перфузионную жидкость и заправьте ту же машину для режима NMP. Перенесите печень в устройство после завершения фазы нагрева в течение 10 минут (Рисунок 1).
3. Обеспечьте постоянный приток кислорода к воротной вене и печеночной артерии перед установкой печени. Поддерживайте долю вдыхаемого кислорода (FiO2) на уровне 60%.
4. Установите артериальное перфузионное давление на уровне 80/60 мм рт.ст. (систолическое давление/диастолическое давление). Установите перфузию воротной вены на постоянный поток 0,5 мл/мин/г (масса печени), впоследствии увеличивая его до 0,75 мл/мин/г (масса печени) после первого часа.
5. В течение 6 часов NMP постоянно контролируйте такие параметры, как давление, расход и температура. Проведите тест на жизнеспособность с помощью биохимической оценки перфузата с интервалом в 1 час, включая анализ газов крови, молочной кислоты, уровня глюкозы в крови и функции печени.

4. Реципиентная гепатэктомия

1. Введите Золетил 50 (2-3,5 мг/кг) и атропин (0,02 мг/кг) внутримышечно свинье-реципиенту. Введите внутривенно дозу трамадола гидрохлорида (2 мг/кг) для облегчения боли.
2. Вызвать общую анестезию путем внутривенной инфузии пропофола (2-3 мг/кг/ч). Затем свинью ориентируют в лежачем положении на хирургическом столе, оборудованном нагревательным ковриком. Испаритель изофлурана установлен на 2%.
3. Выполните лапаротомию по средней линии, расширенную латерально вправо. Накройте толстый и тонкий кишечник стерильным полотенцем. Облегчите размещение брюшного ретрактора для полной видимости.
4. Освободите печень от связочных прикреплений. Изолируют желчный проток, перевязывают и разрывают. Рассекайте печеночную артерию ретроградно вплоть до отделения гастродуоденальной артерии. Зажмите общую печеночную артерию проксимально к гастродуоденальной артерии с помощью бульдожьего зажима. Освободите воротную вену (ПВ) от прилегающей ткани и зажмите ее с дистальной стороны.
5. Зажмите верхнюю сторону полой вены, с последующим рассечением верхней части полой вены со стороны диафрагмы, оставив некоторое количество ткани внутрипеченочной полой вены для последующего наложения швов. Нижняя часть полой вены лечится аналогичным образом, сохраняя некоторую ткань печени на полой вене. Удалите печень.
6. Выполните иммуносупрессию путем внутривенного введения 500 мг метилпреднизолона.

5. Установка ортотопического трансплантата и сосудистый анастомоз

1. Извлеките донорскую печень из аппаратного перфузионного аппарата. Установите на ЛВ специальный катетер, а затем проткните его холодным физиологическим раствором при температуре 4 °C из ФВ-катетера. Перфузируйте 5% альбумином в сочетании с холодным физиологическим раствором при 4 °C из PV-катетера. Этот процесс имеет решающее значение для выведения крови и охлаждения печени.
2. Вставьте специализированный катетер в воротную вену и закрепите его с помощью лигирования перед удалением исходной печени реципиента, что обеспечит возможность подключения к соответствующему катетеру на донорском ПВ. Одновременно пережмите нижнюю полую вену донорского трансплантата (Рисунок 2B).
3. Выполните сквозной анастомоз надпеченочной полости с помощью двусторонних монофиламентных полипропиленовых швов 4-0.
4. Соедините оба конца воротной вены соответствующими канюлями для восстановления кровотока. Перед введением в канюлю вводится гепариновый раствор. Прерывистое открытие воротной вены и временное разжатие нижней полой вены способствуют промывке остаточной перфузионной жидкости.
5. Снимите зажим с надпеченочной полости и выполните анастомоз нижней полой вены с наложением монофиламентных полипропиленовых швов 4-0.
6. Промойте донорскую печеночную артерию 10 мл гепаринизированного физиологического раствора и установите дополнительный бульдожий зажим дистально, чтобы предотвратить обратное кровотечение. Выполните сквозной анастомоз с помощью монофиламентного полипропиленового шва 7-0.
7. Вставьте катетер в желчевыводящие пути как на донорском, так и на реципиентном концах, при этом катетеры будут надежно зашиты для обеспечения стабильности позиции.
8. Извлеките катетер воротной вены. Выполните сквозной анастомоз воротной вены с помощью монофиламентного полипропиленового шва 4-0.

6. Посттрансплантационный уход и мониторинг

1. Поддерживайте вентиляцию свиньи-реципиента еще 2 ч.
2. Включите кондиционер в отделении интенсивной терапии, чтобы повысить температуру в помещении. Для согревания свиньи используется грелка.
3. Регулярно собирайте образцы крови для проверки газов крови и функции печени и почек с интервалом в 24 часа.
4. Запечатайте постоянную иглу гепариновым физиологическим раствором. За внутренней иглой ушной вены свиньи необходимо правильно ухаживать, чтобы избежать отпадения после движения свиньи.
5. Прекратите вентиляцию, как только свинья сможет полноценно дышать.
6. Верните поросенка-реципиента в свинарник и поместите ее в деревянную кровать высотой около 10 см до тех пор, пока она не придет в себя от анестезии. Дно деревянной кровати обтягивается полотенцем, чтобы моча не скапливалась вокруг тела животного, а температура поддерживается 24-часовым обогревателем в свинарнике.
7. Вводите метилпреднизолон в начальной дозе 250 мг из POD 1 с последующим постепенным снижением дозы для иммуносупрессии.
8. Внутривенно вводите обезболивающее средство на POD 1 (бупренорфин 0,01-0,05 мг/кг). Внутримышечно вводите трамадол в дозе POD2-POD5 (100 мг/кг каждые 12 ч). Принимайте пероральную дозу цефалоспорина (2 мг/кг) два раза в день из POD 2 и добавляйте питательные жидкости. Потребление воды не ограничено.
9. Удалите венозное русло примерно через 5 дней после операции.
10. Следите за объемом и цветом мочи. Наблюдайте за изменением цвета стула после операции.
11. Жертвуйте свиней, если они страдают от стойкого ацидоза, гипогликемии, признаков кровоизлияния или печеночной недостаточности.
12. Эвтаназию проводят через 5 суток после ОЛТх методом обескровливания под глубокой изофлурановой анестезией (5%, >2,5 ПДК).

7. Методика управления СКС моделью свиньи

1. Используйте для анестезии те же процедуры, что и выше. Рассеките брюшную аорту (АА) и нижнюю полую вену (НПВ) для улучшения дренажа крови, используя тот же метод гепаринизации. Последовательно канюлируйте АА и НПВ. Быстро вызывает остановку сердца путем внутрисердечной инфузии хлорида калия (20 мг-экв).
2. Получить донорскую печень сразу после 30 минут ВИТ, сохранив адекватную ткань из проксимального отдела нижней полой вены печени.
3. Поместите печеночный трансплантат в пакет для консервации и погрузите его в холодный раствор Висконсинского университета (UW) для консервации при температуре 4 °C на 8 часов.
4. Законсервируйте печень в NMP при температуре 37 °C в течение 6 ч, одновременно выполняя OLTx непосредственно с другим фрупом (рис. 1).

Результаты

Печень DCD подвергалась процедуре DHOPE-NMP в качестве защитной меры перед трансплантацией свиньям-реципиентам. Методика DHOPE-NMP заключалась в следующем: печень DCD (n = 8) с 30 min WIT сохраняли в DHOPE в течение 8 ч на первом этапе с последующим переводом в режим NMP еще на 6 ч. Впоследств?...

Обсуждение

МП печени в настоящее время широко используется в клинических испытаниях, но дальнейшие доклинические исследования с использованием крупных животных моделей остаются необходимыми ^5,6. Свиноводство OLTx сопряжено со значительными трудн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A