灌流および同所性肝移植による循環器死(DCD)肝臓後のブタ提供の保存

要約

このプロトコルでは、ドナーの肝臓の保存とそれに続く同所性肝移植 (OLTx) のための可変温度制御機械灌流 (MP) を利用したブタ モデルを確立する方法論を概説しています。循環器死後(DCD)肝臓のドナー提供を用いてOLTxの成功率を促進し、安定モデルを確立することを目指しています。

要約

従来の静的冷蔵(SCS)は、DCD肝臓の虚血性損傷を悪化させ、移植レシピエントに重篤な合併症を引き起こします。この問題を解決するために、ドナーの肝臓保存のためのMP技術の臨床応用が進行中です。同時に、関連する動物モデル実験を通じて検証されたさまざまなMP機器の開発にも力が注がれています。効果的な大動物試験は、臨床応用において極めて重要な役割を果たします。しかし、DCD肝臓の ex vivo 保存とブタへの移植手順には課題が残っています。これらのハードルには、ドナーの肝臓の長期保存、生存率試験の実施、虚血性損傷の緩和、無肝期の短縮などが含まれます。可変温度制御MPデバイスの使用は、連続したデュアル低体温酸素化マシン灌流(DHOPE)およびノーマザーミックマシン灌流(NMP)モードを通じて、DCD肝臓の長期保存を容易にします。このプロトコルは、DCD肝臓の品質を向上させ、吻合技術を最適化し、無肝期の期間を短縮することにより、ブタOLTxモデルを強化します。

概要

肝移植は、末期肝疾患および特定の肝がんに対する唯一の治癒的治療法であり続けています。調達、保存、手術技術、移植後の免疫抑制における著しい進歩にもかかわらず、適切なドナー臓器の不足により、待機リストに載っている患者の間で顕著な死亡率が続いています。主な課題は、DCDから調達した肝臓を保存することにあり、これらの臓器は虚血性損傷を軽減するために専門的なケアを必要とします¹。ex vivo 肝臓機械灌流は、移植前に DCD 肝移植片を保存および評価するための独自の方法を提供します²。臨床試験では、低^{体温または常}温条件のいずれかを採用した標準基準と拡大基準の両方のドナーに対するex vivo肝臓機械灌流の実現可能性と安全性が強調されています3。重要なことに、ex vivo 肝臓機械灌流中の治療的介入は、虚血再灌流障害 (^{IRI) の}軽減に有望であることが示されています4。

DCD肝移植片の保存期間を延長し、品質を向上させるための取り組みとして、現在進行中の動物実験は、MPデバイスの性能を最適化し、ex vivo肝臓保存法を洗練することを目的としています⁵。ブタOLTxは、臨床志向の研究に最適なモデルとして機能し、MPの防腐剤の品質を検証します。しかし、ブタOLTxの無肝期におけるドナーの虚血性損傷、血行動態の不安定性、および腸のうっ血は、ブ^{タモデルの生存}率に総合的に影響を及ぼします^6,7。

NMPモードとDHOPEモードの両方を統合した可変温度制御MPデバイスを使用して、以下のプロトコルでブタのDCD肝臓を保存しました。このデバイスは、従来のSCSと比較して、DCD肝臓の ex vivo 保存を延長し、ドナー肝臓の虚血性損傷を軽減します。この装置は、温度調節を確保し、長距離輸送をサポートし、バイオニック灌流を提供するとともに、ドナーの品質を動的かつ正確に評価します。このプロトコルには、灌流設定の移行、吻合技術の最適化、および無肝相の手順を含む、シーケンシャルDHOPE-NMPモードとそれに続くブタOLTxを利用したDCD肝臓保存の安定したモデルのためのすべての情報が含まれています。

プロトコル

すべての動物実験は、実験動物管理令(中華人民共和国科学技術部、2017年)に従って実施されました。バマの雌のミニチュアブタ(40-45 kg)を使用しました。この研究プロトコルは、中国人民解放軍の南方戦区司令部総合病院の動物施設管理および使用委員会によって承認されました。ブタは移植前の1週間研究施設に収容され、その後絶食されましたが、実験前の12時間は水に自由にアクセスできました。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 寄付者の獲得

1. 麻酔と鎮痛の導入:アトロピンを0.02 mg / kgの投与量で筋肉内投与します。.その後、ゾレチル50を2〜3.5 mg / kgの範囲で筋肉内に投与して鎮静を誘発します。.鎮痛薬には、塩酸トラマドールを2 mg / kgの用量で静脈内投与します。.
2. 外辺縁耳静脈に挿入された24Gのバタフライカニューレを使用して、2〜3 mg / kg / hの速度でプロポフォールを静脈内注入することにより全身麻酔を誘発します。.
3. ブタを仰臥位で手術台に置きます。気管内挿管と人工呼吸器を行います。心拍数と酸素飽和度の継続的なモニタリングは、尾部に配置されたパルスオキシメータ によって 行われます。気化器内のイソフルランの濃度を2%に設定します。
4. 3%ヨウ素溶液を塗布して、その領域の皮膚を消毒します。ヨウ素溶液を自然乾燥させた後、70%アルコールで拭き取ってください。消毒プロセスを3回繰り返します。
5. 正中線開腹術を行い、右側に横方向に伸ばしました。肝臓を靭帯の付着物から解放し、胆管を分離し、結紮後に十二指腸の近くで切断します。
6. 肝動脈(HA)と門脈(PV)を周囲の組織から慎重に解剖します。腹腔軸を動員し、腹部大動脈までトレースします。
7. 腹部大動脈(AA)と下大静脈(IVC)を解剖して、採血を促進します。抗凝固のためにヘパリンナトリウム(25,000 U)の静脈内ボーラスを投与します。.
8. AAとIVCを順番にカニューレし、血液を酸性クエン酸デキストロースバッグに集めて、その後NMP(約1800〜2000mL)に使用します。PVを特定のカテーテルに取り付けます。採取した血液を4°Cの温度で保存します。
9. 塩化カリウム(20 mEq)の心臓内注入により心停止を誘発します。.
   注:心停止から始まる時間間隔は、温虚血時間(WIT)として記録されます。肝臓は、操作なしで 30 分間の WIT を受け、続いて腹部大動脈 (AA) と門脈 (PV) を 2 L の冷たい高張クエン酸アデニン溶液で in situ フラッシングします。
10. 肝臓を切除し、残りのすべての血管が長いことを確認します。動脈カニューレ挿入のために腹部大動脈組織の一部を保存します。PVを特定のカテーテルに取り付けます。
11. 肝臓を氷の上の滅菌臓器バッグに入れます。肝臓のすべての遠位動脈枝を結紮し、総胆管をカニューレ状にします。

2. DHOPEモードでの開始

1. 門脈と腹部大動脈のカテーテルをMPデバイスに接続します。ヘパリンナトリウム(6250 U)とセフォキシチンナトリウム(1 g)が豊富なウィスコンシン大学機械灌流溶液(UW-MPS、 材料表を参照)の1.5 Lで肝臓を灌流します。
2. 灌流パラメータを、HAは25 mmHgの圧力制御下で維持され、PVは200 mL/minの流量制御下で維持されるように設定します。100%の酸素を1 L / minの速度で灌流液に連続的に送り込むことにより、酸素飽和度を確保します。
   注:システムは、灌流プロセス全体を通じて、灌流液の温度、HAおよびPVの圧力、流量などの主要なパラメータを自律的に監視およびログに記録します。
3. 灌流モードを4°Cの温度に設定し、肝臓移植片を8時間灌流します(図1)。

3. NMPモードによる灌流

1. マシン灌流デバイスをNMPモードに移行します。システムの温度を37°Cに上げます。 全血と機械灌流の灌流液からなる混合物の2Lで機械をプライミングします。
2. ドナーを1.5Lの生理食塩水で4°Cで洗い流し、氷を入れたボウルに入れます。灌流液を交換し、同じマシンをNMPモード用にプライミングします。温め段階が10分間完了したら、肝臓をデバイスに移します(図1)。
3. 肝臓を留置する前に、門脈と肝動脈の両方に一定の酸素流量を確立します。吸気酸素(FiO2)の一部を60%に維持します。
4. 動脈灌流圧を80/60 mmHg(収縮期血圧/拡張期血圧)に設定します。門脈灌流を0.5 mL/min/g(肝臓重量)の一定流量に設定し、その後、最初の1時間後に0.75 mL/min/g(肝臓重量)に増やします。
5. NMPの6時間を通して、圧力、流量、温度などのパラメータを一貫して監視します。血液ガス分析、乳酸、血糖値、肝機能など、1時間間隔で灌流液の生化学的評価 により 生存率試験を実施します。

4. レシピエント肝切除術

1. ゾレチル50(2-3.5 mg / kg)とアトロピン(0.02 mg / kg)をレシピエントブタに筋肉内注射します。.痛みの管理のために、塩酸トラマドール(2 mg / kg)の静脈内投与を投与します。.
2. 静脈内プロポフォール注入(2-3 mg / kg / h) を介して 全身麻酔を誘発します。.次に、ブタは、加熱マットを備えた手術台の上で仰臥位に向けられます。イソフルラン気化器は2%に設定されています。
3. 右側に横方向に伸ばして、正中線開腹術を行います。大腸と小腸を滅菌タオルで覆います。腹部リトラクターの配置を容易にし、視界を確保します。
4. 肝臓を靭帯の付着物から解放します。胆管を分離し、結紮し、切断しました。肝動脈を逆行性に解剖し、胃十二指腸動脈の分裂まで行います。ブルドッグクランプを使用して、総肝動脈を胃十二指腸動脈に近位でクランプします。門脈(PV)を付着組織から解放し、遠位側でクランプします。
5. 大静脈の上部をクランプし、続いて大静脈の上部を横隔膜側で解剖し、その後の縫合のために肝内大静脈組織を確保します。大静脈の下部も同様に治療され、大静脈の肝臓組織の一部が保存されます。肝臓を取り除きます。
6. 500 mgのメチルプレドニゾロンを静脈内注射することにより、免疫抑制を行います。.

5. 同所性グラフト留置と血管吻合

1. ドナーの肝臓を機械の灌流装置から取り外します。PVに特定のカテーテルを装着し、その後、PVカテーテルから4°Cの冷食塩水で灌流します。PVカテーテルから4°Cで5%アルブミンと冷生理食塩水を組み合わせて灌流します。このプロセスは、血液の排出と肝臓の冷却に不可欠です。
2. 専用のカテーテルを門脈に挿入し、レシピエントの元の肝臓を切除する前に結紮によって固定することで、ドナーPV上の一致するカテーテルへの接続が可能になります。同時に、ドナーグラフトの下大静脈をクランプします(図2B)。
3. ダブルアーム 4-0 モノフィラメント ポリプロピレン縫合糸を使用して、肝上カバのエンドツーエンドの吻合を行います。
4. 門脈の両端を対応するカニューレで接続し、血流を回復します。ヘパリン生理食塩水は、挿入前にカニューレに洗い流されます。門脈の断続的な開放と下大静脈の一時的なクランプ解除により、残留灌流液のフラッシングが容易になります。
5. 肝上カバからクランプを取り外し、4-0モノフィラメントポリプロピレン縫合糸で下大静脈のエンドツーエンドの吻合を行います。
6. ドナーの肝動脈を10mLのヘパリン食塩水で洗い流し、背出血を防ぐために遠位に追加のブルドッグクランプを配置します。.7-0モノフィラメントポリプロピレン縫合糸を使用して、エンドツーエンドの吻合を行います。
7. ドナーとレシピエントの両方の端から胆道にカテーテルを挿入し、カテーテルをしっかりと縫合して位置の安定性を確保します。
8. 門脈カテーテルを取り外します。4-0モノフィラメントポリプロピレン縫合糸を使用して、門脈のエンドツーエンドの吻合を行います。

6. 移植後のケアとモニタリング

1. レシピエントブタの換気をさらに2時間維持します。
2. 集中治療室のエアコンをつけて室内温度を上げてください。豚を暖かく保つために、温熱パッドが使用されています。
3. 血液サンプルを定期的に収集して、血液ガスと肝臓および腎臓機能を24時間間隔でテストします。
4. 留置針をヘパリン生理食塩水で密封します。.ブタの耳介静脈の留置針は、ブタの動きの後に脱落しないように適切に管理する必要があります。
5. 豚が完全に呼吸できるようになると、換気を終了します。
6. レシピエント豚を豚舎に戻し、麻酔から覚めるまで高さ約10cmの木製ベッドに置きます。木製のベッドの底には、動物の体の周りに尿が溜まるのを防ぐためにタオルが敷かれており、豚舎内の24時間ヒーターによって温度が維持されます。
7. POD 1からメチルプレドニゾロンを初期用量250 mgで注射し、その後、免疫抑制のために徐々に減量します。.
8. POD 1(ブプレノルフィン0.01-0.05 mg / kg)に鎮痛剤を静脈内投与します。.POD2-POD5にトラマドールを筋肉内投与します(12時間ごとに100 mg / kg)。.POD 2からセファロスポリン(2 mg / kg)を1日2回経口投与し、栄養液を追加します。.水分摂取量に制限はありません。
9. 手術後約5日で静脈チャネルを切除します。
10. 尿の量と色を観察します。手術後の便の色の変化を観察してください。
11. 豚が持続性アシドーシス、低血糖、出血または肝不全の兆候に苦しんでいる場合は、豚を犠牲にしてください。
12. OLTx の 5 日後に、深部イソフルラン麻酔 (5%、>2.5 MAC) 下での放血により安楽死を行います。

7. SCS制御ブタモデルの技術

1. 麻酔には上記と同じ手順を採用します。腹部大動脈(AA)と下大静脈(IVC)を解剖して、同じヘパリン化法を利用して血液の排出を助けます。AAとIVCを順番にカニューレ挿入します。塩化カリウム(20 mEq)の心臓内注入により、心停止を迅速に誘発します。.
2. WIT の 30 分後にドナーの肝臓を速やかに採取し、近位肝下大静脈から適切な組織を保存します。
3. 肝臓移植片を保存袋に入れ、冷たいウィスコンシン大学(UW)溶液に浸して、4°Cで8時間保存します。
4. 肝臓をNMPで37°Cで6時間保存し、もう一方のフループで直接OLTxを実行します(図1)。

結果

DCD肝臓は、レシピエントブタに移植される前に、保護手段としてDHOPE-NMP手順を受けました。DHOPE-NMPの手順は次の通りでした:30分間WITのDCD肝臓(n = 8)を最初の段階でDHOPEで8時間保存し、その後さらに6時間NMPモードに移しました。その後、これらの移植片はブタレシピエントのLTに利用されました。グループとプロトコルを説明する概略図を図1に示?...

ディスカッション

肝臓MPは現在、臨床試験で広く利用されていますが、大動物モデルを使用したさらなる前臨床研究が依然として必要です^5,6。ブタOLTxには大きな課題があり、成功率が低くなっています。これらの課題には、ドナーの温性虚血、解剖学的変動、および大静脈と門脈の長期にわたるクランプに対する不耐性が含まれます

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A