阿尔茨海默病 （AD） 神经模型中线粒体相关内质网膜 （MAM） 稳定性的定量分析

摘要

在这里，我们描述了通过实时增加或维持阿尔茨海默病 （AD） 神经元的神经毒性 β-淀粉样蛋白 （Aβ） 产生来测量线粒体相关内质网 （ER） 膜 （MAM） 组成型稳定剂的轴突转运率，作为测量 MAM 稳定性和帮助 AD 疗法开发的直接和定量指标。

摘要

这里介绍了一种在阿尔茨海默病 （AD） 的 3 维 （3D） 神经模型中定量线粒体相关内质网膜 （MAM） 稳定性的方法。首先，表达含有家族性阿尔茨海默病 （FAD） 的 β-淀粉样蛋白前体蛋白 （APP） 或幼稚 ReN 细胞的新鲜人神经祖细胞 ReN 细胞在薄 （1：100） 基质胶包被的组织培养板中生长。细胞汇合后，用编码红色荧光蛋白 （RFP） 偶联的线粒体结合序列的 AKAP1（34-63） （Mito-RFP） 表达质粒进行电穿孔，该质粒可检测线粒体或组成型 MAM 稳定剂 MAM 1X 或 MAM 9X，分别稳定紧密（6 nm ± 1 nm 间隙宽度）或松散（24 nm ± 3 nm 间隙宽度）MAM。16-24 小时后，收获细胞并通过荧光激活细胞分选仪 （FACS） 富集。将相同数量的富含FACS的细胞接种在3维基质（1：1基质胶）中，并使其分化为成熟神经元10天。表达 RFP 偶联的 MAM 稳定剂的 10 天分化细胞的活细胞图像在配备活细胞成像培养室的荧光显微镜下捕获，该培养室保持 CO₂ （5%）、温度 （37 °C） 和湿度 （~90%）。为此，我们进行了活细胞成像和运动分析，以测量用 Mito-RFP 标记的游离线粒体的运动性，或分别由 MAM 1X 或 MAM 9X 稳定的紧密或松散间隙宽度的 ER 结合线粒体，在每个 ReN GA 神经元的最延伸神经元过程中至少为 500 nm 长，将这些视为轴突。

引言

新出现的证据表明，专门的线粒体相关内质网接触 （MERC），生化收获为线粒体相关 ER 膜，通常称为 MAM ^1,2，在包括 AD ^3,4 在内的多种神经退行性疾病中发挥作用。这些 MAM 由 ER 中富含胆固醇的脂筏状微结构域和线粒体外膜组成，这些蛋白由一系列蛋白质拴住，这些蛋白质在 MAM 之间产生结构和功能多样性 ^5,6,7。最近创造的 MAM 假说假设 MAM 的增加导致 Aβ 产生增加和 AD 的致病级联反应，包括神经原纤维缠结 （NFT） 形成、钙稳态障碍和神经炎症 ^3,8。大约 5%-20% 的线粒体与 ER 进行物理接触以形成 MAMs⁹。MAM 的间隙宽度由平滑和粗糙的 ER（分别为 sER 和 rER）决定。sER-线粒体 （10-50 nm） 和 rER-线粒体 （50-80 nm） 之间的可变间隙宽度表明 MAM 的间隙宽度具有从紧密 （~10 nm） 到松散 （~80 nm） 之间的长光谱10,11,12,13。MAM 间隙宽度决定了 MAM 功能，例如钙稳态和脂质转运 ^1,14。最近的一份报告表明，在紧密 （~10 nm） 连接的 ER 和线粒体之间形成的 MAM，称为全 MAM，是凋亡的。相比之下，在松散连接 （~25 nm） ER 和线粒体之间形成的 MAM，称为有缺陷或中等的 MAM，具有抗凋亡作用 14,15,16。间隙宽度为 6 nm ± 1 nm 的 MAM 的稳定增加了 AD 的新型 3 维 （3D） 神经培养模型的 Aβ 生成。相比之下，间隙宽度为 24 nm ± 3 nm 的 MAM 的稳定化对 Aβ 的产生没有影响¹⁷。这一发现首次表明，调节 MAM 的稳定程度，而不是破坏 MAM 的稳定性，是调节 Aβ 生成的关键。试图完全破坏 MAM 的稳定性可能会产生不必要的后果，因为 MAM 会维持几个对细胞存活至关重要的细胞事件¹²。

MAMs 的调节是一个新兴的研究领域，对各种疾病具有潜在影响，包括癌症、代谢紊乱和神经退行性疾病¹⁸。尽管有许多 MAM 调节剂可用，但迄今为止尚未采取重大尝试来测试它们破坏 MAM 稳定性和降低 AD 病理学的能力，主要是因为 MAM 的结构多样性使它们成为药物发现的目标高度复杂的系统。但是，新开发的结构系统药理学考虑了药物靶标及其环境^18,19 的特定特性，应该克服困难并开发针对 AD 中 MAM 或 MAM 相关蛋白的高效药物。然而，寻找 MAM 稳定的有效调节剂需要精确量化 MAM 稳定程度的方法。电子显微镜 （EM） 或超分辨率显微镜等传统技术在确定 MAM 稳定性方面存在局限性。克服这些挑战可能需要开发新颖的、更具动态性的成像技术或生化分析，这些技术可以提供活细胞中 MAM 稳定性的定量测量。原代神经元的聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB-SEM） 显示，ER 倾向于在线粒体周围形成一个网络，这可能会限制线粒体的运动^20,21。线粒体运输系统的破坏，无论是逆行的、顺行的还是两者兼而有之，都对突触和神经元功能产生了深远的影响²²。因此，此处描述的 ER 结合线粒体轴突速度的新型活细胞成像和基于运动群分析作为定量测量 MAM 稳定性的指标，将有助于识别可以将 MAM 稳定阈值切换到维持或可能降低而不是增加 Aβ 产生的 MAM 调节剂。

研究方案

AD 神经培养模型： 本研究使用了源自人类神经祖先 ReN 细胞 [初始 ReN （Millipore）] 或表达淀粉样蛋白前体蛋白 （APP） 基因 （APP^Swe/Lon） 家族性 AD （fAD） 突变的 ReN 细胞的神经元，ReN GA 细胞。ReN-GA 三维 （3D） 培养系统概括了 AD 病理学，即 Aβ 寡聚体驱动的神经原纤维缠结 （NFT） ^23,24。Naive ReN 细胞是市售的。ReN GA 品系购自麻省总医院 （MGH） 副教授 Doo Y. Kim 博士23,24,25。

表达质粒：AKP1 （34-63） 和 Ubc 6 （283-303） 蛋白的 ER 靶向序列直接与 RFP（Mito-RFP-ER 表示为 MAM 1X）或包含一个 9 个氨基酸的连接子（Mito-9X-RFP-ER 表示为 MAM 9X）旨在稳定 6 nm ± 1 nm 或 24 nm + 3 nm 间隙宽度的 MAM，分别为^15,26（图 1A）。

1. 电穿孔

1. 用 MAM 稳定剂转染细胞（1-2 小时）
   注：遵循 nucleofector 试剂盒制造商描述的方案 （材料表).在开始之前，准备 6 孔玻璃底培养皿，预涂有含有 1% 基质胶的 DMEM/F12（以下简称基底膜基质 [BMM]）。使用 2 mL BMM 包被每个孔。在 37 °C 下孵育至少 1 小时。BMM、培养基、移液器吸头和移液器在混合前都应预冷，以防止 BMM 凝固。
   1. 吸出 BMM 混合物。在每个孔中更换 2 mL 室温 （RT） DMEM/F12。
   2. 将 Nucleofector 与补充剂 1 以 4.5：1 的比例混合（100 μL 溶液为 82 μL：18 μL 的 Nucleofector/补充剂比例）。对于每个所需的转染，需要 100 μL 的 Nucleofector。
   3. 涡旋 DNA。然后，每次转染在 1 mL 微量离心管中加入 1-5 μg DNA（每次处理）。
   4. 使用acustase收获一板健康的ReN-GA细胞。
      注：将细胞铺板在 100 mm 组织培养皿中的扩增培养基（表 1）中，并等待汇合度达到 70-80%。
      1. 吸出现有培养基并用 10 mL PBS 洗涤一次。
      2. 直接向细胞中加入 1 mL acutase 并在 37 °C 下孵育 5-10 分钟。
      3. 轻轻敲击培养皿的侧面，将细胞从培养皿中去除。在显微镜下检查以确保细胞松动并自由流动。
      4. 用 10 mL DMEM/F12 中和切割酶，然后转移到干净的 15 mL 试管中。
      5. 将所需数量的细胞以 274 x g 离心 5 分钟，然后吸出上清液以去除死细胞。然后，将沉淀重悬于 10 mL DMEM/F12 中。
   5. 计数细胞以确定密度。
      注意：在这项研究中，使用自动细胞计数器来计数细胞数量。每次电穿孔需要 3-5 X 10⁶ 个细胞（例如，5 次处理需要 15-25 X 10⁶ 个细胞）。
      1. 取 10 μL 悬浮细胞，添加到细胞计数室的 A 侧。然后向 B 侧添加 10 μL。
         注：将移液器倾斜到一侧，添加细胞悬液。不要推过移液器柱塞上的第一个挡块，以避免气泡。
      2. 将装满的计数室带到细胞计数仪，将 A 面插入正面的主插槽中。
      3. 按下 Measure（测量）后，记下每 mL 的细胞数。
      4. 取出腔室，翻转到 B 侧，重复步骤 1.1.5.2-1.1.5.3。
      5. 将这两个数字相加，然后除以 4（如果不使用台盼蓝），然后将该数字乘以细胞悬浮的毫升数，得到悬浮液中的细胞总数。
   6. 将所需数量的细胞以 274 x g 离心 5 分钟，然后吸出上清液。
   7. 每次电穿孔将沉淀重悬于 100 μL Nucleofector 混合物中。（例如，500 μL 用于 5 次处理）。
      注：将细胞置于 Nucleofector 溶液中超过 15 分钟可能会降低细胞活力和整体疗效。
   8. 将 100 μL 细胞悬液添加到其中一根含有 DNA 的试管中，并通过移液混合。
   9. 将 DNA 混合物转移到电穿孔比色皿中，并用提供的盖子密封。为避免产生气泡，请向下倾斜比色皿并缓慢移液。
   10. 选择适合所用设备的 Nucleofector 程序。对于本研究中使用的设备，使用程序 A-033 进行转染。为了进行优化，请尝试所有 5 个 Nucleofector 程序，以确定最适合每种细胞类型的程序。
       注：确认电穿孔成功的是混合物顶部可见的泡沫。
   11. 立即使用提供的无菌移液器，将 ~500 μL DMEM 从预装的 6 孔板中加入到比色皿中。轻轻混合一次，然后将电穿孔的细胞和培养基转移到相应的孔中。
       注：电穿孔后，细胞非常敏感，因此快速转移培养基并小心移液至关重要。
   12. 对所有剩余的 DNA 处理重复步骤 1.1.8-1.1.11。
   13. 将细胞在 37 °C 下，在 CO₂ （5%） 存在下孵育过夜。
   14. 第二天，用新鲜的分化培养基（表 2）交换培养基，让细胞分化 10 天。每 2-3 天更换一次新鲜培养基。

2. 活细胞成像

1. 用于活细胞显微镜检查的细胞制备（30 分钟）
   1. 活细胞腔室制备（在将细胞移入腔室之前）
   2. 确保 CO₂ 罐和加湿器连接到腔室，阀门打开，并且罐已装满。
   3. 将温度设置为 37 °C，将 CO₂ 设置为 5%，将湿度设置为 95%。（这可能需要一些时间才能使水平平衡）。
   4. 将含有细胞的 6 孔板放入腔室中，并调整显微镜的焦距，直到细胞变得可见。
   5. 打开激光器 （Table of Materials）。
   6. 要捕获 RFP 信号，请使用 594 nm 激光激发荧光团并使用 570-640 nm 发射。对于 GFP，使用 488 nm 激光激发和 510-540 nm 发射。
   7. 使用内置的荧光滤光片，调整信号强度，直到背景信号消散（应接近纯黑色）。
2. 捕获轴突的实时视频（总共 10 小时-15 小时）
   注：使用 Nikon C2 Eclipse Ti2 倒置共聚焦显微镜通过 NIS Element AR 软件捕获荧光图像。使用 60 倍放大倍率，分辨率为 512 像素，以每秒 1 帧的速度拍摄视频 3 分钟，产生更清晰的运动记录仪。
   1. 查找表达 RFP 生物传感器的细胞。在拍摄视频之前，请导出单元格的图像以供以后参考。
   2. 裁剪扫描区域以适合轴突。使用更小的扫描区域可以减少显微镜的处理时间，并使运动量成像更容易。
   3. 关闭所有激光器以帮助软件运行更顺畅。请注意，当程序在所有激光器都处于活动状态的情况下运行时，并非所有帧都被捕获。
      注意：来自胞体的红色荧光信号比轴突中的要亮得多。因此，排除胞体以增加轴突中的整体信号强度。移至 Time Measurement 选项卡。
   4. 设置间隔为 1 帧/秒，总时间为 181 秒。
   5. 单击 Run。
   6. 将此文件另存为 .nds 文件（正确标记），并对每个 MAM 稳定器（MAM 1X 或 MAM 9X）重复该过程 ~10 次。
      注意：如果扫描时间过长，激光的强度有时会对 RFP 信号产生明显的漂白效果。快速捕获视频很重要。

3. 后处理（7 天）

注意：为了分析运输和生成运动记录仪，使用了 Fiji ImageJ 宏。移动速度小于 0.1 mm/s 的囊泡被归类为静止性。粒子运动频率的计算方法是将沿给定方向（顺行、逆行）或不移动（静止）的粒子数除以运动记录仪中分析的粒子总数。每个囊泡暂停或移动的时间是通过平均分析的每个神经元中所有囊泡在每种情况下花费的时间百分比来计算的。在每种实验条件下，仅使用移动囊泡计算速度和运行长度的频率分布。在 100 mm 轴突束上进行分析 3 分钟。

1. 生成 kymograph
   1. 在 Fiji ImageJ 中打开 .nds 文件。
   2. 前往 图片 选项卡，然后单击 租房.记录像素与微米的比率。这是以后计算所必需的。
   3. 单击 文件>另存为 > Tiff 将文件作为.tiff保存到其文件夹中（宏会自动将生成的所有内容保存到此文件夹中）。
   4. 将 Kymo 宏拖到 ImageJ 中。该代码在 补充编码文件 1 中提供。单击 Run。
   5. 不要打 OK. 切换到 MAX_raw 窗口。沿轴突手动左键单击，然后双击以结束跟踪。
      注意：确保从胞体跟踪轴突，以便轴突末端。这样，顺行和逆行的计算将是正确的。
   6. 按 ROI 管理器上的 命令 T 或 Add。
   7. 现在点击 OK。将在之前创建的文件夹中生成一个 kymograph。（X 轴是轴突长度，单位为微米，Y 轴是时间，单位为秒）。
2. 跟踪运动记录仪
   1. 将运动图拖到 Fiji Image J 中（它应该会自动放置在之前创建的文件夹中）。
   2. 将 Track 宏拖动到 Image J 中。
   3. 在以下提示中，单击 Ok （确定）。 如果从之前继续工作，请输入要继续的数字点，然后按 Ok。
   4. 使用“选择”面板上的“矩形”工具，选择靠近运动图中间的区域，该区域高度为 60 像素，宽度始终为 100 μm。为此，请将 100 除以步骤 3.1.2 中记录的像素与微米比率。
   5. 选择一个区域后，按 Ctrl T 将 i t 添加到 ROI 中，并将 ROI 保存到正在处理的文件夹中（按 ROI 菜单中的 More ，然后按 Save）。
      注意：按 Ctrl+Shift+I 反转所选区域将使其更易于跟踪。
   6. 要跟踪单个囊泡的运动，请按住 Ctrl 键，同时从上到下单击鼠标左键。
   7. 为此，在右键单击时按住 Ctrl 键，将弹出一个窗口，显示轴突的跟踪位置。如果这看起来不错，请按 Ok（确定）。
   8. 要继续并选择另一个囊泡，请单击 Yes 并重复步骤 3.2.6-3.2.8 中的过程。跟踪每个可见的囊泡后，按 No。这会自动将手部追踪叠加层保存到同一文件夹。
3. 测量 kymograph 数据
   1. 创建新文件夹。将每个生成的文本文件拖到文件夹中。
   2. 打开 kymograph 文件并记录尺寸。
   3. 将 Measure 宏拖动到 Image J 中。
   4. 将之前记录的微米与像素比率输入 到 PixelScale 中。
   5. 将 Speed Limit Low （速度限制低 ） 更改为 0.1。（低于此限制的囊泡被认为是静止的）。
   6. 输入之前记录的运动记录仪尺寸。摘要文件将在创建的文本文件夹中自动生成。每个摘要填充将包含 %Time Traveled、Overall Speed （μm/s）、Total Distance （总距离）、Average Segment Traveled、Number of Stopping （停止次数） 和 Number of Turns Reversed（倒车次数）。用于生成、跟踪和测量 kymograph 数据的代码作为 补充编码文件 1 提供。

结果

进行活细胞成像和运动造影分析以测量用 Mito-RFP 标记的游离线粒体的运动性或分别由 MAM 1X 或 MAM 9X 稳定的紧密（6 nm ± 1 nm）或松散（24 nm ± 3 nm）接触宽度的 ER 结合线粒体的运动，在每个 ReN GA （AD） 或 ReN（幼稚）神经元的最长神经元过程中，长度至少为 500 nm， 将其视为轴突（图 1 和图 2）。通过将移动或静止的 RFP 标记的?...

讨论

抑制 sigma-1 受体 （S1R） 下调了神经元过程中 MAM 的稳定性，并显着减少了 （~90%） 来自轴突的 Aβ 产生，而不是来自表达淀粉样蛋白前体蛋白 [APP] 基因 （ReN GA） 中家族性 AD [FAD] 突变的人神经祖细胞 （ReN） 的三维 （3D） 培养系统的胞体的 Aβ 产生23,24,25,27.RFP 标记的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well Glass Bottom Plate	Cellvis	P06-1.5H-N
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco/Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	R&D System	233-FB
BSA	Fisher Scientific	501781532
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DMEM/F12 with L-glutamine	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11320-033
EDTA	Life Technologies	41116134
EGF	Sigma-Aldrich	92090408
Falcon 6 Well Plates	VWR International	41122107
GAPDH Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-988
Gelatin	VWR International	9000-70-8
Graphpad Prism N/A	Prism 9, version 9.5.0	N/A
Heparin	Sigma-Aldrich	H0200000
ImageJ Software	ImageJ 1.53a	N/A
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
mCherry Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-34974
MS Excel	Microsoft Excel, version 2302	N/A
Multi-array electrochemiluminescence assay kit	Meso Scale Diagnostics (MSD)	K15200E-2	V-PLEX Aβ Peptide Panel 1 (6E10) kit
NaCl	Fisher Scientific	7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel	Invitrogen	NP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Lonza	17-745E
Photoshop	Adobe Photoshop CC 20.0.10	N/A
Rat Neuron Nucleofector Kit	Lonza	VPG-1003
StemPro Accutase	Gibco	A1110501
Tris-HCL, pH 7.6	Boston BioProducts	42000000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Fisher Scientific	501657287