Analisi quantitativa della stabilizzazione della membrana del reticolo endoplasmatico (MAM) associata ai mitocondri in un modello neurale della malattia di Alzheimer (AD)

Riepilogo

Qui, descriviamo la misurazione della velocità di trasporto assonale degli stabilizzatori costitutivi delle membrane del reticolo endoplasmatico (ER) associate ai mitocondri (MAM) aumentando o mantenendo la generazione neurotossica di β-amiloide (Aβ) dai neuroni della malattia di Alzheimer (AD) in tempo reale per fungere da metrica diretta e quantitativa per misurare la stabilizzazione MAM e aiutare lo sviluppo di terapie per l'AD.

Abstract

Qui viene presentato un metodo per quantificare la stabilizzazione delle membrane del reticolo endoplasmatico associate ai mitocondri (MAM) in un modello neurale tridimensionale (3D) della malattia di Alzheimer (AD). Per cominciare, le cellule ReN neuroprogenitrici umane fresche che esprimono la proteina precursore dell'amiloide-β (APP) contenente la malattia di Alzheimer familiare (FAD) o le cellule ReN naive vengono coltivate in piastre di coltura tissutale sottili (1:100) rivestite di Matrigel. Dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza, queste vengono elettroporate con plasmidi di espressione che codificano la sequenza di legame dei mitocondri coniugata con la proteina di fluorescenza rossa (RFP) di AKAP1(34-63) (Mito-RFP) che rileva i mitocondri o gli stabilizzatori costitutivi MAM MAM 1X o MAM 9X che stabilizzano rispettivamente MAM stretti (6 nm ± 1 nm di larghezza del gap) o sciolti (24 nm ± 3 nm di larghezza del gap). Dopo 16-24 ore, le cellule vengono raccolte e arricchite da un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Un numero uguale di cellule arricchite con FACS viene seminato nella matrice tridimensionale (Matrigel 1:1) e lasciato differenziare in neuroni maturi per 10 giorni. Le immagini delle cellule differenziate a 10 giorni che esprimono gli stabilizzatori MAM coniugati con RFP vengono acquisite al microscopio a fluorescenza dotato di una camera di coltura per l'imaging di cellule vive che mantiene la CO₂ (5%), la temperatura (37 °C) e l'umidità (~90%). A tal fine, abbiamo eseguito l'imaging di cellule vive e analisi chimografiche per misurare la motilità dei mitocondri liberi marcati con Mito-RFP o mitocondri legati all'ER di larghezze di gap strette o larghe stabilizzate da MAM 1X o MAM 9X, rispettivamente, nel processo neuronale più esteso di ciascun neurone ReN GA che è lungo almeno 500 nm, considerandoli come assoni.

Introduzione

Prove emergenti suggeriscono che i contatti specializzati del reticolo endoplasmatico associati ai mitocondri (MERC), raccolti biochimicamente come membrane ER associate ai mitocondri, spesso indicati come MAM ^1,2, svolgono un ruolo in diverse malattie neurodegenerative, tra cui AD ^3,4. Questi MAM sono composti da microdomini lipidici ricchi di colesterolo nell'ER e nella membrana esterna dei mitocondri legati da una serie di proteine che creano diversità strutturali e funzionali tra i MAM ^5,6,7. L'ipotesi MAM, coniata di recente, postula che l'aumento dei MAM porti a un aumento della produzione di Aβ e alla cascata patogena dell'AD, tra cui la formazione di grovigli neurofibrillari (NFT), la disomeostasi del calcio e la neuroinfiammazione ^3,8. Circa il 5%-20% dei mitocondri entra in contatto fisico con l'ER per formare le MAM⁹. La larghezza della fessura delle MAM è determinata dall'ER liscio e ruvido (sER e rER, rispettivamente). La larghezza variabile del gap tra i mitocondri sER (10-50 nm) e i mitocondri rER (50-80 nm) suggerisce che l'ampiezza del gap dei MAM ha un lungo spettro che varia da stretto (~10 nm) a sciolto (~80 nm)10,11,12,13. L'ampiezza dello spazio MAM determina le funzioni MAM, come l'omeostasi del calcio e il trasporto dei lipidi ^1,14. Un recente rapporto ha dimostrato che le MAM formate tra ER strettamente connessi (~10 nm) e mitocondri, chiamate MAM complete, sono apoptotiche. Al contrario, le MAM formate tra ER debolmente connesse (~25 nm) e mitocondri, denominate MAM difettose o medie, sono anti-apoptotiche 14,15,16. La stabilizzazione delle MAM con una larghezza di gap di 6 nm ± 1 nm ha aumentato la generazione di Aβ da un nuovo modello di coltura neurale tridimensionale (3D) di AD. Al contrario, la stabilizzazione delle MAM con una larghezza di gap di 24 nm ± 3 nm non ha alcun effetto sulla generazione^{Aβ 17}. Questa scoperta suggerisce per la prima volta che la regolazione del grado di stabilizzazione dei MAM, ma non la destabilizzazione dei MAM, è la chiave per regolare la generazione di Aβ. Un tentativo di destabilizzare completamente i MAM può avere conseguenze indesiderate perché i MAM mantengono diversi eventi cellulari critici per la sopravvivenza cellulare¹².

La modulazione dei MAM è un'area di ricerca emergente con potenziali implicazioni per vari disturbi, tra cui il cancro, i disturbi metabolici e le malattie neurodegenerative¹⁸. Nonostante la disponibilità di molti modulatori MAM, finora non è stato fatto alcun tentativo importante per testare le loro capacità di destabilizzare i MAM e abbassare la patologia AD, principalmente perché le diversità strutturali dei MAM li rendono un sistema altamente complesso da mirare per la scoperta di farmaci. Tuttavia, la farmacologia dei sistemi strutturali di recente sviluppo, che considera le proprietà specifiche dei bersagli farmacologici e del loro ambiente^18,19, dovrebbe superare le difficoltà e sviluppare farmaci altamente potenti che prendono di mira i MAM o le proteine associate ai MAM nell'AD. Tuttavia, la ricerca di un modulatore efficace della stabilizzazione MAM richiede metodi per quantificare con precisione il grado di stabilizzazione MAM. Le tecniche tradizionali come la microscopia elettronica (EM) o la microscopia a super-risoluzione hanno limitazioni nel determinare la stabilizzazione MAM. Il superamento di queste sfide richiederebbe probabilmente lo sviluppo di nuove tecniche di imaging più dinamiche o di saggi biochimici in grado di fornire misure quantitative della stabilizzazione MAM nelle cellule viventi. La microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) dei neuroni primari ha rivelato che l'ER tende a formare una rete attorno ai mitocondri che probabilmente limita la motilità mitocondriale^20,21. L'interruzione dei sistemi di trasporto mitocondriale, retrogrado, anterogrado o entrambi, ha avuto un profondo impatto sulla funzione sinaptica e neuronale²². Pertanto, il nuovo imaging di cellule vive e l'analisi basata sulla chimografia della velocità assonale dei mitocondri legati all'ER qui descritti come metrica per misurare quantitativamente la stabilizzazione MAM faciliteranno l'identificazione di modulatori MAM in grado di commutare la soglia di stabilizzazione MAM in una che mantiene o possibilmente abbassa invece di aumentare la generazione di Aβ.

Protocollo

Modelli di cultura neurale AD: Questo studio ha utilizzato neuroni derivati da cellule ReN progenitrici neurali umane [ReN naive (Millipore)] o cellule ReN che esprimono mutazioni AD familiari (fAD) nel gene della proteina precursore dell'amiloide (APP) (APP^{Swe / Lon}), cellule ReN GA. Il sistema di coltura tridimensionale (3D) ReN-GA ricapitola la patologia dell'AD, in particolare i grovigli neurofibrillari (NFT) guidati da oligomeri Aβ ^23,24. Le cellule Naive ReN sono disponibili in commercio. Le linee ReN GA sono state ottenute dal Dr. Doo Y. Kim, Professore Associato, Massachusetts General Hospital (MGH)23,24,25.

Plasmidi di espressione: AKP1 (34-63) e la sequenza ER bersaglio delle proteine Ubc 6 (283-303) si legano direttamente con RFP (Mito-RFP-ER indicato come MAM 1X) o contengono un linker di 9 aminoacidi (Mito-9X-RFP-ER indicato come MAM 9X) progettato per stabilizzare MAM di 6 nm ± 1 nm o 24 nm + 3 nm di gap larghezze, rispettivamente^15,26 (Figura 1A).

1. Elettroporazione

1. Trasfezione delle cellule con stabilizzatori MAM (1-2 h)
   NOTA: Seguire il protocollo descritto dal produttore del kit del nucleolettore (Tabella dei materiali). Prima di iniziare, preparare piastre di coltura a 6 pozzetti con fondo di vetro pre-rivestite con DMEM/F12 contenente l'1% di Matrigel (d'ora in poi denominato matrice a membrana basale [BMM]). Utilizzare 2 ml di BMM per ricoprire ogni pozzetto. Incubare per almeno 1 ora a 37 °C. BMM, terreno, puntali per pipette e pipette devono essere preraffreddati prima della miscelazione per evitare che il BMM si solidifichi.
   1. Aspirare la miscela BMM. Sostituire con 2 mL di DMEM/F12 a temperatura ambiente (RT) in ciascun pozzetto.
   2. Combinare Nucleofector con l'integratore 1 in un rapporto 4,5:1 (82 μL:18 μL di rapporto Nucleofector/Integratore per 100 μL di soluzione). Per ogni trasfezione desiderata, sono necessari 100 μL di Nucleofector.
   3. DNA a vortice. Quindi, aggiungere 1-5 μg di DNA (per trattamento) in provette da microcentrifuga da 1 ml per ogni trasfezione.
   4. Usa l'acustasi per raccogliere una piastra di cellule ReN-GA sane.
      NOTA: Piastra le cellule nel terreno di espansione (Tabella 1) in piastre di coltura tissutale da 100 mm e attendi che la confluenza raggiunga il 70-80%.
      1. Aspirare il terreno esistente e lavare una volta con 10 ml di PBS.
      2. Aggiungere 1 mL di acutasi direttamente alle cellule e incubare per 5-10 minuti a 37 °C.
      3. Staccare le cellule dal piatto picchiettando delicatamente il lato del piatto. Controlla al microscopio per assicurarti che le cellule siano allentate e scorrano liberamente.
      4. Neutralizzare l'acutasi con 10 mL di DMEM/F12 e trasferire in una provetta pulita da 15 mL.
      5. Centrifugare il numero richiesto di cellule a 274 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante per rimuovere le cellule morte. Quindi, risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12.
   5. Conta le celle per determinare la densità.
      NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un contatore automatico di celle per contare il numero di cellule. Per elettroporazione, sono necessarie 3-5 X 10⁶ celle (ad esempio, 5 trattamenti richiederebbero 15-25 X 10⁶ cellule).
      1. Prelevare 10 μl di celle sospese e aggiungerle al lato A di una camera di conteggio delle cellule. Quindi aggiungere 10 μl al lato B.
         NOTA: Aggiungere la sospensione cellulare inclinando la pipetta lateralmente. Evitare la formazione di bolle evitando di spingere oltre il primo arresto sullo stantuffo della pipetta.
      2. Portare la camera di conteggio piena al contacelle e inserire il lato A nella fessura principale sulla parte anteriore.
      3. Dopo aver premuto Misura, annotare il numero di celle per ml.
      4. Estrarre la camera, capovolgerla sul lato B e ripetere i passaggi 1.1.5.2-1.1.5.3.
      5. Somma questi due numeri, quindi dividi per 4 (se non usi il blu di tripano), quindi moltiplica il numero per i millilitri di liquido in cui sono sospese le celle per ottenere il numero totale di celle nella sospensione.
   6. Centrifugare il numero richiesto di cellule a 274 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
   7. Risospendere il pellet in 100 μL di miscela di nucleofector per elettroporazione. (ad esempio, 500 μl per 5 trattamenti).
      NOTA: Lasciare le cellule nella soluzione di Nucleofector per più di 15 minuti potrebbe ridurre la vitalità cellulare e l'efficacia complessiva.
   8. Aggiungere 100 μl di sospensione cellulare a una delle provette contenenti DNA e mescolare mediante pipettaggio.
   9. Trasferire la miscela di DNA in una cuvetta per elettroporazione e sigillare con il coperchio in dotazione. Per evitare la formazione di bolle, inclinare la cuvetta verso il basso e pipettare lentamente.
   10. Selezionare il programma Nucleofector appropriato per il dispositivo in uso. Per il dispositivo utilizzato in questo studio, utilizzare il programma A-033 per la trasfezione. Per ottimizzare, prova tutti e 5 i programmi Nucleofector per determinare quello più appropriato per ogni tipo di cellula.
       NOTA: Una conferma di successo dell'elettroporazione è la schiuma visibile nella parte superiore della miscela.
   11. Immediatamente, utilizzando le pipette sterili fornite, aggiungere ~500 μL di DMEM dalla piastra preriempita a 6 pozzetti nella cuvetta. Mescolare delicatamente una volta e poi trasferire le celle elettroporate e il terreno nel pozzetto corrispondente.
       NOTA: Dopo l'elettroporazione, le cellule sono estremamente sensibili, quindi è essenziale trasferire rapidamente il terreno e pipettare con cura.
   12. Ripetere i passaggi 1.1.8-1.1.11 per tutti i restanti trattamenti del DNA.
   13. Incubare le cellule a 37 °C in presenza di CO₂ (5%) per una notte.
   14. Il giorno successivo, scambiare i terreni con i mezzi di differenziazione freschi (Tabella 2) e lasciare che le cellule si differenzino per 10 giorni. Ogni 2-3 giorni, sostituire con un nuovo supporto.

2. Imaging di cellule vive

1. Preparazione delle cellule per la microscopia su cellule vive (30 min)
   1. Preparazione della camera delle cellule vive (prima di spostare le cellule nella camera)
   2. Assicurarsi che il serbatoio di CO₂ e l'umidificatore siano collegati alla camera, che le valvole siano aperte e che i serbatoi siano pieni.
   3. Impostare la temperatura a 37 °C, la CO₂ al 5% e l'umidità al 95%. (Questo potrebbe richiedere del tempo prima che i livelli si equilibrino).
   4. Posizionare una piastra a 6 pozzetti contenente le cellule nella camera e regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando le cellule non diventano visibili.
   5. Accendere il laser (Tabella dei materiali).
   6. Per catturare il segnale RFP, eccitare il fluoroforo utilizzando un laser a 594 nm e utilizzare un'emissione di 570-640 nm. Per la GFP, utilizzare un laser a 488 nm per l'eccitazione e l'emissione a 510-540 nm.
   7. Utilizzando il filtro fluorescente incorporato, regolare l'intensità del segnale fino a quando il segnale di fondo non si è dissipato (dovrebbe essere quasi nero fisso).
2. Acquisizione di video in diretta di assoni (10 h-15 h in totale)
   NOTA: Un microscopio confocale invertito Nikon C2 Eclipse Ti2 è stato utilizzato per acquisire immagini fluorescenti utilizzando il software NIS Element AR. Utilizza l'ingrandimento 60x con una risoluzione di 512 pixel, riprendendo video a 1 fotogramma al secondo per 3 minuti di chimografi più puliti prodotti.
   1. Trova una cellula che esprime biosensori RFP. Esporta un'immagine della cella per riferimento successivo prima di registrare un video.
   2. Ritagliare l'area di scansione in modo che si adatti all'assone. L'utilizzo di un'area di scansione più piccola riduce i tempi di elaborazione del microscopio e rende la generazione della chimografia molto più semplice.
   3. Spegni tutti i laser per aiutare il software a funzionare in modo più fluido. Si prega di notare che quando il programma viene eseguito con tutti i laser attivi, non tutti i fotogrammi vengono acquisiti.
      NOTA: Il segnale fluorescente rosso dal soma è molto più luminoso che nell'assone. Pertanto, il soma viene escluso per aumentare l'intensità complessiva del segnale nell'assone. Passare alla scheda Misurazione tempo .
   4. Impostare l'intervallo su 1 fotogramma al secondo e impostare il tempo complessivo su 181 s.
   5. Fare clic su Esegui.
   6. Salva questo file come file .nds (correttamente etichettato) e ripeti il processo ~10 volte per stabilizzatori MAM (MAM 1X o MAM 9X).
      NOTA: La potenza del laser a volte produceva un notevole effetto di sbiancamento sul segnale RFP se scansionato troppo a lungo. Lavorare rapidamente per catturare video è importante da considerare.

3. Post-elaborazione (7 giorni)

NOTA: Per analizzare il trasporto e generare chimografi, sono state utilizzate le macro Fiji ImageJ. Le vescicole che si muovevano meno di 0,1 mm/s sono state classificate come stazionarie. La frequenza di movimento delle particelle è stata calcolata dividendo il numero di particelle che si muovono in una data direzione (anterograda, retrograda) o non in movimento (stazionarie) per il numero totale di particelle analizzate nel chimografo. Il tempo trascorso da ciascuna vescicola in pausa o in movimento è stato calcolato calcolando la media della percentuale di tempo trascorso in ciascuna condizione per tutte le vescicole in ciascun neurone analizzato. La distribuzione di frequenza per la velocità e la lunghezza della corsa è stata calcolata utilizzando solo vescicole mobili per ogni condizione sperimentale. L'analisi è stata eseguita su tratti assonali di 100 mm per 3 min.

1. Generazione di un chimografo
   1. Aprire il file .nds in Fiji ImageJ.
   2. Vai alla scheda Immagine e fai clic su Proprietà. Registra il rapporto pixel/micron. Questo è necessario per il calcolo successivo.
   3. Fare clic su File > Salva come > Tiff per salvare il file come .tiff nella relativa cartella (la macro salverà automaticamente tutto ciò che è stato generato in questa cartella).
   4. Trascina la macro Kymo in ImageJ. Il codice è fornito nel file di codifica supplementare 1. Fare clic su Esegui.
   5. Non premere OK. Passa alla finestra MAX_raw. Fare clic manualmente con il pulsante sinistro del mouse lungo l'assone e fare doppio clic per terminare il tracciamento.
      NOTA: Assicurarsi di tracciare l'assone dal soma in modo che il terminale dell'assone. In questo modo i calcoli anterogradi e retrogradi saranno corretti.
   6. Premi il comando T o Aggiungi su ROI manager.
   7. Ora fai clic su OK. Verrà generato un chimografo nella cartella creata in precedenza. (L'asse X è la lunghezza dell'assone in micron e l'asse Y è il tempo in secondi).
2. Tracciamento del chimografo
   1. Trascina il chimografo in Fiji Image J (dovrebbe essere posizionato automaticamente nella cartella creata in precedenza).
   2. Trascinare la macro Traccia nell'immagine J.
   3. Al prompt seguente, fare clic su OK. Se si riprende il lavoro da prima, inserire il punto numerico da cui continuare e quindi premere Ok.
   4. Utilizzando lo strumento Rettangolo nel pannello Seleziona , selezionare un'area vicino al centro del chimografo che sia alta 60 pixel e abbia sempre un diametro di 100 μm. A tale scopo, dividere 100 per il rapporto pixel/micro registrato nel passaggio 3.1.2.
   5. Dopo aver selezionato un'area, premere Ctrl T per aggiungere i t alla ROI e salvare la ROI nella cartella in cui si sta lavorando (premere Altro nel menu ROI e quindi Salva).
      NOTA: Invertendo l'area selezionata premendo Ctrl+Maiusc+I , sarà più facile tracciare.
   6. Per tracciare il movimento di una singola vescicola, tieni premuto Ctrl mentre fai clic con il pulsante sinistro del mouse dall'alto verso il basso.
   7. Per fare ciò, tieni premuto Ctrl mentre fai clic con il pulsante destro del mouse e apparirà una finestra che mostra dove vengono tracciati gli assoni. Se l'aspetto è buono, premere Ok.
   8. Per continuare e selezionare un'altra vescicola, fare clic su Sì e ripetere la procedura dai passaggi 3.2.6-3.2.8. Una volta tracciate tutte le vescicole visibili, premere No. In questo modo la sovrapposizione tracciata a mano verrà salvata automaticamente nella stessa cartella.
3. Misurazione dei dati del chimografo
   1. Creare una nuova cartella. Trascina tutti i file di testo generati nella cartella.
   2. Apri il file del chimografo e registra le dimensioni.
   3. Trascinare la macro Misura nell'immagine J.
   4. Immettere il rapporto micron/pixel registrato in precedenza in PixelScale.
   5. Modificare il limite di velocità minimo a 0,1. (Le vescicole che si muovono al di sotto di questo limite sono considerate stazionarie).
   6. Inserire le dimensioni del chimografo precedentemente registrate. Il file di riepilogo verrà generato automaticamente nella cartella di testo creata. Ogni riempimento di riepilogo conterrà la percentuale di tempo percorso, la velocità complessiva (μm/s), la distanza totale, il segmento medio percorso, il numero di volte in cui si è fermato e il numero di volte in cui è stato invertito. Il codice per la generazione, il tracciamento e la misurazione dei dati del chimografo è fornito come file di codifica supplementare 1.

Risultati

Sono state eseguite analisi chimografiche e di imaging su cellule vive per misurare la motilità dei mitocondri liberi marcati con Mito-RFP o dei mitocondri legati all'ER di larghezze di contatto strette (6 nm ± 1 nm) o sciolte (24 nm ± 3 nm) stabilizzate da MAM 1X o MAM 9X, rispettivamente, nel processo neuronale più lungo di ciascun neurone ReN GA (AD) o ReN (naïve) lungo almeno 500 nm, considerando questo come un assone (Figura 1 e

Discussione

L'inibizione del recettore sigma-1 (S1R) ha ridotto la stabilizzazione MAM nei processi neuronali e ha ridotto drasticamente (~90%) la generazione di Aβ dagli assoni ma non dal soma di un sistema di coltura tridimensionale (3D) di cellule progenitrici neurali umane (ReN) che esprimono mutazioni familiari di AD [FAD] nel gene della proteina precursore dell'amiloide [APP] (ReN GA)23,24,25,27

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well Glass Bottom Plate	Cellvis	P06-1.5H-N
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco/Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	R&D System	233-FB
BSA	Fisher Scientific	501781532
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DMEM/F12 with L-glutamine	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11320-033
EDTA	Life Technologies	41116134
EGF	Sigma-Aldrich	92090408
Falcon 6 Well Plates	VWR International	41122107
GAPDH Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-988
Gelatin	VWR International	9000-70-8
Graphpad Prism N/A	Prism 9, version 9.5.0	N/A
Heparin	Sigma-Aldrich	H0200000
ImageJ Software	ImageJ 1.53a	N/A
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
mCherry Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-34974
MS Excel	Microsoft Excel, version 2302	N/A
Multi-array electrochemiluminescence assay kit	Meso Scale Diagnostics (MSD)	K15200E-2	V-PLEX Aβ Peptide Panel 1 (6E10) kit
NaCl	Fisher Scientific	7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel	Invitrogen	NP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Lonza	17-745E
Photoshop	Adobe Photoshop CC 20.0.10	N/A
Rat Neuron Nucleofector Kit	Lonza	VPG-1003
StemPro Accutase	Gibco	A1110501
Tris-HCL, pH 7.6	Boston BioProducts	42000000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Fisher Scientific	501657287