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Neste Artigo

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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui, descrevemos a medição da taxa de transporte axonal de estabilizadores constitutivos de membranas do retículo endoplasmático (ER) associadas às mitocôndrias (MAMs), aumentando ou mantendo a geração de β-amilóide (Aβ) neurotóxico a partir de neurônios da doença de Alzheimer (DA) em tempo real para servir como uma métrica direta e quantitativa para medir a estabilização do MAM e auxiliar no desenvolvimento da terapêutica da DA.

Resumo

Um método para quantificar a estabilização das membranas do retículo endoplasmático associadas às mitocôndrias (MAMs) em um modelo neural tridimensional (3D) da doença de Alzheimer (DA) é apresentado aqui. Para começar, células ReN neuroprogenitoras humanas frescas que expressam proteína precursora de β-amilóide (APP) contendo doença de Alzheimer familiar (FAD) ou células ReN virgens são cultivadas em placas finas (1:100) de cultura de tecidos revestidas com Matrigel. Depois que as células atingem a confluência, elas são eletroporadas com plasmídeos de expressão que codificam a sequência de ligação às mitocôndrias conjugada com proteína de fluorescência vermelha (RFP) de AKAP1 (34-63) (Mito-RFP) que detecta mitocôndrias ou estabilizadores constitutivos de MAM MAM 1X ou MAM 9X que estabilizam MAMs apertados (6 nm ± 1 nm de largura de lacuna) ou soltos (24 nm ± 3 nm de largura de lacuna), respectivamente. Após 16-24 h, as células são colhidas e enriquecidas por um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS). Um número igual de células enriquecidas com FACS são semeadas na matriz tridimensional (Matrigel 1:1) e podem se diferenciar em neurônios maduros por 10 dias. As imagens de células vivas das células diferenciadas de 10 dias que expressam os estabilizadores MAM conjugados com RFP são capturadas sob um microscópio fluorescente equipado com uma câmara de cultura de imagem de células vivas mantendo o CO2 (5%), temperatura (37 ° C) e umidade (~ 90%). Para esse fim, realizamos imagens de células vivas e análises quimográficas para medir a motilidade das mitocôndrias livres marcadas com mito-RFP ou mitocôndrias ligadas a ER de larguras de gap estreitas ou soltas estabilizadas por MAM 1X ou MAM 9X, respectivamente, no processo neuronal mais estendido de cada neurônio ReN GA que tem pelo menos 500 nm de comprimento, considerando-os como axônios.

Introdução

Evidências emergentes sugerem que os contatos de retículo endoplasmático associados a mitocôndrias (MERCs) especializados, colhidos bioquimicamente como membranas ER associadas a mitocôndrias, muitas vezes chamados de MAMs 1,2, desempenham um papel em várias doenças neurodegenerativas, incluindo AD 3,4. Esses MAMs são compostos de microdomínios lipídicos ricos em colesterol no RE e na membrana externa das mitocôndrias amarrados por uma série de proteínas que criam diversidades estruturais e funcionais entre os MAMs 5,6,7. A hipótese MAM recentemente cunhada postula que o aumento de MAMs leva ao aumento da produção de Aβ e à cascata patogênica da DA, incluindo formação de emaranhado neurofibrilar (NFT), dishomeostase de cálcio e neuroinflamação 3,8. Cerca de 5% a 20% das mitocôndrias fazem contato físico com o RE para formar MAMs9. A largura da folga dos MAMs é determinada pelo ER suave e áspero (sER e rER, respectivamente). A largura variável da lacuna entre sER-mitocôndrias (10-50 nm) e rER-mitocôndrias (50-80 nm) sugere que a largura da lacuna dos MAMs tem um longo espectro que varia entre apertado (~ 10 nm) a solto (~ 80 nm) 10 , 11 , 12 , 13 . A largura da lacuna da MAM determina as funções da MAM, como a homeostase do cálcio e o transporte lipídico 1,14. Um relatório recente mostrou que os MAMs formados entre ER e mitocôndrias fortemente conectados (~ 10 nm), chamados MAMs completos, são apoptóticos. Em contraste, os MAMs formados entre o ER fracamente conectado (~ 25 nm) e as mitocôndrias, denominados MAMs defeituosos ou médios, são antiapoptóticos14 , 15 , 16 . A estabilização de MAMs com uma largura de lacuna de 6 nm ± 1 nm aumentou a geração de Aβ a partir de um novo modelo de cultura neural tridimensional (3D) de DA. Em contraste, a estabilização de MAMs com largura de lacuna de 24 nm ± 3 nm não tem efeito na geração de Aβ17. Essa descoberta sugere pela primeira vez que regular o grau de estabilização do MAM, mas não desestabilizar os MAMs, é a chave para regular a geração de Aβ. Uma tentativa de desestabilizar completamente os MAMs pode ter consequências indesejadas porque os MAMs mantêm vários eventos celulares críticos para a sobrevivência celular12.

A modulação de MAMs é uma área emergente de pesquisa com implicações potenciais para vários distúrbios, incluindo câncer, distúrbios metabólicos e doenças neurodegenerativas18. Apesar da disponibilidade de muitos moduladores de MAM, nenhuma grande tentativa foi feita até agora para testar suas habilidades de desestabilizar MAMs e diminuir a patologia da DA, principalmente porque as diversidades estruturais dos MAMs os tornam um sistema altamente complexo para a descoberta de medicamentos. Mas, a farmacologia de sistemas estruturais recém-desenvolvida, que considera as propriedades específicas dos alvos de drogas e seu ambiente18,19 deve superar as dificuldades e desenvolver drogas altamente potentes direcionadas a MAMs ou proteínas associadas a MAM na DA. No entanto, a busca por um modulador eficaz da estabilização do MAM requer métodos para quantificar o grau de estabilização do MAM com precisão. Técnicas tradicionais como microscopia eletrônica (EM) ou microscopia de super-resolução têm limitações na determinação da estabilização do MAM. Superar esses desafios provavelmente exigiria o desenvolvimento de novas técnicas de imagem mais dinâmicas ou ensaios bioquímicos que possam fornecer medidas quantitativas de estabilização de MAM em células vivas. A microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizados (FIB-SEM) de neurônios primários revelou que o ER tende a formar uma rede ao redor das mitocôndrias que provavelmente limitará a motilidade mitocondrial20,21. A interrupção dos sistemas de transporte mitocondrial, retrógrado, anterógrado ou ambos, teve um impacto profundo na função sináptica e neuronal22. Assim, a nova imagem de células vivas e a análise baseada em quimografia da velocidade axonal de mitocôndrias ligadas ao ER descritas aqui como uma métrica para medir quantitativamente a estabilização do MAM facilitarão a identificação do (s) modulador (es) do MAM que podem mudar o limiar de estabilização do MAM para um que mantém ou possivelmente diminui em oposição ao aumento da geração de Aβ.

Protocolo

Modelos de cultura neural AD: Este estudo utilizou neurônios derivados de células ReN progenitoras neurais humanas [ReN ingênuo (Millipore)] ou células ReN expressando mutações familiares de DA (fAD) no gene da proteína precursora de amilóide (APP) (APPSwe / Lon), células ReN GA. O sistema de cultura tridimensional (3D) ReN-GA recapitula a patologia da DA, ou seja, emaranhados neurofibrilares (NFTs) acionados por oligômero Aβ 23,24. Células ReN virgens estão disponíveis comercialmente. As linhas ReN GA foram obtidas do Dr. Doo Y. Kim, Professor Associado, Massachusetts General Hospital (MGH)23,24,25.

Plasmídeos de expressão: AKP1 (34-63) e sequência direcionada a ER de proteínas Ubc 6 (283-303) ligadas diretamente com RFP (Mito-RFP-ER denotado como MAM 1X) ou contêm um ligante de 9 aminoácidos (Mito-9X-RFP-ER denotado como MAM 9X) projetado para estabilizar MAMs de 6 nm ± 1 nm ou 24 nm + 3 nm larguras de lacuna, respectivamente15,26 (Figura 1A).

1. Eletroporação

  1. Transfecção das células com estabilizadores MAM (1-2 h)
    NOTA: Siga o protocolo descrito pelo fabricante do kit nucleofector (Tabela de Materiais). Antes de começar, prepare placas de cultura com fundo de vidro de 6 poços pré-revestidas com DMEM/F12 contendo 1% de Matrigel (doravante referida como matriz de membrana basal [BMM]). Use 2 mL de BMM para revestir cada poço. Incubar durante pelo menos 1 h a 37 °C. A BMM, o meio, as pontas das pipetas e as pipetas devem ser pré-arrefecidos antes de serem misturados para evitar que a BMM se solidifique.
    1. Aspirar a mistura BMM. Substitua por 2 mL de DMEM/F12 à temperatura ambiente (RT) em cada poço.
    2. Combine o Nucleofector com o Suplemento 1 em uma proporção de 4,5: 1 (82 μL: 18 μL de relação Nucleofector/Suplemento para 100 μL de solução). Para cada transfecção desejada, são necessários 100 μL de Nucleofector
    3. DNA de vórtice. Em seguida, adicione 1-5 μg de DNA (por tratamento) em tubos de microcentrífuga de 1 mL para cada transfecção.
    4. Use a acustase para colher uma placa de células ReN-GA saudáveis.
      NOTA: Células da placa em meio de expansão (Tabela 1) em placas de cultura de tecidos de 100 mm e aguarde até que a confluência atinja 70-80%.
      1. Aspire o meio existente e lave uma vez com 10 mL de PBS.
      2. Adicione 1 mL de acutase diretamente às células e incube por 5-10 min a 37 °C.
      3. Desaloje as células do prato batendo suavemente na lateral do prato. Verifique ao microscópio se as células estão soltas e fluindo livremente.
      4. Neutralize a acutase com 10 mL de DMEM/F12 e transfira para um tubo limpo de 15 mL.
      5. Centrifugue o número necessário de células a 274 x g durante 5 min e aspire o sobrenadante para remover as células mortas. Em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mL de DMEM/F12.
    5. Conte as células para determinar a densidade.
      NOTA: Neste estudo, um contador de células automatizado foi usado para contar o número de células. Por eletroporação, são necessárias 3-5 X 106 células (por exemplo, 5 tratamentos exigiriam 15-25 X 106 células).
      1. Pegue 10 μL das células suspensas e adicione ao lado A de uma câmara de contagem de células. Em seguida, adicione 10 μL ao lado B.
        NOTA: Adicione a suspensão celular inclinando a pipeta para o lado. Evite bolhas não empurrando além do primeiro batente no êmbolo da pipeta.
      2. Leve a câmara de contagem cheia para o contador de células e insira o lado A no slot principal na frente.
      3. Depois de pressionar Medir, anote o número de células por mL.
      4. Retire a câmara, vire para o lado B e repita as etapas 1.1.5.2-1.1.5.3.
      5. Some esses dois números, divida por 4 (se não estiver usando Trypan Blue) e multiplique o número pelos mililitros de líquido em que as células estão suspensas para obter o número total de células na suspensão.
    6. Centrifugue o número necessário de células a 274 x g por 5 min e aspire o sobrenadante.
    7. Ressuspenda o pellet em 100 μL de mistura de Nucleofector por eletroporação. (por exemplo, 500 μL para 5 tratamentos).
      NOTA: Deixar as células na solução de Nucleofector por mais de 15 minutos pode reduzir a viabilidade celular e a eficácia geral.
    8. Adicionar 100 μL da suspensão celular a um dos tubos contendo DNA e misturar por pipetagem.
    9. Transfira a mistura de DNA para uma cubeta de eletroporação e sele com a tampa fornecida. Para evitar a criação de bolhas, incline a cubeta para baixo e pipete lentamente.
    10. Selecione o programa Nucleofector apropriado para o dispositivo que está sendo usado. Para o dispositivo usado neste estudo, use o Programa A-033 para transfecção. Para otimizar, experimente todos os 5 programas Nucleofector para determinar o mais apropriado para cada tipo de célula.
      NOTA: Uma confirmação de uma eletroporação bem-sucedida é a espuma visível na parte superior da mistura.
    11. Imediatamente, usando as pipetas estéreis fornecidas, adicione ~ 500 μL do DMEM da placa pré-cheia de 6 poços na cubeta. Misture delicadamente uma vez e transfira as células eletroporadas e o meio para o poço correspondente.
      NOTA: Após a eletroporação, as células são extremamente sensíveis, portanto, transferir o meio rapidamente e pipetar com cuidado é essencial.
    12. Repita as etapas 1.1.8 a 1.1.11 para todos os tratamentos de DNA restantes.
    13. Incubar as células a 37 °C na presença de CO2 (5%) durante a noite.
    14. No dia seguinte, troque o meio por meio de diferenciação fresco (Tabela 2) e deixe as células se diferenciarem por 10 dias. A cada 2-3 dias, substitua por mídia nova.

2. Imagem de células vivas

  1. Preparação de células para microscopia de células vivas (30 min)
    1. Preparação da câmara de células vivas (antes de mover as células para a câmara)
    2. Certifique-se de que o tanque de CO2 e o umidificador estejam conectados à câmara, as válvulas estejam abertas e os tanques cheios.
    3. Defina a temperatura para 37 °C, o CO2 para 5% e a umidade para 95%. (Isso pode levar algum tempo para que os níveis se equilibrem).
    4. Coloque uma placa de 6 poços contendo células na câmara e ajuste o foco do microscópio até que as células se tornem visíveis.
    5. Ligue o laser (Tabela de Materiais).
    6. Para capturar o sinal RFP, excite o fluoróforo usando um laser de 594 nm e use a emissão de 570-640 nm. Para GFP, use um laser de 488 nm para excitação e emissão de 510-540 nm.
    7. Usando o filtro fluorescente embutido, ajuste a intensidade do sinal até que o sinal de fundo se dissipe (deve ser quase preto sólido).
  2. Captura de vídeo ao vivo de axônios (10 h-15 h no total)
    NOTA: Um microscópio confocal invertido Nikon C2 Eclipse Ti2 foi usado para capturar imagens fluorescentes usando o software NIS Element AR. Use ampliação de 60x em uma resolução de 512 pixels, gravando vídeos a 1 quadro por segundo por 3 minutos produziu quimógrafos mais limpos.
    1. Encontre uma célula que expresse biossensores RFP. Exporte uma imagem da célula para referência posterior antes de gravar um vídeo.
    2. Corte a área de varredura para caber ao redor do axônio. O uso de uma área de varredura menor reduz o tempo de processamento do microscópio e torna a geração de quimografia muito mais fácil.
    3. Desligue todos os lasers para ajudar o software a funcionar com mais facilidade. Observe que, quando o programa é executado com todos os lasers ativos, nem todos os quadros são capturados.
      NOTA: O sinal fluorescente vermelho do soma é muito mais brilhante do que no axônio. Portanto, o soma é excluído para aumentar a intensidade geral do sinal no axônio. Vá para a guia Medição de tempo .
    4. Defina o intervalo para 1 quadro por segundo e defina o tempo geral em 181 s.
    5. Clique em Executar.
    6. Salve este arquivo como um arquivo .nds (devidamente rotulado) e repita o processo ~ 10 vezes por estabilizadores MAM (MAM 1X ou MAM 9X).
      NOTA: A força do laser às vezes produzia um efeito de branqueamento perceptível no sinal RFP se escaneado por muito tempo. É importante considerar trabalhar rapidamente para capturar vídeos.

3. Pós-processamento (7 dias)

NOTA: Para analisar o transporte e gerar quimógrafos, foram utilizadas macros Fiji ImageJ. As vesículas que se deslocaram menos de 0,1 mm/s foram categorizadas como estacionárias. A frequência de movimento das partículas foi calculada dividindo-se o número de partículas que se movem em uma determinada direção (anterógrada, retrógrada) ou não se movem (estacionária) pelo número total de partículas analisadas no quimógrafo. O tempo que cada vesícula passou pausando ou se movendo foi calculado pela média da porcentagem de tempo gasto em cada condição para todas as vesículas em cada neurônio analisado. A distribuição de frequência para velocidade e comprimento de corrida foi calculada usando apenas vesículas móveis para cada condição experimental. A análise foi realizada em tratos axonais de 100 mm por 3 min.

  1. Gerando um quimógrafo
    1. Abra o arquivo .nds no Fiji ImageJ.
    2. Vá para a guia Imagem e clique em Propriedades. Registre a proporção de pixel para mícron. Isso é necessário para o cálculo posterior.
    3. Clique em Arquivo > Salvar como > Tiff para salvar o arquivo como um .tiff em sua pasta (a macro salvará automaticamente tudo o que for gerado nesta pasta).
    4. Arraste a macro Kymo para ImageJ. O código é fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Clique em Executar.
    5. Não clique em OK. Alterne para a janela MAX_raw. Clique manualmente com o botão esquerdo ao longo do axônio e clique duas vezes para encerrar o rastreamento.
      NOTA: Certifique-se de rastrear o axônio do soma para o terminal do axônio. Desta forma, os cálculos anterógrados e retrógrados estarão corretos.
    6. Pressione o comando T ou Adicionar no gerenciador de ROI.
    7. Agora clique em OK. Um quimógrafo será gerado na pasta feita anteriormente. (O eixo X é o comprimento do axônio em mícrons e o eixo Y é o tempo em segundos).
  2. Rastreando o quimógrafo
    1. Arraste o quimógrafo para Fiji Image J (deve ser colocado automaticamente na pasta feita anteriormente).
    2. Arraste a macro Trilha para a Imagem J.
    3. No prompt a seguir, clique em Ok. Se estiver retomando o trabalho de antes, insira o ponto numérico para continuar e pressione Ok.
    4. Usando a ferramenta Retângulo no painel Selecionar , selecione uma área próxima ao meio do quimógrafo que tenha 60 pixels de altura e sempre 100 μm de diâmetro. Para fazer isso, divida 100 pela proporção de pixel para micro que foi registrada na etapa 3.1.2.
    5. Depois de selecionar uma área, pressione Ctrl T para adicionar i t ao ROI e salve o ROI na pasta que está sendo trabalhada (pressione Mais no menu ROI e depois Salvar).
      NOTA: Inverter a área selecionada pressionando Ctrl+Shift+I facilitará o rastreamento.
    6. Para rastrear o movimento de uma vesícula individual, segure Ctrl enquanto clica com o botão esquerdo de cima para baixo.
    7. Para ser feito, segure Ctrl enquanto clica com o botão direito do mouse e uma janela aparecerá mostrando onde os axônios são rastreados. Se isso parecer bom, pressione Ok.
    8. Para continuar e selecionar outra vesícula, clique em Sim e repita o processo das etapas 3.2.6 a 3.2.8. Depois que todas as vesículas visíveis forem rastreadas, pressione Não. Isso salvará automaticamente a sobreposição rastreada manualmente na mesma pasta.
  3. Medindo os dados do quimógrafo
    1. Crie uma nova pasta. Arraste todos os arquivos de texto gerados para a pasta.
    2. Abra o arquivo do quimógrafo e registre as dimensões.
    3. Arraste a macro Medida para a Imagem J.
    4. Insira a proporção de mícron para pixel registrada anteriormente em PixelScale.
    5. Altere o limite de velocidade baixo para 0,1. (As vesículas que se movem abaixo deste limite são consideradas estacionárias).
    6. Insira as dimensões do quimógrafo registradas anteriormente. O arquivo de resumo será gerado automaticamente na pasta de texto criada. Cada preenchimento de resumo conterá %Tempo Percorrido, Velocidade Geral (μm/s), Distância Total, Segmento Médio Percorrido, Número de Vezes Parado e Número de Vezes Revertido. O código para gerar, rastrear e medir os dados do quimógrafo é fornecido como Arquivo de Codificação Suplementar 1.

Resultados

Imagens de células vivas e análises quimográficas foram realizadas para medir a motilidade de mitocôndrias livres marcadas com mito-RFP ou mitocôndrias ligadas a ER de larguras de contato apertadas (6 nm ± 1 nm) ou soltas (24 nm ± 3 nm) estabilizadas por MAM 1X ou MAM 9X, respectivamente, no processo neuronal mais longo de cada neurônio ReN GA (AD) ou ReN (ingênuo) com pelo menos 500 nm de comprimento, considerando-o como um axônio (Figura 1 e

Discussão

A inibição do receptor sigma-1 (S1R) regulou negativamente a estabilização do MAM nos processos neuronais e reduziu drasticamente (~ 90%) a geração de Aβ a partir de axônios, mas não de soma de um sistema de cultura tridimensional (3D) de células progenitoras neurais humanas (ReN) expressando mutações familiares de DA [FAD] no gene da proteína precursora de amilóide [APP] (ReN GA) 23 , 24 ,

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. György Hajnóczky, Professor da Thomas Jefferson University, Filadélfia, por generosamente nos fornecer plasmídeos de expressão que codificam RFP-Mito, MAM 1X, MAM 9X e MAM 18X. Um agradecimento especial ao Dr. Lai Ding, Cientista Sênior de Imagens, Brigham and Women's Hospital por nos ajudar a escrever o código para gerar, rastrear e medir os dados do quimiograma. Este estudo foi apoiado pelo Cure Alzheimer's Fund para RB e NIH grant 5R01NS045860-20 para RET.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
6 Well Glass Bottom PlateCellvisP06-1.5H-N
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco/Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D System 233-FB
BSAFisher Scientific501781532
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10283
DMEM/F12 with L-glutamine Gibco/Thermo Fisher Scientific11320-033
EDTA  Life Technologies41116134
EGFSigma-Aldrich92090408
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH Polyclonal AntibodyThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatin VWR International9000-70-8
Graphpad Prism N/APrism 9, version 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich H0200000
ImageJ Software ImageJ 1.53aN/A
Matrigel Basement Membrane Matrix  Corning356234
mCherry Polyclonal AntibodyInvitrogenPA5-34974
MS Excel  Microsoft Excel, version 2302N/A
Multi-array electrochemiluminescence assay kitMeso Scale Diagnostics (MSD)K15200E-2V-PLEX Aβ Peptide Panel 1 (6E10) kit
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Rat Neuron Nucleofector KitLonzaVPG-1003
StemPro Accutase GibcoA1110501
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referências

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