Análisis cuantitativo de la estabilización de la membrana del retículo endoplásmico (MAM) asociada a mitocondrias en un modelo neural de la enfermedad de Alzheimer (EA)

Resumen

Aquí, describimos la medición de la tasa de transporte axonal de los estabilizadores constitutivos de las membranas del retículo endoplásmico (RE) (MAM) asociadas a las mitocondrias mediante el aumento o el mantenimiento de la generación de β-amiloide (Aβ) neurotóxica de las neuronas de la enfermedad de Alzheimer (EA) en tiempo real para que sirva como una métrica directa y cuantitativa para medir la estabilización de MAM y ayudar al desarrollo de terapias para la EA.

Resumen

Aquí se presenta un método para cuantificar la estabilización de las membranas del retículo endoplásmico (MAM) asociadas a las mitocondrias en un modelo neuronal tridimensional (3D) de la enfermedad de Alzheimer (EA). Para empezar, las células ReN neuroprogenitoras humanas frescas que expresan β-proteína precursora de amiloide (APP) que contiene enfermedad de Alzheimer familiar (FAD) o células ReN ingenuas se cultivan en placas de cultivo de tejidos delgadas (1:100) recubiertas de Matrigel. Una vez que las células alcanzan la confluencia, estas se electroporan con plásmidos de expresión que codifican la secuencia de unión a mitocondrias conjugadas con la proteína de fluorescencia roja (RFP) de AKAP1(34-63) (Mito-RFP) que detecta mitocondrias o estabilizadores MAM constitutivos MAM 1X o MAM 9X que estabilizan MAMs apretados (6 nm ± 1 nm de ancho de espacio) o sueltos (24 nm ± 3 nm de ancho de brecha), respectivamente. Después de 16-24 h, las células se cosechan y enriquecen mediante un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). Un número igual de células enriquecidas con FACS se siembran en la matriz tridimensional (1:1 Matrigel) y se les permite diferenciarse en neuronas maduras durante 10 días. Las imágenes de células vivas de las células diferenciadas de 10 días que expresan los estabilizadores MAM conjugados con RFP se capturan bajo un microscopio fluorescente equipado con una cámara de cultivo de imágenes de células vivas que mantiene el CO₂ (5%), la temperatura (37 °C) y la humedad (~90%). Con este fin, realizamos imágenes de células vivas y análisis cimográficos para medir la motilidad de las mitocondrias libres marcadas con Mito-RFP o mitocondrias unidas a ER de anchos de espacio estrechos o sueltos estabilizadas por MAM 1X o MAM 9X, respectivamente, en el proceso neuronal más extendido de cada neurona ReN GA que tiene al menos 500 nm de largo, considerándolos como axones.

Introducción

La evidencia emergente sugiere que los contactos especializados del retículo endoplásmico (MERCs) asociados a las mitocondrias, recolectados bioquímicamente como membranas RE asociadas a las mitocondrias, a menudo denominadas MAMs ^1,2 desempeñan un papel en varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la EA ^3,4. Estos MAMs están compuestos por microdominios lipídicos ricos en colesterol en el RE y en la membrana externa de las mitocondrias unidos por una serie de proteínas que crean diversidades estructurales y funcionales entre los MAMs ^5,6,7. La hipótesis de la MAM recientemente acuñada postula que el aumento de las MAM conduce a una mayor producción de Aβ y a la cascada patogénica de la EA, incluida la formación de ovillos neurofibrilares (NFT), la dishomeostasis del calcio y la neuroinflamación ^3,8. Alrededor del 5%-20% de las mitocondrias entran en contacto físico con el RE para formar MAMs⁹. El ancho del espacio de los MAM está determinado por el ER suave y rugoso (sER y rER, respectivamente). La anchura de brecha variable entre sER-mitocondrias (10-50 nm) y rER-mitocondrias (50-80 nm) sugiere que la anchura de brecha de los MAM tiene un espectro largo que oscila entre estrecho (~10 nm) y suelto (~80 nm)10,11,12,13. La anchura del espacio MAM determina las funciones de MAM, como la homeostasis del calcio y el transporte de lípidos ^1,14. Un informe reciente ha demostrado que los MAMs formados entre el RE estrechamente conectado (~10 nm) y las mitocondrias, llamados MAMs completos, son apoptóticos. Por el contrario, los MAMs formados entre el RE débilmente conectado (~25 nm) y las mitocondrias, denominados MAMs defectuosos o medianos, son antiapoptóticos 14,15,16. La estabilización de MAMs con un ancho de separación de 6 nm ± 1 nm aumentó la generación de Aβ a partir de un nuevo modelo de cultivo neuronal tridimensional (3D) de AD. Por el contrario, la estabilización de MAMs con un ancho de separación de 24 nm ± 3 nm no tiene ningún efecto sobre la generación Aβ¹⁷. Este hallazgo sugiere por primera vez que regular el grado de estabilización de MAM, pero no desestabilizar los MAM, es la clave para regular la generación de Aβ. Un intento de desestabilizar completamente los MAMs puede tener consecuencias no deseadas porque los MAMs mantienen varios eventos celulares críticos para la supervivencia celular¹².

La modulación de los MAMs es un área emergente de investigación con implicaciones potenciales para diversos trastornos, incluyendo el cáncer, los trastornos metabólicos y las enfermedades neurodegenerativas¹⁸. A pesar de la disponibilidad de muchos moduladores de MAM, hasta ahora no se ha hecho ningún intento importante para probar su capacidad para desestabilizar los MAMs y reducir la patología de la EA, principalmente porque las diversidades estructurales de los MAMs los convierten en un sistema muy complejo para el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, la farmacología de sistemas estructurales recientemente desarrollada, que considera las propiedades específicas de las dianas farmacológicas y su entorno^18,19, debería superar las dificultades y desarrollar fármacos altamente potentes dirigidos a los MAM o a las proteínas asociadas a MAM en la EA. Sin embargo, la búsqueda de un modulador eficaz de la estabilización de MAM requiere métodos para cuantificar con precisión el grado de estabilización de MAM. Las técnicas tradicionales como la microscopía electrónica (EM) o la microscopía de superresolución tienen limitaciones para determinar la estabilización de MAM. Superar estos desafíos probablemente requeriría el desarrollo de técnicas de imagen novedosas y más dinámicas o ensayos bioquímicos que puedan proporcionar medidas cuantitativas de la estabilización de MAM en células vivas. La microscopía electrónica de barrido por haz de iones focalizada (FIB-SEM) de neuronas primarias reveló que el RE tiende a formar una red alrededor de las mitocondrias que probablemente limite la motilidad mitocondrial^20,21. La interrupción de los sistemas de transporte mitocondrial, ya sea retrógrado, anterógrado o ambos, tuvo un profundo impacto en la función sináptica y neuronal²². Por lo tanto, el novedoso análisis basado en imágenes de células vivas y en la cimografía de la velocidad axonal de las mitocondrias unidas a RE descrito aquí como una métrica para medir cuantitativamente la estabilización de MAM facilitará la identificación de moduladores de MAM que pueden cambiar el umbral de estabilización de MAM a uno que mantenga o posiblemente disminuya en lugar de aumentar la generación de Aβ.

Protocolo

Modelos de cultivo neuronal de EA: En este estudio se utilizaron neuronas derivadas de células ReN progenitoras neurales humanas [ReN naïve (Millipore)] o células ReN que expresan mutaciones familiares de la EA (fAD) en el gen de la proteína precursora de amiloide (APP) (APP^Swe/Lon), células ReN GA. El sistema de cultivo tridimensional (3D) ReN-GA recapitula la patología de la EA, a saber, los oligómeros Aβ oligómeros (NFT) ^23,24. Las células ReN ingenuas están disponibles comercialmente. Las líneas ReN GA se obtuvieron del Dr. Doo Y. Kim, Profesor Asociado, Hospital General de Massachusetts (MGH)23,24,25.

Plásmidos de expresión: AKP1 (34-63) y la secuencia de proteínas Ubc 6 (283-303) enlazadas directamente con RFP (Mito-RFP-ER denotada como MAM 1X) o contienen un enlazador de 9 aminoácidos (Mito-9X-RFP-ER denotado como MAM 9X) diseñado para estabilizar MAMs de 6 nm ± 1 nm o 24 nm + 3 nm anchos de espacio, respectivamente ^15,26 (Figura 1A).

1. Electroporación

1. Transfectación de las células con estabilizadores MAM (1-2 h)
   NOTA: Siga el protocolo descrito por el fabricante del kit de nucleofactor (Tabla de materiales). Antes de comenzar, prepare placas de cultivo de 6 pocillos con fondo de vidrio pre-recubiertas con DMEM/F12 que contengan un 1% de Matrigel (en adelante, matriz de membrana basal [BMM]). Use 2 mL de BMM para cubrir cada pocillo. Incubar durante al menos 1 h a 37 °C. El BMM, los medios, las puntas de pipeta y las pipetas deben enfriarse previamente antes de mezclar para evitar que el BMM se solidifique.
   1. Aspire la mezcla de BMM. Reemplace con 2 mL de DMEM/F12 a temperatura ambiente (RT) en cada pocillo.
   2. Combine Nucleofector con Suplemento 1 en una proporción de 4,5:1 (82 μL:18 μL de proporción Nucleofector/Suplemento para 100 μL de solución). Para cada transfección deseada, se necesitan 100 μL de Nucleofector.
   3. ADN de vórtice. A continuación, añadir 1-5 μg de ADN (por tratamiento) en tubos de microcentrífuga de 1 mL para cada transfección.
   4. Use acustase para recolectar una placa de células ReN-GA sanas.
      NOTA: Coloque las células en placas en medios de expansión (Tabla 1) en placas de cultivo de tejidos de 100 mm y espere hasta que la confluencia alcance el 70-80%.
      1. Aspire el medio existente y lávese una vez con 10 mL de PBS.
      2. Añadir 1 mL de acutasa directamente a las células e incubar durante 5-10 min a 37 °C.
      3. Desaloje las células del plato golpeando suavemente el costado del plato. Revise bajo un microscopio para asegurarse de que las células estén aflojadas y fluyan libremente.
      4. Neutralice la acutasa con 10 mL de DMEM/F12 y transfiérala a un tubo limpio de 15 mL.
      5. Centrifugar el número requerido de células a 274 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante para eliminar las células muertas. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 10 mL de DMEM/F12.
   5. Cuente las celdas para determinar la densidad.
      NOTA: En este estudio, se utilizó un contador de células automatizado para contar el número de células. Por electroporación, se necesitan 3-5 X 10⁶ celdas (por ejemplo, 5 tratamientos requerirían 15-25 X 10⁶ celdas).
      1. Tome 10 μL de las células suspendidas y añádalas al lado A de una cámara de recuento de células. A continuación, añada 10 μL al lado B.
         NOTA: Añada la suspensión de células inclinando la pipeta hacia un lado. Evite las burbujas al no empujar más allá del primer tope en el émbolo de la pipeta.
      2. Lleve la cámara de conteo llena al contador de celdas e inserte el lado A en la ranura principal de la parte delantera.
      3. Después de presionar Medir, anote el número de celdas por mL.
      4. Saque la cámara, voltee al lado B y repita los pasos 1.1.5.2-1.1.5.3.
      5. Suma estos dos números, luego divídelos por 4 (si no usas Trypan Blue), luego multiplica el número por los mililitros de líquido en los que están suspendidas las celdas para obtener el número total de celdas en la suspensión.
   6. Centrifugar el número requerido de células a 274 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
   7. Resuspender el pellet en 100 μL de mezcla Nucleofector por electroporación. (p. ej., 500 μL para 5 tratamientos).
      NOTA: Dejar las células en la solución Nucleofector durante más de 15 minutos podría reducir la viabilidad celular y la eficacia general.
   8. Añadir 100 μL de la suspensión celular a uno de los tubos que contienen ADN y mezclar mediante pipeteo.
   9. Transfiera la mezcla de ADN a una cubeta de electroporación y selle con la tapa provista. Para evitar la creación de burbujas, incline la cubeta hacia abajo y pipetee lentamente.
   10. Seleccione el programa Nucleofector apropiado para el dispositivo que se está utilizando. Para el dispositivo utilizado en este estudio, utilice el Programa A-033 para la transfección. Para optimizar, pruebe los 5 programas de Nucleofector para determinar el más apropiado para cada tipo de célula.
       NOTA: Una confirmación de una electroporación exitosa es la espuma visible en la parte superior de la mezcla.
   11. Inmediatamente, utilizando las pipetas estériles suministradas, añada ~500 μL de DMEM de la placa de 6 pocillos precargada a la cubeta. Mezcle suavemente una vez y luego transfiera las celdas electroporadas y el medio al pocillo correspondiente.
       NOTA: Después de la electroporación, las celdas son extremadamente sensibles, por lo que es esencial transferir los medios rápidamente y pipetear con cuidado.
   12. Repita los pasos 1.1.8-1.1.11 para todos los tratamientos de ADN restantes.
   13. Incubar las células a 37 °C en presencia de CO₂ (5%) durante la noche.
   14. Al día siguiente, intercambie los medios con medios de diferenciación nuevos (Tabla 2) y permita que las células se diferencien durante 10 días. Cada 2-3 días, reemplácelo con medios nuevos.

2. Imágenes de células vivas

1. Preparación de células para microscopía de células vivas (30 min)
   1. Preparación de la cámara de células vivas (antes de mover las células a la cámara)
   2. Asegúrese de que el tanque de_CO2 y el humidificador estén conectados a la cámara, que las válvulas estén abiertas y que los tanques estén llenos.
   3. Ajuste la temperatura a 37 °C, el CO₂ al 5% y la humedad al 95%. (Esto puede llevar algún tiempo para que los niveles se equilibren).
   4. Coloque una placa de 6 pocillos que contenga células en la cámara y ajuste el enfoque del microscopio hasta que las células se vuelvan visibles.
   5. Encienda el láser (Tabla de Materiales).
   6. Para capturar la señal RFP, excite el fluoróforo con un láser de 594 nm y use una emisión de 570-640 nm. Para GFP, use un láser de 488 nm para la excitación y la emisión de 510-540 nm.
   7. Con el filtro fluorescente incorporado, ajuste la intensidad de la señal hasta que la señal de fondo se haya disipado (debe ser casi negra sólida).
2. Captura de vídeo en directo de los axones (10 h-15 h en total)
   NOTA: Se utilizó un microscopio confocal invertido Nikon C2 Eclipse Ti2 para capturar imágenes fluorescentes utilizando el software NIS Element AR. Utilice un aumento de 60x a una resolución de 512 píxeles, tomando vídeos a 1 fotograma por segundo durante 3 minutos produciendo kymographs más limpios.
   1. Encuentre una célula que exprese biosensores RFP. Exporte una imagen de la celda para referencia posterior antes de tomar un video.
   2. Recorte el área de escaneo para que quepa alrededor del axón. El uso de un área de escaneo más pequeña reduce el tiempo de procesamiento del microscopio y facilita mucho la generación de la cimografía.
   3. Apague todos los láseres para ayudar a que el software funcione sin problemas. Tenga en cuenta que cuando el programa se ejecuta con todos los láseres activos, no se capturan todos los fotogramas.
      NOTA: La señal fluorescente roja del soma es mucho más brillante que la del axón. Por lo tanto, se excluye el soma para aumentar la intensidad general de la señal en el axón. Vaya a la pestaña Medición de tiempo .
   4. Establezca el intervalo en 1 fotograma por segundo y establezca el tiempo total en 181 s.
   5. Haga clic en Ejecutar.
   6. Guarde este archivo como un archivo .nds (debidamente etiquetado) y repita el proceso ~ 10 veces por estabilizadores MAM (MAM 1X o MAM 9X).
      NOTA: La potencia del láser a veces produce un efecto de blanqueo notable en la señal RFP si se escanea durante demasiado tiempo. Es importante tener en cuenta el trabajo rápido para capturar videos.

3. Post-procesamiento (7 días)

NOTA: Para analizar el transporte y generar kymographs, se utilizaron macros Fiji ImageJ. Las vesículas que se movieron menos de 0,1 mm/s se clasificaron como estacionarias. La frecuencia del movimiento de las partículas se calculó dividiendo el número de partículas que se mueven en una dirección determinada (anterógrada, retrógrada) o que no se mueven (estacionarias) por el número total de partículas analizadas en el quimograma. El tiempo que cada vesícula pasó en pausa o en movimiento se calculó promediando el porcentaje de tiempo pasado en cada condición para todas las vesículas en cada neurona analizada. La distribución de frecuencias para la velocidad y la longitud de la carrera se calculó utilizando solo vesículas móviles para cada condición experimental. El análisis se realizó en tractos axonales de 100 mm durante 3 min.

1. Generación de un kymograph
   1. Abra el archivo .nds en Fiji ImageJ.
   2. Vaya a la pestaña Imagen y haga clic en Propiedades. Registre la relación píxel a micra. Esto es necesario para el cálculo posterior.
   3. Haga clic en Archivo > Guardar como > Tiff para guardar el archivo como un .tiff en su carpeta (la macro guardará automáticamente todo lo generado en esta carpeta).
   4. Arrastre la macro Kymo a ImageJ. El código se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 1. Haga clic en Ejecutar.
   5. No presione OK. Cambie a la ventana de MAX_raw. Haga clic con el botón izquierdo manualmente a lo largo del axón y haga doble clic para finalizar el seguimiento.
      NOTA: Asegúrese de seguir el axón desde el soma hasta el terminal del axón. De esta manera los cálculos anterógrados y retrógrados serán correctos.
   6. Presione el comando T o Agregar en el administrador de ROI.
   7. Ahora haga clic en Aceptar. Se generará un kymograph en la carpeta realizada anteriormente. (El eje X es la longitud del axón en micras y el eje Y es el tiempo en segundos).
2. Seguimiento del quimógrafo
   1. Arrastre el kymograph a la imagen J de Fiji (debería colocarse automáticamente en la carpeta realizada anteriormente).
   2. Arrastre la macro Pista a la imagen J.
   3. En el siguiente mensaje, haga clic en Aceptar. Si reanuda el trabajo desde antes, introduzca el punto numérico desde el que desea continuar y, a continuación, pulse Aceptar.
   4. Con la herramienta Rectángulo del panel Seleccionar , seleccione un área cerca del centro del cimógrafo que tenga 60 píxeles de altura y siempre 100 μm de ancho. Para ello, divida 100 por la relación píxel-micro que se registró en el paso 3.1.2.
   5. Después de seleccionar un área, presione Ctrl T para agregar i t al ROI y guardar el ROI en la carpeta en la que se está trabajando (presione Más en el menú ROI y luego Guardar).
      NOTA: Invertir el área seleccionada presionando Ctrl + Shift + I facilitará el seguimiento.
   6. Para seguir el movimiento de una vesícula individual, mantenga presionada la tecla Ctrl mientras hace clic con el botón izquierdo de arriba a abajo.
   7. Para hacerlo, mantenga presionada la tecla Ctrl mientras hace clic con el botón derecho y aparecerá una ventana que muestra dónde se rastrean los axones. Si esto se ve bien, presione Aceptar.
   8. Para continuar y seleccionar otra vesícula, haga clic en Sí y repita el proceso de los pasos 3.2.6-3.2.8. Una vez que se haya rastreado cada vesícula visible, presione No. Esto guardará automáticamente la superposición con seguimiento manual en la misma carpeta.
3. Medición de los datos del cimograma
   1. Cree una nueva carpeta. Arrastre todos los archivos de texto generados a la carpeta.
   2. Abra el archivo de quimógrafo y registre las dimensiones.
   3. Arrastre la macro Medir a la imagen J.
   4. Introduzca la relación entre micras y píxeles registrada anteriormente en PixelScale.
   5. Cambie el límite de velocidad bajo a 0.1. (Las vesículas que se mueven por debajo de este límite se consideran estacionarias).
   6. Introduzca las dimensiones del kymograph registradas anteriormente. El archivo de resumen se generará automáticamente en la carpeta de texto creada. Cada relleno de resumen contendrá el % de tiempo recorrido, la velocidad total (μm/s), la distancia total, el segmento medio recorrido, el número de veces que se detuvo y el número de veces que se invirtió. El código para generar, rastrear y medir los datos del kymograph se proporciona como Archivo de codificación suplementario 1.

Resultados

Se realizaron imágenes de células vivas y análisis cimográficos para medir la motilidad de las mitocondrias libres marcadas con Mito-RFP o mitocondrias unidas a ER de anchos de contacto estrechos (6 nm ± 1 nm) o sueltos (24 nm ± 3 nm) estabilizados por MAM 1X o MAM 9X, respectivamente, en el proceso neuronal más largo de cada neurona ReN GA (AD) o ReN (naïve) que tenga al menos 500 nm de largo, considerándolo como un axón (Figura 1 y

Discusión

La inhibición del receptor sigma-1 (S1R) disminuyó la estabilización de MAM en los procesos neuronales y redujo drásticamente (~90%) la generación de Aβ a partir de axones pero no de soma de un sistema de cultivo tridimensional (3D) de células progenitoras neurales humanas (ReN) que expresan mutaciones familiares de AD [FAD] en el gen de la proteína precursora de amiloide [APP] (ReN GA)23,24,25,27

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well Glass Bottom Plate	Cellvis	P06-1.5H-N
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco/Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	R&D System	233-FB
BSA	Fisher Scientific	501781532
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DMEM/F12 with L-glutamine	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11320-033
EDTA	Life Technologies	41116134
EGF	Sigma-Aldrich	92090408
Falcon 6 Well Plates	VWR International	41122107
GAPDH Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-988
Gelatin	VWR International	9000-70-8
Graphpad Prism N/A	Prism 9, version 9.5.0	N/A
Heparin	Sigma-Aldrich	H0200000
ImageJ Software	ImageJ 1.53a	N/A
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	356234
mCherry Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-34974
MS Excel	Microsoft Excel, version 2302	N/A
Multi-array electrochemiluminescence assay kit	Meso Scale Diagnostics (MSD)	K15200E-2	V-PLEX Aβ Peptide Panel 1 (6E10) kit
NaCl	Fisher Scientific	7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel	Invitrogen	NP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Lonza	17-745E
Photoshop	Adobe Photoshop CC 20.0.10	N/A
Rat Neuron Nucleofector Kit	Lonza	VPG-1003
StemPro Accutase	Gibco	A1110501
Tris-HCL, pH 7.6	Boston BioProducts	42000000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Fisher Scientific	501657287