用半发酵无菌日粮饲养 Axenic Delia antiqua

摘要

描述了用半发酵无菌日粮饲养 axenic Delia antiqua 的简单程序。使用PCR方法在每龄的Axenic D. antiqua 中仅检测到一种沃尔巴克氏菌株。

摘要

Axenic昆虫是从使用无菌培养基的无菌人工饲养系统中获得的。这些昆虫的特点是体型小、生长周期短、饲料要求低，是研究微生物与宿主之间关系的理想选择。肠道菌群显著影响昆虫宿主的生理特性，将特定菌株引入昆虫中提供了一种验证肠道微生物功能的方法。 Delia antiqua 是双翅目、Anthomyiidae 科和 Delia 属的一种威胁性害虫，主要以洋葱、大蒜、韭菜和百合科的其他蔬菜为食。它的幼虫以鳞茎为食，导致整株植物腐烂、枯萎甚至死亡。通过饲养蛤蜊幼虫，可以进行后续研究，观察肠道菌群对 古蛾生长发育的影响。与涉及抗生素消除相关微生物的方法不同，本文提出了一种低成本和高效的方法来培养 axenen D. antiqua。对 古蛾 卵进行表面灭菌后，采用半发酵无菌日粮饲养幼虫，通过培养依赖性和培养非依赖性试验验证 了古蛾 的轴质状态。总之，昆虫卵灭菌和幼虫培养无菌日粮的制备相结合，能够开发出一种有效和简单的方法来获得 Axenic D. antiqua。该方法为研究昆虫-微生物群落的相互作用提供了一种强有力的方法。

引言

Axenic 动物，定义为无法检测到活微生物或寄生虫的动物，是研究宿主-微生物相互作用的有价值的实验模型 ^1,2。昆虫是最大的无脊椎动物类群，可以与微生物形成共生关系³.Axenic 昆虫可用于研究共生系统中的宿主-共生体相互作用⁴.例如，Nishide等人^[5]为恶臭蠕虫Plautia stali建立了一种实用的无菌饲养程序，能够可靠而严格地分析模型共生系统中的宿主-共生体相互作用。Axenic昆虫可以通过对卵阶段进行消毒并向幼虫和成虫提供无菌食物^来产生6,7。Axenic昆虫具有重要意义，在生物学研究中被广泛使用。例如，Somerville等人^{进行的一项研究[8}]表明，接种阴沟肠杆菌的菱形蛾提高了转基因雄性的适应性。

Delia antiqua Meigen 是全球洋葱和其他百合科作物的一种具有重要经济意义的害虫，其幼虫会破坏洋葱和其他百合科作物的鳞茎⁹.D. antiqua 主要分布在温带气候中，广泛分布于美洲、欧洲和亚洲的洋葱种植区。如果控制不当，可导致洋葱（洋葱）、大蒜（Allium sativum L.）、青葱（Allium fistulosum L.）和韭菜（Alliumchoenoprasum L.）的作物损失，从50%到100%^不等10,11。幼虫以植物的地下部分为食，这种进食导致幼苗枯萎并最终死亡。此外，受损的植物可以使病原体进入，导致鳞茎腐烂¹²。即使这些植物没有被幼虫完全吃掉，它们造成的损害也会使洋葱植物无法销售并导致经济损失。

昆虫与肠道微生物群密切相关，大多数昆虫肠道含有多种共生细菌，这些细菌在宿主提供的营养物质中茁壮成长^13,14。Jing等^[15]表明，肠道共生群落的主要功能是提供必需的营养物质，其次是消化和解毒相关的功能。在某些情况下，肠道细菌可以作为害虫管理目的的微生物资源。因此，研究单个肠道细菌在 D. antiqua 体内的表现和特定功能是可取的。因此，制备轴幼虫对于研究特定细菌菌株与昆虫之间的相互作用尤为重要¹⁶。目前，消除昆虫肠道细菌的常用方法是使用抗生素组合来根除相关微生物17,18,19。与单独使用抗生素只能减少微生物数量不同，昆虫的轴性饲养可以控制微生物的组成和数量，从而更准确地验证肠道微生物群的功能。

因此，本文介绍了一种制备和饲养 axenic D. antiqua 的方案。Axenic幼虫食品是通过利用天然饮食的高温杀菌与半发酵食品相结合而获得的。按照实验方案对卵进行灭菌以获得斧头虫卵，最后，从斧头卵中培养斧头幼虫。在实验中，轴性饲养系统仅进行了一代。这将为研究昆虫与肠道微生物群之间的相互作用提供便利。

研究方案

D. antiqua 产自泰安市樊镇田间。

1.无菌饮食的制备

1. 剥掉葱的外层，丢弃绿叶。保留葱的白色部分（图1A）并用无菌水清洗，重复漂洗过程三次。用剪刀将葱的白色部分切成1-2厘米的丁块（见 材料表），用75%EtOH溶液（在步骤2.5中提到）灭菌，以备后用。
2. 称取 50 克葱丁并将它们放入食品加工机中（见 材料表）。加入 50 mL 灭菌水，研磨五次，每次 2 分钟。所有切成丁的葱都应磨成糊状稠度（图2A）。
3. 用镊子将10片3龄幼虫转移到含有10mL 1x PBS的10mL离心管中，并用一次性研磨杵研磨约5分钟，得到幼虫研磨液。
4. 将糊状葱液和幼虫研磨液倒入干净的 500 mL 锥形瓶中（参见 材料表）。用两层透明密封膜包裹锥形瓶口，然后将烧瓶置于振荡培养箱（参见 材料表）中，在25°C和180rpm下发酵12小时（图2B）。
5. 用剪刀剪下七层边长为10厘米的方形纱布（无需无菌），并将它们堆叠在一起，形成一个简单的过滤装置。将发酵的葱液慢慢倒在纱布上，然后将过滤后的液体挤出到新的500mL锥形瓶中。将剩余的葱渣用锡箔纸包裹在纱布上以备后用。
6. 使用真空泵（参见 材料表）和布氏漏斗过滤上一步中获得的滤液。将去离子水润湿的滤纸放在布氏漏斗上，然后倒入滤液，用不同的滤纸进行三次抽滤。将最终滤液收集在 500 mL 锥形瓶中。
7. 使用0.22μM滤瓶和真空泵进行另一次过滤。在超洁净工作台中拧紧抽吸过滤瓶的盖子（参见 材料表）以备进一步使用。此时，得到发酵的葱渣和滤液（图2C）。
   注意:从此步骤获得的过滤液体将是无菌的。（0.22μM滤瓶是用于对滤液进行灭菌的无菌真空过滤系统）。
8. 重复上述步骤以获得未发酵的葱渣和滤液。这里的区别在于不需要发酵。
9. 在 10 mL 离心管中称取 0.24 g 氯化胆碱和 0.56 g L-抗坏血酸（参见 材料表）。加入 3 mL 去离子水，剧烈摇晃直至完全溶解。在超洁净工作台中，使用新的 5 mL 注射器并连接三个 0.22 μM 注射器过滤器（参见 材料表）对溶液进行灭菌，并将其放入无菌的 10 mL 离心管中以备后用。
   注:氯化胆碱是昆虫生长的必需神经递质，而L-抗坏血酸则用作防腐剂。
10. 称取 2 g 琼脂粉末和 6 g TSB（参见 材料表），然后将它们倒入 500 mL 锥形瓶中。然后加入 100 mL 去离子水制备培养基。用去离子水冲洗玻璃棒后，用它来搅拌混合物，直到它充分混合。然后，用两层透明密封膜密封锥形瓶。
11. 将发酵的葱和未发酵的葱（在步骤1.5和步骤1.8中提到）包裹在铝箔中，并将它们与培养基一起在121°C的高压灭菌器中灭菌20分钟。
12. 在超净工作台中，将灭菌的氯化胆碱、L-抗坏血酸和无菌滤液倒入培养基中，同时轻轻旋转以充分混合。最后，加入发酵和未发酵的葱，用手剧烈摇晃以获得无菌饮食。将日粮以一定角度倒入50mL离心管（无菌;带有0.22μM PVDF疏水膜的排气盖）（参见 材料表）（图2D）。
    注意:灭菌后，培养基的温度应保持在65-80°C之间，以防止在添加葱或其他成分时快速冷却和凝固。此外，在每个试管中，倒入大约 10-15 毫升的饮食。一旦饮食凝固，如果不立即使用，请将试管存放在4°C的冰箱中。

2. 获取斧头卵

1. D. antiqua的实验室饲养系统
   1. 将饲养笼置于25°C内部LED照明的孵化器中（24小时一个周期，明暗比例为16:8）以饲养雄性和雌性成虫，使它们交配并产卵。将饮水机（图1B）装满水，并用湿棉绒密封，为成年人提供水。
   2. 将四个 35 mm x 12 mm 培养皿底部放入 94 mm x 16 mm 培养皿盖中。用离子水润湿棉絮，然后将湿棉皿放在两个培养皿底部，在棉絮上加入一汤匙蔗糖。
   3. 用两汤匙蔗糖和酵母提取物填充另外两个培养皿底部（见 材料表），它们作为成虫的食物（图1C）。
      注意:步骤2.1.2和步骤2.1.3中提到的蔗糖和酵母提取物不需要灭菌。
   4. 将一个94毫米×16毫米的培养皿底部装有湿润的沙子和一块未生根的去皮蒜瓣（图1D）放入苍蝇笼内以收集卵。雌性会被大蒜的气味所吸引，并在其周围产卵。
2. 鸡蛋的收集
   1. 从笼子中取出产卵装置，这是一个 94 mm x 16 mm 的培养皿，里面装有上面提到的沙子和大蒜（步骤 2.14）。将沙子和大蒜一起倒入 500 mL 烧杯中，然后用自来水将大蒜中剩余的鸡蛋冲洗到烧杯中。此时，鸡蛋漂浮在水中。
   2. 取一个100目筛子（见 材料表），用自来水润湿。然后将含有漂浮鸡蛋的水从烧杯倒入筛子上。鸡蛋将留在筛子上。
   3. 鸡蛋在筛子上自然干燥后，用刷子轻轻地将鸡蛋扫到培养皿上。
3. 第一天，冲洗产卵装置以收集卵子，而无需消毒或灭菌。第二天下午四点，再次冲洗鸡蛋，用清水过筛收集。
   注意:在第二天收集鸡蛋是为了确保后续阶段的生长速度一致。下午四点是 D. antiqua 的产卵高峰期。因此，此时收集鸡蛋是理想的选择。
4. 将收集的卵放在超洁净工作台（图3A）中的无菌细胞筛（参见材料表）上。
5. 准备鸡蛋灭菌溶液
   1. 取 5 mL 5.2% NaClO（参见 材料表）并将其转移到灭菌的 250 mL 锥形瓶中。加入 95 mL 灭菌水，使总体积为 100 mL，得到 0.26% NaClO 溶液。
   2. 要制备 75% EtOH 溶液，取 75 mL 99.7% EtOH 并将其转移到灭菌的 250 mL 锥形瓶中。加入 25 mL 灭菌水，使总体积为 100 mL，得到 75% 的 EtOH 溶液。
6. 将 30 mL NaClO 倒入培养皿中，将 30 mL EtOH 倒入另一个培养皿中。将含有步骤2.4中提到的鸡蛋的细胞筛放入含有NaClO的培养皿中。将其浸泡在0.26%NaClO溶液中0.5分钟。然后将筛子转移到含有EtOH的培养皿中，使其在75%EtOH溶液中再浸泡0.5分钟。
7. 重复此过程三次，每0.5分钟在0.26%NaClO和75%EtOH之间交替。之后，将获得斧头蛋。此时，应将装有卵的筛子浸没在EtOH中。
   注意:为确保彻底灭菌，请使用 1 mL 移液管吸出 NaClO 和 EtOH 并分散鸡蛋。多次重复冲洗过程。此步骤将进一步清洁鸡蛋表面的残留细菌和杂质，确保表面清洁无菌。

3. 幼虫的饲养

1. 要转移灭菌的卵子，请使用一把用酒精灯灭菌的剪刀切割1mL移液管的端尖（图3B）。确保切开的移液器的端部开口大于鸡蛋的直径（约2毫米）。然后，使用移液管将鸡蛋从EtOH溶液（鸡蛋与溶液一起）（图3C）转移到含有无菌饮食的离心管中，每个管应包含约20-50个鸡蛋（图3D）。重复此过程，直到所有卵子都转移完毕。
   注意:移液器吸头的直径应尽可能大，以避免在转移过程中破坏卵子，这可能导致它们死亡。
2. 使用移液管从试管中除去多余的乙醇。将带盖的离心管放入自密封袋内，并在袋子的开口处放一块棉花，以允许空气流通。最后，将袋子放入25°C培养箱（相对湿度:50%-70%;光周期:16小时光照:8小时黑暗）中进行观察和培养。
3. 大约三天后，日粮中的斧头卵开始孵化（图4A）。孵化的幼虫将活跃，无菌饮食的表面将不再光滑。幼虫将开始以饮食为食。
4. 继续观察幼虫，直到它们达到2龄幼虫的阶段。在此期间，请继续关注他们的成长和发展。
5. 9-12天后，超过80%的卵发育成3龄幼虫（图4B）。这表明幼虫成功生长和发育。

4. 用培养依赖性测定法验证无轴幼虫

1. 从离心管中随机选择3只3^龄 幼虫。
2. 将幼虫放入含有75%酒精的94mm x 16mm培养皿中进行清洁。之后，将它们转移到装有无菌水的容器中进行进一步冲洗。
3. 使用已用75%EtOH溶液消毒的消毒解剖钳抓住幼虫（头部和尾部如 图5A所示）。使用解剖剪刀去除头端和尾端（图5B）。用镊子握住幼虫的尾巴，用另一把镊子从尾巴轻轻挤压到头部，取出内脏（结果如 图5C所示）。将内脏置于去离子水中，用镊子按压脂肪组织轻轻拉出肠，并将提取的内脏（图5D）置于无菌水中以备进一步使用。
4. 将肠放入无菌的1.5mL离心管中，加入500μL灭菌的1x PBS缓冲液，并使用一次性研杵将肠组织研磨成匀浆。
5. 取 100 μL 匀浆并将其加入营养琼脂培养基中。使用L形吊具（见 材料表）对琼脂平板进行划线。
6. 将培养皿置于28°C的生化培养箱中，孵育72小时以观察菌落的生长。

5. 使用培养非依赖性测定法验证轴幼虫

1. 按照制造商的说明，使用DNA提取试剂盒（参见 材料表）从轴性幼虫的肠道组织中提取总DNA。
2. 使用紫外分光光度计测量DNA浓度。
3. 使用通用细菌16S rRNA引物（1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3'，27F:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'）进行PCR反应。总反应体积为 25 μL，由 1 μL DNA 模板、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、10.5 μL ddH₂O 和 12.5 μL 2x Taq PCR 预混液组成（参见 材料表）。设置PCR反应条件如下:在94°C下初始变性3分钟;在94°C下变性30秒，在55°C下退火30秒，在72°C下延伸90秒;在72°C下最终延伸10分钟。将PCR产物储存在4°C进行进一步分析。
4. 使用通用真菌ITS引物（ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'）进行PCR反应。总反应体积为 25 μL，由 1 μL DNA 模板、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、10.5 μL ddH₂O 和 12.5 μL 2x Taq PCR 预混液组成。将PCR条件设定在95°C5分钟;95°C30秒，55°C1分钟，72°C90秒35次循环;然后在72°C下10分钟。将PCR产物储存在4°C进行进一步分析。
5. 使用Super Green核酸染料（见 材料表）与两种类型的PCR产物中的每一种均匀混合，并通过在1x TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上电泳进行分析（从50x TAE稀释，见材料表）。使用3μL DNA标记物（参见 材料表）作为参考。
6. 使用紫外透射仪观察凝胶并定位目标片段。

结果

D. antiqua 的生命阶段如图 4 所示。完整的生命周期包括卵、幼虫、蛹（图4C）和成虫（图4D）。它们在无菌离心管中培养，其外观和存活率与在非轴性条件下饲养的 D. antiqua 没有区别。D. antiqua每个阶段的生长和发育时间如图6所示。非轴培的古蛾的卵期为2.83±0.29 d，轴向饲养的 D. ...

讨论

昆虫具有高度复杂的肠道微生物群^20,21，因此需要使用接种特定肠道微生物菌株的昆虫来研究昆虫与微生物的相互作用。昆虫的制备对于此类研究工作至关重要。抗生素治疗是一种用于消除肠道微生物群的方法。例如，Jung 和^{Kim 22} 用青霉素喂养草地贪夜蛾，而^{Raymond 23} 用含有利福平的人工饮食喂养木叶假单

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μM filter bottle	Thermo Scientific	450-0045
0.22 μM Syringe Filter	Biosharp	BS-QT-011
100-mesh sieve	Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory	No Catalog numbers
1x PBS solution	Solarbio	P1020
2x Taq PCR Master Mix	GENVIEW	GR1113-1ML
5.2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80010428
500 mL Conical flask	Thermo Scientific	4103-0500
50 mL vented centrifuge tube	JET BIOFIL	BRT-011-050
50x TAE buffer	GENVIEW	GT1307
Agar powder	Ding Guo	DH010-1.1
Biochemical incubator	STIK	21040121500010
Cell sieve	SAINING	5022200
Choline chloride	Sangon Biotech	A600299-0100
ddH2O	Ding Guo	PER018-2
Disposable grinding pestle	JET BIOFIL	CSP-003-002
DNA extraction kit	Sangon Biotech	B518221-0050
DNA Marker	Sangon Biotech	B600335-0250
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Filter paper	NEWSTAR	1087309025
Food processor	Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.	WBL25B26
Illuminated  incubator	Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.	A16110768
L-Ascorbic acid	Sangon Biotech	A610021-0100
L-shaped spreader	SAINING	6040000
Nutrient agar medium	Hope Bio	HB0109
Scissors	Bing Yu	BY-103	Purchase on Jingdong
Shock incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.	2020000014
Sucrose	GENVIEW	CS326-500G
Super Green nucleic acid dye	Biosharp	BS355A
Super-clean table	Heal Force	AC130052
TSB	Hope Bio	HB4114
Vacuum pump	Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.	22051031
Yeast extract	Thermo Scientific	LP0021B