Allevamento di Axenic Delia antiqua con diete sterili semifermentate

Riepilogo

Viene descritta una semplice procedura per l'allevamento di Delia antiqua axenica con diete sterili semifermentate. Solo un ceppo di Wolbachia è stato rilevato in ogni stadio di D. antiqua axenico utilizzando la PCR.

Abstract

Gli insetti axenici sono ottenuti da sistemi di allevamento artificiale sterili che utilizzano terreni sterili. Questi insetti, caratterizzati da piccole dimensioni, breve ciclo di crescita e basso fabbisogno alimentare, sono ideali per studiare la relazione tra microrganismi e ospiti. Il microbiota intestinale influenza in modo significativo le caratteristiche fisiologiche degli insetti ospiti e l'introduzione di ceppi specifici negli insetti axenici fornisce un metodo per verificare le funzioni microbiche intestinali. La Delia antiqua, un parassita minaccioso dell'ordine dei Ditteri, della famiglia Anthomyiidae e del genere Delia, si nutre principalmente di cipolle, aglio, porri e altri ortaggi della famiglia delle Liliaceae. Le sue larve si nutrono dei bulbi, causando marciume, appassimento e persino la morte di intere piante. Allevando larve axeniche, è possibile condurre studi di follow-up per osservare gli effetti della microflora intestinale sulla crescita e sullo sviluppo di D. antiqua. A differenza del metodo che prevede l'eliminazione antibiotica dei microbi associati, questo articolo presenta un approccio a basso costo e ad alta efficienza per l'allevamento di D. antiqua axenico. Dopo la sterilizzazione superficiale delle uova di D. antiqua , sono state utilizzate diete sterili semifermentate per allevare le larve e lo stato axenico di D. antiqua è stato verificato attraverso saggi dipendenti dalla coltura e indipendenti dalla coltura. In conclusione, la combinazione della sterilizzazione delle uova di insetti e la preparazione di diete sterili per la coltura larvale ha permesso lo sviluppo di un metodo efficiente e semplice per ottenere D. antiqua axenico. Questo metodo fornisce un potente approccio allo studio delle interazioni tra insetti e microflora.

Introduzione

Gli animali axenici, definiti come animali in cui non è possibile rilevare microrganismi o parassiti vitali, sono validi modelli sperimentali per lo studio delle interazioni ospite-microrganismo ^1,2. Gli insetti, il gruppo più numeroso di invertebrati, possono formare relazioni simbiotiche con i microrganismi³. Gli insetti axenici possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-simbionte in sistemi simbiotici⁴. Ad esempio, Nishide et ^al.5 hanno stabilito una pratica procedura di allevamento sterile per il verme maleodorante Plautia stali, consentendo un'analisi affidabile e rigorosa delle interazioni ospite-simbionte in sistemi simbiotici modello. Gli insetti axenici possono essere prodotti sterilizzando lo stadio di uovo e fornendo cibo sterile alle larve e agli adulti ^6,7. Gli insetti axenici sono di grande importanza e sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Ad esempio, uno studio condotto da Somerville et ^al.8 ha dimostrato che le falene diamondback inoculate con cloache di Enterobacter hanno migliorato l'adattabilità dei maschi transgenici.

La Delia antiqua Meigen è un parassita economicamente importante per le cipolle e altre colture di Liliaceae in tutto il mondo, con le sue larve che danneggiano i bulbi delle cipolle e di altre colture di Liliaceae⁹. D. antiqua si trova principalmente nei climi temperati ed è diffusa nelle aree di coltivazione delle cipolle delle Americhe, dell'Europa e dell'Asia. Se non adeguatamente controllata, può causare perdite di raccolto nelle cipolle (Allium cepa L.), nell'aglio (Allium sativum L.), nello scalogno (Allium fistulosum L.) e nei porri (Alliumchoenoprasum L.) che vanno dal 50% al 100%^10,11. Le larve si nutrono delle parti sotterranee delle piante e questa alimentazione fa appassire le piantine e alla fine morire. Inoltre, le piante danneggiate possono consentire l'ingresso di agenti patogeni, portando alla decomposizione del bulbo¹². Anche se le piante non vengono completamente consumate dalle larve, i danni che provocano rendono le piante di cipolla non commerciabili e si traducono in perdite economiche.

Gli insetti sono strettamente associati al microbiota intestinale e la maggior parte delle viscere degli insetti contiene una varietà di batteri simbionti che prosperano grazie ai nutrienti forniti dall'ospite^13,14. Jing et ^al.15 hanno dimostrato che la funzione primaria della comunità simbiotica intestinale è quella di fornire nutrienti essenziali, seguiti da funzioni legate alla digestione e alla disintossicazione. In alcuni casi, i batteri intestinali possono fungere da risorsa microbica per scopi di gestione dei parassiti. Di conseguenza, è auspicabile studiare le prestazioni dei singoli batteri intestinali e le funzioni specifiche all'interno del corpo di D. antiqua. Pertanto, la preparazione di larve axeniche è particolarmente importante per studiare le interazioni tra specifici ceppi batterici e insetti¹⁶. Attualmente, un metodo comunemente usato per eliminare i batteri intestinali degli insetti è l'uso di una combinazione di antibiotici per sradicare i microbi associati 17,18,19. A differenza dell'uso dei soli antibiotici, che possono solo ridurre il numero di microbi, l'allevamento axenico degli insetti consente di controllare la composizione e la quantità di microrganismi, consentendo una convalida più accurata della funzionalità del microbiota intestinale.

Pertanto, questo articolo introduce un protocollo per la preparazione e l'allevamento di D. antiqua axenico. Il cibo larvale Axenic è ottenuto utilizzando la sterilizzazione ad alta temperatura di diete naturali combinate con alimenti semifermentati. Le uova vengono sterilizzate seguendo un protocollo sperimentale per ottenere le uova axeniche e, infine, le larve axeniche vengono coltivate dalle uova axeniche. Il sistema di allevamento axenico è stato effettuato per una sola generazione per l'esperimento. Ciò fornirà comodità per studiare l'interazione tra insetti e microbiota intestinale.

Protocollo

D. antiqua sono ottenuti dal campo di Fanzhen, Taian.

1. Preparazione di diete sterili

1. Staccare gli strati esterni dello scalogno e scartare le foglie verdi. Conservare la parte bianca dello scalogno (Figura 1A) e lavarli con acqua sterile, ripetendo il processo di risciacquo tre volte. Tagliare la parte bianca dello scalogno a pezzetti di 1-2 cm con le forbici (vedi Tabella dei materiali) sterilizzati con una soluzione di EtOH al 75 % (menzionata al punto 2.5) per un uso successivo.
2. Pesare 50 g di scalogno tagliato a dadini e metterli in un robot da cucina (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 50 ml di acqua sterilizzata e macinarli cinque volte per 2 minuti ciascuno. Tutti gli scalogni tagliati a dadini devono essere macinati fino a ottenere una consistenza pastosa (Figura 2A).
3. Utilizzare una pinzetta per trasferire 10 larve di D. antiqua in una provetta da centrifuga da 10 mL contenente 10 ml di PBS 1x e macinarle con un pestello di macinazione usa e getta (vedere la tabella dei materiali) per circa 5 minuti per ottenere un liquido di macinazione larvale.
4. Versare il liquido pastoso di scalogno e il liquido di macinazione delle larve in un matraccio conico pulito da 500 ml (vedi Tabella dei materiali). Avvolgere l'imboccatura conica del matraccio con due strati di pellicola sigillante trasparente, quindi porre il pallone in un incubatore ad agitazione (cfr. tabella dei materiali) per la fermentazione a 25 °C e 180 giri/min per 12 ore (figura 2B).
5. Ritagliare sette strati di garza quadrata con lati di 10 cm (non c'è bisogno di sterilità) con le forbici e impilarli insieme per formare un semplice dispositivo filtrante. Versare lentamente il liquido di scalogno fermentato sulla garza e spremere il liquido filtrato in un nuovo pallone conico da 500 ml. Avvolgere i residui di scalogno rimanenti sulla garza in un foglio di stagnola per un uso successivo.
6. Filtrare il filtrato ottenuto nella fase precedente utilizzando una pompa a vuoto (vedi Tabella dei materiali) e un imbuto Buchner. Mettere la carta da filtro bagnata dall'acqua deionizzata sull'imbuto Buchner, quindi versare il filtrato ed eseguire la filtrazione per aspirazione per tre volte con carta da filtro diversa. Raccogliere il filtrato finale nel matraccio conico da 500 ml.
7. Eseguire un'altra filtrazione utilizzando un flacone filtrante da 0,22 μM e una pompa per vuoto. Avvitare il coperchio del pallone del filtro di aspirazione in un banco ultra-pulito (vedi Tabella dei materiali) per un ulteriore utilizzo. A questo punto si ottengono il residuo di scalogno fermentato e il filtrato (Figura 2C).
   NOTA: Il liquido filtrato ottenuto da questo passaggio sarà sterile. (Il flacone filtrante da 0,22 μM è un sistema di filtrazione sterile sottovuoto per la sterilizzazione del filtrato).
8. Ripetere i passaggi precedenti per ottenere il residuo di scalogno non fermentato e filtrato. Qui la differenza è che la fermentazione non è necessaria.
9. Pesare 0,24 g di cloruro di colina e 0,56 g di acido L-ascorbico (vedere Tabella dei materiali) in una provetta da centrifuga da 10 ml. Aggiungere 3 mL di acqua deionizzata e agitare energicamente fino a completa dissoluzione. Nel banco ultra-clean, utilizzare una nuova siringa da 5 mL e collegare tre filtri per siringa da 0,22 μM (vedere la tabella dei materiali) per sterilizzare la soluzione e inserirla in una provetta da centrifuga sterile da 10 mL per un uso successivo.
   NOTA: Il cloruro di colina è un neurotrasmettitore essenziale per la crescita degli insetti, mentre l'acido L-ascorbico agisce come conservante.
10. Pesare 2 g di agar in polvere e 6 g di TSB (vedi Tabella dei materiali) e versarli in un matraccio conico da 500 ml. Quindi aggiungere 100 ml di acqua deionizzata per preparare il terreno di coltura. Dopo aver sciacquato la bacchetta di vetro con acqua deionizzata, usala per mescolare il composto fino a quando non è ben amalgamato. Quindi, sigillare il pallone conico con due strati di pellicola sigillante trasparente.
11. Avvolgere lo scalogno fermentato e lo scalogno non fermentato (menzionato nei passaggi 1.5 e 1.8) in un foglio di alluminio e sterilizzarli, insieme al terreno di coltura, in autoclave a 121 °C per 20 minuti.
12. Nel banco ultra-pulito, versare il cloruro di colina sterilizzato, l'acido L-ascorbico e il filtrato sterile nel terreno di coltura mentre si agita delicatamente per mescolarli accuratamente. Infine, aggiungere lo scalogno fermentato e non fermentato e agitare energicamente a mano per ottenere le diete sterili. Versare le diete nelle provette da centrifuga da 50 mL (sterili; tappo di sfiato con membrana idrofobica in PVDF da 0,22 μM) (vedere la tabella dei materiali) ad angolo (Figura 2D).
    NOTA: Dopo la sterilizzazione, la temperatura del terreno di coltura deve essere mantenuta tra 65-80 °C per evitare un rapido raffreddamento e solidificazione durante l'aggiunta di scalogno o altri ingredienti. Inoltre, in ogni provetta, versare circa 10-15 ml di diete. Una volta che le diete si sono solidificate, conservare le provette in frigorifero a 4 °C, se non viene utilizzato immediatamente.

2. Acquisizione di uova axeniche

1. Sistema di allevamento da laboratorio per D. antiqua
   1. Collocare una gabbia di allevamento in un'incubatrice illuminata a LED a 25 °C (24 ore a ciclo, il rapporto tra luce e buio è di 16:8) per allevare adulti maschi e femmine, consentendo loro di accoppiarsi e deporre le uova. Riempite d'acqua l'erogatore d'acqua (Figura 1B) e sigillatelo con un batuffolo di cotone inumidito per fornire acqua agli adulti.
   2. Posizionare quattro fondi per piastre di Petri da 35 mm x 12 mm in un coperchio per piastre di Petri da 94 mm x 16 mm. Bagnare un batuffolo di cotone con acqua ionizzata e poi posizionare un batuffolo di cotone umido su due dei fondi delle piastre di Petri e, sopra il batuffolo di cotone, aggiungere un cucchiaio di saccarosio.
   3. Riempire gli altri due fondi delle piastre di Petri con due cucchiai di saccarosio ed estratto di lievito (vedi Tabella dei materiali), che servono da cibo per gli insetti adulti (Figura 1C).
      NOTA: L'estratto di saccarosio e lievito menzionato nei passaggi 2.1.2 e 2.1.3 non deve essere sterilizzato.
   4. Mettere un fondo di una capsula di Petri di 94 mm x 16 mm contenente sabbia inumidita e un pezzo di spicchio d'aglio sbucciato senza radici (Figura 1D) all'interno della gabbia per mosche per raccogliere le uova. La femmina sarà attratta dall'odore dell'aglio e deporrà le uova intorno ad esso.
2. Raccolta delle uova
   1. Estrarre dalla gabbia il dispositivo di ovideposizione, che è una capsula di Petri di 94 mm x 16 mm contenente sabbia e aglio menzionati sopra (passaggio 2.14). Versare la sabbia insieme all'aglio in un bicchiere da 500 ml e utilizzare l'acqua del rubinetto per sciacquare le uova rimanenti dall'aglio nel bicchiere. A questo punto, le uova galleggiano nell'acqua.
   2. Prendi un setaccio da 100 maglie (vedi Tabella dei materiali) e inumidiscilo con acqua di rubinetto. Quindi versare l'acqua contenente le uova galleggianti dal bicchiere sul setaccio. Le uova rimarranno sul setaccio.
   3. Dopo che le uova si sono asciugate naturalmente sul setaccio, usa un pennello per spazzare delicatamente le uova su una capsula di Petri.
3. Il primo giorno, sciacquare il dispositivo di ovideposizione per raccogliere le uova senza disinfezione o sterilizzazione. Il secondo giorno alle quattro del pomeriggio, sciacquate di nuovo le uova e raccoglietele setacciandole con acqua pulita.
   NOTA: La raccolta delle uova il secondo giorno serve a garantire un tasso di crescita costante nelle fasi successive. Alle quattro del pomeriggio c'è il picco di deposizione delle uova per D. antiqua. Pertanto, è ideale raccogliere le uova in questo momento.
4. Mettere gli ovuli raccolti su un setaccio cellulare sterile (vedi Tabella dei materiali) nel banco ultra-pulito (Figura 3A).
5. Preparare la soluzione per la sterilizzazione degli ovuli
   1. Prelevare 5 mL di NaClO al 5,2% (vedere la tabella dei materiali) e trasferirli in un matraccio conico sterilizzato da 250 ml. Aggiungere 95 mL di acqua sterilizzata per ottenere un volume totale di 100 mL, ottenendo una soluzione di NaClO allo 0,26%.
   2. Per preparare una soluzione di EtOH al 75%, prelevare 75 mL di EtOH al 99,7% e trasferirli in un matraccio conico sterilizzato da 250 mL. Aggiungere 25 mL di acqua sterilizzata per ottenere un volume totale di 100 mL, ottenendo una soluzione di EtOH al 75%.
6. Versare 30 mL di NaClO in una capsula di Petri e versare 30 mL di EtOH in un'altra capsula di Petri. Mettere il setaccio contenente le uova menzionate al punto 2.4 nella capsula contenente NaClO. Immergerlo nella soluzione di NaClO allo 0,26% per 0,5 minuti. Quindi trasferire il setaccio nella capsula contenente EtOH, lasciandolo in ammollo nella soluzione di EtOH al 75% per altri 0,5 minuti.
7. Ripetere questo processo tre volte, alternando tra lo 0,26% di NaClO e il 75% di EtOH ogni 0,5 minuti. Dopodiché si otterranno le uova axeniche. A questo punto, il setaccio contenente le uova deve essere immerso in EtOH.
   NOTA: Per garantire una sterilizzazione accurata, utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare NaClO ed EtOH e disperdere gli ovuli. Ripetere il processo di risciacquo più volte. Questo passaggio pulirà ulteriormente la superficie delle uova da batteri residui e impurità, garantendo una superficie pulita e sterile.

3. Allevamento di larve axeniche

1. Per trasferire gli ovuli sterilizzati, utilizzare un paio di forbici sterilizzate con una lampada ad alcool per tagliare la punta terminale di una pipetta da 1 mL (Figura 3B). Assicurarsi che l'apertura finale della pipetta tagliata sia maggiore del diametro delle uova (circa 2 mm). Quindi, utilizzare la pipetta per trasferire le uova dalla soluzione di EtOH (uova insieme alla soluzione) (Figura 3C) a una provetta da centrifuga contenente le diete sterili e ogni provetta dovrebbe contenere circa 20-50 uova (Figura 3D). Ripeti questo processo fino a quando tutti gli ovuli non sono stati trasferiti.
   NOTA: Il diametro del puntale della pipetta deve essere il più grande possibile per evitare la rottura degli ovuli durante il trasferimento, che potrebbe portare alla loro morte.
2. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo in eccesso dalla provetta. Posizionare la provetta da centrifuga chiusa con i coperchi all'interno di un sacchetto autosigillante e posizionare un pezzo di cotone all'apertura del sacchetto per consentire la circolazione dell'aria. Infine, posizionare il sacchetto all'interno di un'incubatrice a 25 °C (umidità relativa: 50%-70%; fotoperiodo: 16 h luce: 8 h buio) per l'osservazione e la coltivazione.
3. Circa tre giorni dopo, le uova axeniche nelle diete iniziano a schiudersi (Figura 4A). Le larve schiuse saranno attive e la superficie delle diete sterili non sarà più liscia. Le larve inizieranno a nutrirsi delle diete.
4. Continuare ad osservare le larve fino a quando non raggiungono lo stadio di larve di 2^° stadio. Continua a monitorare la loro crescita e il loro sviluppo durante questo periodo.
5. Dopo 9-12 giorni, oltre l'80% delle uova si è sviluppato in larve di 3^° stadio (Figura 4B). Ciò indica il successo della crescita e dello sviluppo delle larve.

4. Validazione di larve axeniche con saggi coltura-dipendenti

1. Seleziona in modo casuale tre larve axeniche di 3^° stadio dalla provetta da centrifuga.
2. Mettere le larve in una capsula di Petri di 94 mm x 16 mm contenente alcol al 75% per la pulizia. Dopodiché, trasferiscili in un contenitore con acqua sterile per un ulteriore risciacquo.
3. Utilizzare una pinza da dissezione disinfettata che è stata sterilizzata con una soluzione di EtOH al 75% per afferrare le larve (la testa e la coda sono mostrate nella Figura 5A). Utilizzare le forbici da dissezione per rimuovere le estremità della testa e della coda (Figura 5B). Tenere la coda delle larve con la pinza e utilizzare un'altra pinza per premere delicatamente dalla coda alla testa ed estrarre gli organi interni (il risultato mostrato nella Figura 5C). Mettere gli organi interni in acqua deionizzata e staccare delicatamente l'intestino premendo sul tessuto adiposo con una pinza, quindi mettere l'interno estratto (Figura 5D) in acqua sterile per un ulteriore utilizzo.
4. Mettere l'intestino in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 500 μL di tampone PBS 1x sterilizzato e utilizzare un pestello monouso per macinare il tessuto intestinale in un omogenato.
5. Prelevare 100 μL di omogenato e aggiungerlo a un terreno di agar nutritivo. Utilizzare uno spandiconcime a forma di L (vedi Tabella dei materiali) per striare la piastra di agar.
6. Porre la capsula di Petri in un incubatore biochimico a 28 °C e incubare per 72 ore per osservare la crescita delle colonie.

5. Validazione di larve axeniche con saggi indipendenti dalla coltura

1. Estrarre il DNA totale dal tessuto intestinale delle larve axeniche utilizzando un kit per l'estrazione del DNA (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
2. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV.
3. Eseguire la reazione PCR utilizzando primer universali per l'rRNA batterico 16S (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Il volume totale di reazione è di 25 μL ed è costituito da 1 μL di DNA stamp, 0,5 μL di primer diretto, 0,5 μL di primer inverso, 10,5 μL ddH₂O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (vedi Tabella dei materiali). Impostare le condizioni di reazione della PCR come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 3 min; 35 cicli di denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura a 55 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 90 s; prolungamento finale a 72 °C per 10 min. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per ulteriori analisi.
4. Eseguire la reazione PCR utilizzando primer ITS fungini universali (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Il volume totale della reazione è di 25 μL ed è costituito da 1 μL di DNA stampo, 0,5 μL di primer diretto, 0,5 μL di primer inverso, 10,5 μL ddH₂O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Impostare le condizioni della PCR a 95 °C per 5 min; 35 cicli di 95 °C per 30 s, 55 °C per 1 min e 72 °C per 90 s; seguito da 72 °C per 10 min. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per ulteriori analisi.
5. Utilizzare il colorante per acidi nucleici Super Green (vedere la tabella dei materiali) per miscelare uniformemente con ciascuno dei due tipi di prodotti per PCR e analizzarli mediante elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE (diluito da 50x TAE, vedere la tabella dei materiali). Utilizzare 3 μL di marcatore di DNA (vedi Tabella dei materiali) come riferimento.
6. Utilizzare un transilluminatore UV per osservare il gel e individuare il frammento bersaglio.

Risultati

Le fasi di vita di D. antiqua sono illustrate nella Figura 4. Il ciclo vitale completo comprende uova, larve, pupe (Figura 4C) e adulti (Figura 4D). Sono coltivati in provette da centrifuga sterili e il loro aspetto e il loro tasso di sopravvivenza sono indistinguibili da D. antiqua allevati in condizioni non axeniche. I tempi di crescita e sviluppo per ogni stadio di D. antiqua sono riportati nella

Discussione

Gli insetti possiedono un microbiota intestinale altamente complesso ^20,21, che richiede l'uso di insetti axenici inoculati con ceppi microbici intestinali specifici per studiare le interazioni insetto-microrganismo. La preparazione di insetti axenici è fondamentale per tali attività di ricerca. Il trattamento antibiotico è un metodo utilizzato per eliminare il microbiota intestinale. Ad esempio, Jung e Kim²² hanno nutrito Spodopter...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μM filter bottle	Thermo Scientific	450-0045
0.22 μM Syringe Filter	Biosharp	BS-QT-011
100-mesh sieve	Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory	No Catalog numbers
1x PBS solution	Solarbio	P1020
2x Taq PCR Master Mix	GENVIEW	GR1113-1ML
5.2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80010428
500 mL Conical flask	Thermo Scientific	4103-0500
50 mL vented centrifuge tube	JET BIOFIL	BRT-011-050
50x TAE buffer	GENVIEW	GT1307
Agar powder	Ding Guo	DH010-1.1
Biochemical incubator	STIK	21040121500010
Cell sieve	SAINING	5022200
Choline chloride	Sangon Biotech	A600299-0100
ddH2O	Ding Guo	PER018-2
Disposable grinding pestle	JET BIOFIL	CSP-003-002
DNA extraction kit	Sangon Biotech	B518221-0050
DNA Marker	Sangon Biotech	B600335-0250
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Filter paper	NEWSTAR	1087309025
Food processor	Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.	WBL25B26
Illuminated  incubator	Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.	A16110768
L-Ascorbic acid	Sangon Biotech	A610021-0100
L-shaped spreader	SAINING	6040000
Nutrient agar medium	Hope Bio	HB0109
Scissors	Bing Yu	BY-103	Purchase on Jingdong
Shock incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.	2020000014
Sucrose	GENVIEW	CS326-500G
Super Green nucleic acid dye	Biosharp	BS355A
Super-clean table	Heal Force	AC130052
TSB	Hope Bio	HB4114
Vacuum pump	Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.	22051031
Yeast extract	Thermo Scientific	LP0021B