Élevage de Delia antiqua axénique avec des aliments stériles semi-fermentés

Résumé

Une procédure simple pour l’élevage de Delia antiqua axénique avec des aliments stériles semi-fermentés est décrite. Une seule souche de Wolbachia a été détectée dans chaque stade de D. antiqua axénique par PCR.

Résumé

Les insectes axéniques sont obtenus à partir de systèmes d’élevage artificiels stériles utilisant des milieux stériles. Ces insectes, caractérisés par leur petite taille, leur cycle de croissance court et leurs faibles besoins alimentaires, sont idéaux pour étudier la relation entre les micro-organismes et les hôtes. Le microbiote intestinal influence de manière significative les caractéristiques physiologiques des insectes hôtes, et l’introduction de souches spécifiques dans les insectes axéniques fournit une méthode pour vérifier les fonctions microbiennes intestinales. Delia antiqua, un ravageur menaçant de l’ordre des Diptères, de la famille des Anthomyiidae et du genre Delia, se nourrit principalement d’oignons, d’ail, de poireaux et d’autres légumes de la famille des Liliacées. Ses larves se nourrissent des bulbes, provoquant la pourriture, le flétrissement et même la mort de plantes entières. L’élevage de larves axéniques permet d’effectuer des études de suivi afin d’observer les effets de la microflore intestinale sur la croissance et le développement de D. antiqua. Contrairement à la méthode d’élimination des microbes associés par des antibiotiques, cet article présente une approche peu coûteuse et très efficace pour élever D. antiqua axénique. Après la stérilisation superficielle des œufs de D. antiqua , des aliments stériles semi-fermentés ont été utilisés pour élever les larves, et l’état axénique de D. antiqua a été vérifié par des essais dépendants et indépendants de la culture. En conclusion, la combinaison de la stérilisation des œufs d’insectes et de la préparation d’aliments stériles pour la culture larvaire a permis le développement d’une méthode efficace et simple d’obtention de D. antiqua axénique. Cette méthode fournit une approche puissante pour étudier les interactions entre les insectes et la microflore.

Introduction

Les animaux axéniques, définis comme des animaux chez lesquels aucun micro-organisme ou parasite viable ne peut être détecté, sont des modèles expérimentaux précieux pour étudier les interactions hôte-micro-organisme ^1,2. Les insectes, le plus grand groupe d’invertébrés, peuvent former des relations symbiotiques avec des micro-organismes³. Les insectes axéniques peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-symbiote dans les systèmes symbiotiques⁴. Par exemple, Nishide et ^al.5 ont mis au point une procédure pratique d’élevage stérile pour le ver malodorant Plautia stali, permettant une analyse fiable et rigoureuse des interactions hôte-symbiote dans des systèmes symbiotiques modèles. Les insectes axéniques peuvent être produits en stérilisant le stade de l’œuf et en fournissant de la nourriture stérile aux larves et aux adultes ^6,7. Les insectes axéniques sont d’une grande importance et sont largement utilisés dans la recherche biologique. Par exemple, une étude menée par Somerville et ^al.8 a démontré que les fausses-teignes des crucifères inoculées avec Enterobacter cloacae amélioraient la capacité d’adaptation des mâles transgéniques.

Delia antiqua Meigen est un ravageur économiquement important des oignons et d’autres cultures de Liliacées dans le monde entier, ses larves endommageant les bulbes d’oignons et d’autres cultures de Liliacées⁹. D. antiqua se trouve principalement dans les climats tempérés et est répandu dans les zones de culture de l’oignon des Amériques, d’Europe et d’Asie. Si elle n’est pas correctement contrôlée, elle peut entraîner des pertes de récolte d’oignons (Allium cepa L.), d’ail (Allium sativum L.), d’échalotes (Allium fistulosum L.) et de poireaux (Alliumchoenoprasum L.) allant de 50 % à 100 %^10,11. Les larves se nourrissent des parties souterraines des plantes, et cette alimentation provoque le flétrissement et la mort des plantules. De plus, les plantes endommagées peuvent permettre aux agents pathogènes d’entrer, ce qui entraîne la pourriture des bulbes¹². Même si les plants ne sont pas complètement consommés par les larves, les dommages qu’elles causent rendent les plants d’oignon invendables et entraînent des pertes économiques.

Les insectes sont étroitement associés au microbiote intestinal, et la plupart des intestins d’insectes contiennent une variété de bactéries symbiotiques qui se développent grâce aux nutriments fournis par l’hôte^13,14. Jing et ^al.15 ont montré que la fonction première de la communauté symbiotique intestinale est de fournir des nutriments essentiels, suivis par des fonctions liées à la digestion et à la détoxification. Dans certains cas, les bactéries intestinales peuvent servir de ressource microbienne à des fins de lutte antiparasitaire. Par conséquent, il est souhaitable d’étudier les performances et les fonctions spécifiques des bactéries intestinales individuelles dans le corps de D. antiqua. Par conséquent, la préparation des larves axéniques est particulièrement importante pour étudier les interactions entre des souches bactériennes spécifiques et des insectes¹⁶. Actuellement, une méthode couramment utilisée pour éliminer les bactéries intestinales des insectes est l’utilisation d’une combinaison d’antibiotiques pour éradiquer les microbes associés 17,18,19. Contrairement à l’utilisation d’antibiotiques seuls, qui ne peuvent que réduire le nombre de microbes, l’élevage axénique des insectes permet de contrôler la composition et la quantité de micro-organismes, ce qui permet une validation plus précise de la fonctionnalité du microbiote intestinal.

Ainsi, cet article présente un protocole de préparation et d’élevage axénique de D. antiqua. La nourriture larvaire axénique est obtenue en utilisant la stérilisation à haute température des aliments naturels combinés à des aliments semi-fermentés. Les œufs sont stérilisés selon un protocole expérimental pour obtenir des œufs axéniques, et enfin, des larves axéniques sont cultivées à partir des œufs axéniques. Le système d’élevage axénique n’a été réalisé que pendant une génération pour l’expérience. Cela facilitera l’étude de l’interaction entre les insectes et le microbiote intestinal.

Protocole

D. antiqua sont obtenus dans le champ de Fanzhen, Taian.

1. Préparation d’aliments stériles

1. Décollez les couches extérieures des oignons verts et jetez les feuilles vertes. Conservez la partie blanche des oignons verts (figure 1A) et lavez-les à l’eau stérile, en répétant le processus de rinçage trois fois. Coupez la partie blanche des oignons verts en dés de 1 à 2 cm à l’aide de ciseaux (voir tableau des matériaux) stérilisés avec une solution d’EtOH à 75 % (mentionnée à l’étape 2.5) pour une utilisation ultérieure.
2. Pesez 50 g d’oignons verts coupés en dés et placez-les dans un robot culinaire (voir le tableau des matériaux). Ajouter 50 ml d’eau stérilisée et les broyer cinq fois pendant 2 minutes chacune. Tous les oignons verts coupés en dés doivent être broyés jusqu’à obtenir une consistance pâteuse (figure 2A).
3. À l’aide d’une pince à épiler, transférer 10 larves de 3^e stade de D. antiqua dans un tube à centrifuger de 10 mL contenant 10 mL de PBS 1x et les broyer à l’aide d’un pilon à broyer jetable (voir le tableau des matériaux) pendant environ 5 min pour obtenir un liquide de broyage larvaire.
4. Verser le liquide pâteux à l’oignon vert et le liquide de broyage des larves dans une fiole conique propre de 500 mL (voir le tableau des matériaux). Envelopper l’embouchure conique de la fiole avec deux couches de film d’étanchéité transparent, puis placer la fiole dans un incubateur à agitation (voir tableau des matériaux) pour la fermentation à 25 °C et 180 tr/min pendant 12 h (figure 2B).
5. Découpez sept couches de gaze carrée de 10 cm de côté (pas besoin de stérilité) avec des ciseaux et empilez-les ensemble pour former un simple dispositif de filtration. Versez lentement le liquide d’oignon vert fermenté sur la gaze et pressez le liquide filtré dans une nouvelle fiole conique de 500 ml. Enveloppez les résidus d’oignons verts restants sur la gaze dans du papier d’aluminium pour une utilisation ultérieure.
6. Filtrer le filtrat obtenu à l’étape précédente à l’aide d’une pompe à vide (voir tableau des matériaux) et d’un entonnoir Buchner. Placez le papier filtre mouillé par de l’eau déminéralisée sur l’entonnoir Buchner, puis versez le filtrat et effectuez une filtration par aspiration trois fois avec du papier filtre différent. Prélever le filtrat final dans la fiole conique de 500 ml.
7. Effectuez une autre filtration à l’aide d’un flacon filtrant de 0,22 μM et d’une pompe à vide. Vissez le couvercle de la fiole du filtre d’aspiration dans un banc ultra-propre (voir tableau des matériaux) pour une utilisation ultérieure. À ce stade, on obtient le résidu d’oignon vert fermenté et le filtrat (figure 2C).
   REMARQUE : Le liquide filtré obtenu à partir de cette étape sera stérile. (Le flacon filtrant de 0,22 μM est un système stérile de filtration sous vide pour la stérilisation du filtrat).
8. Répétez les étapes précédentes pour obtenir des résidus d’oignons verts non fermentés et du filtrat. Ici, la différence est que la fermentation n’est pas nécessaire.
9. Peser 0,24 g de chlorure de choline et 0,56 g d’acide L-ascorbique (voir le tableau des matériaux) dans un tube à centrifuger de 10 ml. Ajouter 3 mL d’eau déminéralisée et agiter vigoureusement jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous. Dans la paillasse ultra-propre, utilisez une nouvelle seringue de 5 mL et fixez trois filtres de seringue de 0,22 μM (voir le tableau des matériaux) pour stériliser la solution, puis placez-la dans un tube à centrifuger stérile de 10 mL pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE : Le chlorure de choline est un neurotransmetteur essentiel pour la croissance des insectes, tandis que l’acide L-ascorbique agit comme un conservateur.
10. Peser 2 g de poudre d’agar et 6 g de TSB (voir tableau des matériaux) et les verser dans une fiole conique de 500 ml. Ajoutez ensuite 100 mL d’eau déminéralisée pour préparer le milieu de culture. Après avoir rincé la tige de verre avec de l’eau déminéralisée, utilisez-la pour remuer le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Ensuite, scellez la fiole conique à l’aide de deux couches de film d’étanchéité transparent.
11. Enveloppez les oignons verts fermentés et les oignons verts non fermentés (mentionnés aux étapes 1.5 et 1.8) dans du papier d’aluminium et stérilisez-les, ainsi que le milieu de culture, dans un autoclave à 121 °C pendant 20 min.
12. Dans la paillasse ultra-propre, versez le chlorure de choline stérilisé, l’acide L-ascorbique et le filtrat stérile dans le milieu de culture tout en remuant doucement pour bien les mélanger. Enfin, ajoutez les oignons verts fermentés et non fermentés et secouez vigoureusement à la main pour obtenir les aliments stériles. Verser les rations dans les tubes à centrifuger de 50 mL (stériles ; bouchon d’évent avec membrane hydrophobe en PVDF de 0,22 μM) (voir le tableau des matériaux) en biais (figure 2D).
    REMARQUE : Après la stérilisation, la température du milieu de culture doit être maintenue entre 65 et 80 °C pour éviter un refroidissement et une solidification rapides lors de l’ajout d’oignons verts ou d’autres ingrédients. De plus, dans chaque tube, versez environ 10 à 15 ml de régimes. Une fois les aliments solidifiés, conservez les tubes au réfrigérateur à 4 °C, s’ils ne sont pas utilisés immédiatement.

2. Acquisition d’ovules axéniques

1. Système d’élevage en laboratoire pour D. antiqua
   1. Placez une cage d’élevage dans un incubateur éclairé par LED à 25 °C (24 h par cycle, le rapport entre la lumière et l’obscurité est de 16 :8) pour élever les adultes mâles et femelles, leur permettant de s’accoupler et de pondre des œufs. Remplissez le distributeur d’eau (figure 1B) d’eau et scellez-le avec du coton humidifié pour fournir de l’eau aux adultes.
   2. Placez quatre fonds de boîtes de Pétri de 35 mm x 12 mm dans un couvercle de boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm. Mouillez le coton avec de l’eau ionisée, puis placez du coton humide au fond de deux des boîtes de Pétri, et sur le coton, ajoutez une cuillère à soupe de saccharose.
   3. Remplissez les deux autres fonds de boîtes de Pétri avec deux cuillères à soupe de saccharose et d’extrait de levure (voir le tableau des matériaux), qui servent de nourriture aux insectes adultes (figure 1C).
      REMARQUE : Le saccharose et l’extrait de levure mentionnés à l’étape 2.1.2 et à l’étape 2.1.3 n’ont pas besoin d’être stérilisés.
   4. Placez un fond de boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm contenant du sable humidifié et un morceau de gousse d’ail pelée et non enracinée (figure 1D) à l’intérieur de la cage à mouches pour recueillir les œufs. La femelle sera attirée par l’odeur de l’ail et pondra des œufs autour de celui-ci.
2. Collecte des oeufs
   1. Sortez de la cage le dispositif de ponte, qui est une boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm contenant du sable et de l’ail (étape 2.14). Versez le sable avec l’ail dans un bécher de 500 ml et utilisez de l’eau du robinet pour rincer les œufs restants de l’ail dans le bécher. À ce stade, les œufs flottent dans l’eau.
   2. Prenez un tamis de 100 mailles (voir le tableau des matériaux) et humidifiez-le avec de l’eau du robinet. Versez ensuite l’eau contenant les œufs flottants du bécher sur le tamis. Les œufs resteront sur le tamis.
   3. Une fois que les œufs ont séché naturellement sur le tamis, utilisez un pinceau pour balayer doucement les œufs sur une boîte de Pétri.
3. Le premier jour, rincez le dispositif de ponte pour recueillir les œufs sans désinfection ni stérilisation. Le deuxième jour, à quatre heures de l’après-midi, rincez à nouveau les œufs et ramassez-les en les tamisant à l’eau claire.
   REMARQUE : La collecte des œufs le deuxième jour permet d’assurer un taux de croissance constant dans les étapes suivantes. Quatre heures de l’après-midi, c’est le pic de ponte de D. antiqua. Ainsi, il est idéal de collecter les œufs à ce moment-là.
4. Placez les œufs collectés sur un tamis à cellules stériles (voir le tableau des matériaux) dans la paillasse ultra-propre (figure 3A).
5. Préparer la solution pour la stérilisation des ovules
   1. Prélever 5 mL de NaClO à 5,2 % (voir le tableau des matériaux) et le transférer dans une fiole conique stérilisée de 250 mL. Ajouter 95 mL d’eau stérilisée pour obtenir un volume total de 100 mL, ce qui donne une solution à 0,26 % de NaClO.
   2. Pour préparer une solution d’EtOH à 75 %, prélever 75 mL d’EtOH à 99,7 % et le transférer dans une fiole conique stérilisée de 250 mL. Ajouter 25 mL d’eau stérilisée pour obtenir un volume total de 100 mL, ce qui donne une solution d’EtOH à 75 %.
6. Versez 30 mL de NaClO dans une boîte de Pétri et versez 30 mL d’EtOH dans une autre boîte de Pétri. Placez le tamis contenant les œufs mentionnés à l’étape 2.4 dans le plat contenant du NaClO. Faites-le tremper dans la solution de NaClO à 0,26 % pendant 0,5 min. Transférez ensuite le tamis dans le plat contenant de l’EtOH, en le laissant tremper dans la solution d’EtOH à 75 % pendant 0,5 minute supplémentaire.
7. Répétez ce processus trois fois, en alternant entre 0,26 % de NaClO et 75 % d’EtOH toutes les 0,5 min. Après cela, des œufs axéniques seront obtenus. À ce stade, le tamis contenant les œufs doit être immergé dans l’EtOH.
   REMARQUE : Pour assurer une stérilisation complète, utilisez une pipette de 1 ml pour aspirer le NaClO et l’EtOH et disperser les ovules. Répétez le processus de rinçage plusieurs fois. Cette étape permettra de nettoyer davantage la surface des œufs des bactéries et des impuretés résiduelles, garantissant ainsi une surface propre et stérile.

3. Élevage de larves axéniques

1. Pour transférer les ovules stérilisés, utilisez une paire de ciseaux stérilisés à l’aide d’une lampe à alcool pour couper l’extrémité d’une pipette de 1 ml (figure 3B). Assurez-vous que l’ouverture de l’extrémité de la pipette coupée est plus grande que le diamètre des œufs (environ 2 mm). Ensuite, utilisez la pipette pour transférer les œufs de la solution d’EtOH (les œufs avec la solution) (Figure 3C) vers un tube à centrifuger contenant les aliments stériles, et chaque tube devrait contenir environ 20 à 50 œufs (Figure 3D). Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les ovules aient été transférés.
   REMARQUE : Le diamètre de la pointe de la pipette doit être aussi grand que possible pour éviter de casser les ovules pendant le transfert, ce qui pourrait entraîner leur mort.
2. Utilisez une pipette pour éliminer tout excès d’éthanol du tube. Placez le tube de centrifugation fermé avec des couvercles à l’intérieur d’un sac auto-obturant et placez un morceau de coton à l’ouverture du sac pour permettre la circulation de l’air. Enfin, placez le sac dans un incubateur à 25 °C (humidité relative : 50 %-70 % ; photopériode : 16 h lumière : 8 h obscurité) pour l’observation et la culture.
3. Environ trois jours plus tard, les œufs axéniques des régimes commencent à éclore (figure 4A). Les larves écloses seront actives et la surface des aliments stériles ne sera plus lisse. Les larves commenceront à se nourrir des régimes.
4. Continuez d’observer les larves jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade de larves du 2e^stade. Continuez à surveiller leur croissance et leur développement pendant cette période.
5. Après 9 à 12 jours, plus de 80 % des œufs se sont transformés en larves du 3e^{stade (}figure 4B). Cela indique une croissance et un développement réussis des larves.

4. Validation des larves axéniques avec des tests dépendants de la culture

1. Sélectionner au hasard trois larves axéniques de 3^e stade dans le tube à centrifuger.
2. Placez les larves dans une boîte de Pétri de 94 mm x 16 mm contenant 75 % d’alcool pour le nettoyage. Après cela, transférez-les dans un récipient avec de l’eau stérile pour un rinçage supplémentaire.
3. Utiliser une pince à dissection désinfectée qui a été stérilisée avec une solution d’EtOH à 75 % pour saisir les larves (la tête et la queue sont illustrées à la figure 5A). Utilisez des ciseaux à dissection pour retirer les extrémités de la tête et de la queue (figure 5B). Tenez la queue des larves avec la pince et utilisez une autre pince pour presser doucement de la queue à la tête et extraire les organes internes (le résultat illustré à la figure 5C). Placez les organes internes dans de l’eau déminéralisée et retirez doucement l’intestin en appuyant sur le tissu adipeux avec une pince, puis placez l’organe interne extrait (Figure 5D) dans de l’eau stérile pour une utilisation ultérieure.
4. Placez l’intestin dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml, ajoutez 500 μL de tampon PBS 1x stérilisé et utilisez un pilon jetable pour broyer le tissu intestinal en un homogénat.
5. Prenez 100 μL de l’homogénat et ajoutez-le dans un milieu gélosé nutritif. Utilisez un épandeur en forme de L (voir tableau des matériaux) pour strier la plaque de gélose.
6. Placez la boîte de Pétri dans un incubateur biochimique à 28 °C et incubez pendant 72 h pour observer la croissance des colonies.

5. Validation des larves axéniques avec des tests indépendants de la culture

1. Extraire l’ADN total du tissu intestinal des larves axéniques à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
2. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
3. Effectuer une réaction PCR à l’aide d’amorces universelles d’ARNr bactérien 16S (1492R : 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F : 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Le volume total de la réaction est de 25 μL et se compose d’une matrice d’ADN de 1 μL, d’une amorce directe de 0,5 μL, d’une amorce inverse de 0,5 μL, de 10,5 μL de ddH₂O et de 12,5 μL de 2x Taq PCR Master Mix (voir le tableau des matériaux). Régler les conditions de réaction PCR comme suit : dénaturation initiale à 94 °C pendant 3 min ; 35 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s, de recuit à 55 °C pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 90 s ; extension finale à 72 °C pendant 10 min. Conservez les produits PCR à 4 °C pour une analyse plus approfondie.
4. Effectuer une réaction PCR à l’aide d’amorces ITS fongiques universelles (ITS1 : 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4 : 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Le volume total de la réaction est de 25 μL et se compose d’une matrice d’ADN de 1 μL, d’une amorce directe de 0,5 μL, d’une amorce inverse de 0,5 μL, de 10,5 μL ddH₂O et de 12,5 μL de 2x Taq PCR Master Mix. Réglez les conditions PCR à 95 °C pendant 5 min ; 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 90 s ; suivi de 72 °C pendant 10 min. Conservez les produits PCR à 4 °C pour une analyse plus approfondie.
5. Utilisez le colorant d’acide nucléique Super Green (voir le tableau des matériaux) pour mélanger uniformément avec chacun des deux types de produits PCR, et analysez-les par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1 % dans un tampon 1 x TAE (dilué à partir de 50 x TAE, voir le tableau des matériaux). Utiliser 3 μL de marqueur d’ADN (voir le tableau des matériaux) comme référence.
6. Utilisez un transilluminateur UV pour observer le gel et localiser le fragment cible.

Résultats

Les stades de développement du D. antiqua sont illustrés à la figure 4. Le cycle de vie complet comprend les œufs, les larves, les pupes (figure 4C) et les adultes (figure 4D). Ils sont cultivés dans des tubes à centrifuger stériles, et leur apparence et leur taux de survie sont impossibles à distinguer de ceux de D. antiqua élevés dans des conditions non axéniques. Les temps de croissance et de dévelop...

Discussion

Les insectes possèdent un microbiote intestinal très complexe^20,21, ce qui nécessite l’utilisation d’insectes axéniques inoculés avec des souches microbiennes intestinales spécifiques pour étudier les interactions insectes-microorganismes. La préparation d’insectes axéniques est cruciale pour de tels efforts de recherche. Le traitement antibiotique est une méthode utilisée pour éliminer le microbiote intestinal. Par exemple, Jung et Kim,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μM filter bottle	Thermo Scientific	450-0045
0.22 μM Syringe Filter	Biosharp	BS-QT-011
100-mesh sieve	Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory	No Catalog numbers
1x PBS solution	Solarbio	P1020
2x Taq PCR Master Mix	GENVIEW	GR1113-1ML
5.2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80010428
500 mL Conical flask	Thermo Scientific	4103-0500
50 mL vented centrifuge tube	JET BIOFIL	BRT-011-050
50x TAE buffer	GENVIEW	GT1307
Agar powder	Ding Guo	DH010-1.1
Biochemical incubator	STIK	21040121500010
Cell sieve	SAINING	5022200
Choline chloride	Sangon Biotech	A600299-0100
ddH2O	Ding Guo	PER018-2
Disposable grinding pestle	JET BIOFIL	CSP-003-002
DNA extraction kit	Sangon Biotech	B518221-0050
DNA Marker	Sangon Biotech	B600335-0250
Ethanol absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Filter paper	NEWSTAR	1087309025
Food processor	Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.	WBL25B26
Illuminated  incubator	Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.	A16110768
L-Ascorbic acid	Sangon Biotech	A610021-0100
L-shaped spreader	SAINING	6040000
Nutrient agar medium	Hope Bio	HB0109
Scissors	Bing Yu	BY-103	Purchase on Jingdong
Shock incubator	Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.	2020000014
Sucrose	GENVIEW	CS326-500G
Super Green nucleic acid dye	Biosharp	BS355A
Super-clean table	Heal Force	AC130052
TSB	Hope Bio	HB4114
Vacuum pump	Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.	22051031
Yeast extract	Thermo Scientific	LP0021B