本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

展示了使用限制冲击射流 （CIJ） 混合器技术合成脂质纳米颗粒 （LNP） 的详细方案，包括两个射流 CIJ 和一个四射流多入口涡旋混合器 （μMIVM）。CIJ 混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而产生单分散 LNP。

摘要

脂质纳米颗粒 （LNP） 已证明其作为治疗递送载体的巨大潜力，两种 COVID-19 信使 RNA （mRNA） 疫苗的批准和全球使用就证明了这一点。在小规模上，LNP 通常是使用微流体制成的;然而，这些设备的局限性使其无法大规模使用。COVID-19 疫苗是使用受限撞击射流 （CIJ） 湍流混合器大批量生产的。CIJ 技术支持实验室规模的生产，并确信它可以扩展到生产量。CIJ 混合的关键概念是混合长度和时间尺度由混合腔中的湍流强度决定，并且纳米颗粒的形成发生在远离壁的地方，从而消除了表面沉积和结垢的问题。这项工作展示了使用具有两种几何形状的受限冲击射流混合器技术制造 LNP 的过程：双射流 CIJ 和四射流多入口涡旋混合器 （MIVM）。讨论了每种混合几何形状的优缺点。在这些几何形状中，LNP 是通过有机溶剂流（通常含有可电离脂质、共脂质和稳定 PEG 脂质的乙醇）与水性抗溶剂流（含有 RNA 或 DNA 的水性缓冲液）快速混合而形成的。介绍了 CIJ 和 MIVM 混合器的操作参数，以制备具有受控大小、zeta 电位、稳定性和转染有效性的可重现 LNP。还介绍了使用不良混合（移液溶液）制备的 LNP 与 CIJ 混合相比的差异。

引言

基于 mRNA 的疗法在治疗和预防多种疾病方面具有巨大潜力，包括传染病、遗传疾病和癌症1。与可以被动扩散穿过细胞膜的小分子治疗药物不同，核酸必须封装才能进行细胞内递送2。封装为 mRNA 提供结构和稳定性，促进其通过内吞途径在细胞内递送，并防止核酸酶等细胞内和细胞外成分降解3。已经开发了许多用于封装和递送 mRNA 的材料和纳米载体，包括无机纳米颗粒、聚合物、脂质和脂质样材料1。其中，LNP 已成为基于 mRNA 的治疗药物最突出的递送平台4。

LNP 由四种脂质成分组成：可电离脂质、胆固醇、两性离子脂质和 PEG-脂质稳定剂5。适合 mRNA 递送的可电离脂质在脂质疏水性和三元胺基6 的解离常数 （pKa） 之间表现出微妙的平衡。可电离脂质 pKa 的 pH 值通常介于 6.0 和 6.7 之间，例如 KC-2 （DLin-KC2-DMA）、MC-3 （DLin-MC3-DMA） 和 ALC-03157。这种对可电离脂质的 pKa 限制既能够将核酸聚合物封装为疏水性脂质盐，又可以通过“内体逃逸”过程进行细胞内递送。LNP 通过（各种）内吞途径进入靶细胞，这些途径都涉及内体从 pH 7.4 到 pH ~5 8 的酸化。可电离脂质 pKa 确保 LNP 在生理条件下具有近乎中性的表面，但在酸化内体中变为阳离子9。这种 pH 反应能够仅选择性地破坏内体膜，释放封装的核酸聚合物，并保持细胞活力，这与转染系统中使用的永久阳离子脂质体（如 Lipofectamine）不同。胆固醇是 LNP 结构中的疏水性间隙分子，可改善脂质流动性。两性离子脂质起着结构作用，并在 LNP 表面形成双层。聚乙二醇-脂质 （PEG-lipid） 是一种胶体稳定剂，通过将聚合物空间稳定剂施加到 LNP 表面来增强 LNP 的稳定性，从而抵抗 LNP 的聚集。这可以稳定 LNP，尤其是在 pH 值变化期间，可电离脂质的游离碱形式会再生，其行为类似于疏水油。Onpattro （patisiran） 配方（以下简称 LNP 配方）通常用作 LNP 配方的起点，其中可电离脂质 MC3、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱 （DSPC） 和 PEG2000-DMG 溶解在乙醇中，与 RNA10 水溶液混合。

有几种技术可用于制造封装核酸聚合物的 LNP，其中大多数技术都依赖于一个共同的主题，即快速混合含有脂质的乙醇流与含有目标核酸（siRNA、mRNA 或 DNA）的水流9,11,12,13,14 .在这方面，移液器混合和涡旋混合等本体混合过程提供了一种形成 LNP 的简单策略，无需使用复杂的仪器12。然而，批量混合不能提供组分的均匀分布，导致 LNP 尺寸分布不理想，并且批次间差异很大15。

实验室通常使用微流体混合技术，通过对混合条件进行更精确的控制来获得可重复的 LNP 12,13,16。然而，微流体器件中的层流条件是由于微流体室中的小长度尺度和低速度而固有的，导致溶剂/反溶剂混合相对较慢17。小腔室尺寸严重限制了 LNP 的 GMP 生产所需的通量和可扩展性，但研究人员已经平行化了微流体腔室，以尝试扩大生产量15。平行微流体几何结构并不能消除大体积加工过程中脂质吸附到表面的问题，这个问题通常被称为混合装置的“结垢”，并且存在流动的均匀性和稳定性问题，这使得微流体放大对工业规模生产具有挑战性18,19.制药公司使用湍流撞击射流混合器制造 COVID-19 疫苗接种 mRNA-LNPs20 也就不足为奇了。

载有 RNA 的 LNP 的生产过程需要将含有 RNA 有效载荷的水性缓冲流与含有四种不同脂质成分的乙醇流混合。这些配方使用 pH 值为 4.0 或更低的酸性缓冲液，当水和乙醇流混合时，该缓冲液会带电离脂质。带正电荷的可电离脂质与带负电荷的 RNA 静电相互作用，形成疏水性 RNA-脂质盐。疏水性脂质种类，包括 RNA-脂质盐，在混合溶剂中沉淀并形成疏水性细胞核。这些细胞核通过两性离子脂质和胆固醇的沉淀生长，直到达到足够的聚乙二醇化脂质吸附在 LNP 表面的临界点，从而停止进一步的生长成核和生长机制 21,22,23。向脂质溶液中添加水性缓冲液，直至脂质沉淀并形成 LNP，取决于两个不同的时间尺度：溶剂-反溶剂混合期 τ混合物和细胞核生长期 τagg。无量纲 Damköhler 数，定义为 Da = τmix/τagg，捕捉了这些时间尺度24 之间的相互作用。在缓慢混合的情况下 （Da > 1），LNP 的最终大小是受传输控制的，并且随混合时间而变化。相反，在快速混合过程中 （Da < 1），流体被碎片化成 Kolmogrov 长度的条纹或层，其中 LNP 的形成完全由每种成分的分子扩散控制，从而导致 LNP 形成的均匀动力学。实现后一种情况需要脂质浓度超过临界阈值，从而建立有利于均匀均匀成核的过饱和状态。

据估计，τagg 的范围从几十毫秒到几百毫秒25.在其最基本的配置中，两个流，一个包含带有脂质的乙醇，另一个包含带有 RNA 货物的水性缓冲液，被注入一个称为“受限撞击射流”（CIJ） 混合器的腔室中。当以适当的速度运行时，湍流涡流在 1.5 ms 内产生 1 μm 的溶剂/反溶剂条纹长度尺度。流速和混合几何决定了线性动量转换为混合流的湍流漩涡。这由无量纲数雷诺数 （Re） 参数化，它与流速成线性比例。Re 由 Re = Σ （ViDi/vi） 计算得出，其中 Vi 是每种蒸汽中的流速， vi 是每股气流的运动粘度，Di 是 2 射流 CIJ 装置26 中的流入口直径或 4 射流 MIVM 中的腔室直径27。注： CIJ 的一些参考仅使用单个射流直径和速度来定义 Re28。在微流体设备中，Re 在 1-100 的范围内，而在 CIJ 设备中，可以实现 125,000 的 Re。在 CIJ 混合器中，具有相同动量的流体发生碰撞，在撞击时以湍流混合的形式消散其动量，由于柯尔莫哥洛夫微尺度小，丹科勒数小，因此实现了高效的微混合。另一种类型的混合器是“多入口涡旋混合器”（MIVM），其中四个流被引导到一个中央腔室。在这种设置中，连续流入密闭混合室可确保明确定义的混合时间尺度。在两种类型的混合器中，所有流体元件都通过高能混合区。相比之下，像 T 型接头这样的简单混合装置不包含提供混合区的腔室，由于进入的流动量大部分偏向出口方向，而不是产生湍流涡流，因此两种流的混合较少。CIJ 和 MIVM 混合器都可以在分批或连续模式下运行，为各种规模的 LNP 生产提供了灵活性。

该协议描述了如何通过采用两种受限冲击射流技术来制造最佳 LNP 配方：2 射流 CIJ 和 4 射流 MIVM 混合器。CIJ 和 MIVM 混合器的操作先前已证明用于制备具有疏水性芯材的 NP29。该文章和视频应作为使用这些混合器形成 NP 的附加资源进行参考。本次更新侧重于基于脂质的 NP 形成。证明了通过改变微混合条件来调节 LNP 大小的能力。此外，与使用不良移液器混合制备的 LNP 相比，CIJ 技术在 HeLa 细胞中形成稳定的单分散 LNP 的效用， 体外转染 效率更高。此外，还讨论了每种 CIJ 混合几何形状的优缺点，以及扩大这些混合器所需的适当条件。

研究方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 缓冲液、溶剂和反溶剂流的制备

  1. 将所有脂质成分以给定质量浓度溶解在乙醇中，如 表 1 所示，制成 patisiran LNP 制剂10。使用前，通过温和的超声处理将溶液加热至 37 °C，以重新溶解任何沉淀的固体。
    注：可以制备几毫升的较大储备溶液，并将其储存在 4 °C 下。
  2. 通过将 186 mg 乙酸钠和 464 mg 乙酸混合在 80 mL 无核酸酶水中，制备浓度为 100 mM、pH 值为 4 的乙酸盐缓冲液。根据需要用浓 HCl 或 NaOH 调节 pH 值，并将最终体积补足至 100 mL。
  3. 通过将 23.82 g HEPES 盐溶解在 80 mL 无核酸酶水中，制备浓度为 1 M、pH 值为 7.5 的 HEPES 缓冲储备液。根据需要用浓 HCl 或 NaOH 调节 pH 值，并将最终体积补足至 100 mL。
  4. 用不含核酸酶的水稀释目标核酸聚合物和 100 mM 乙酸盐缓冲液储备液，在 30 mM 乙酸盐缓冲液中产生 300 μg/mL 的 RNA 溶液。为设计的实验准备足够体积的工作溶液，该方案需要 CIJ 和 MIVM 混合器总共 1500 μL。
    注：从供应商处获得的 RNA 已经在适当的缓冲液中，通常浓度为 10 mg/mL（酵母 RNA）或 1 mg/mL（荧光素酶编码 mRNA、LucRNA 或 GFP 编码 mRNA、GFP-RNA）。酵母 RNA 可用作沉淀的低成本模型 RNA。

2. 使用双射流 CIJ 混合器配制 LNP

  1. 设备的准备和清洁
    1. 使用前立即用乙醇冲洗混合器清洁 CIJ 混合器。用乙醇填充两个 5 mL 注射器，并将每个注射器锁定到 CIJ 的入口中。快速压下注射器，并将混合器流出物作为废液收集。
      注：CIJ 混合器可以按照前面29 的描述构建和操作。可以使用各种支撑架来固定 CIJ 混合器，包括环形支架、离心管支架或锥形瓶。CIJ 供应商列在 材料表 和 补充文件 1 中。
    2. 从 CIJ 中取出乙醇冲洗注射器。这些注射器可以储存和重复使用，用于 CIJ 的额外乙醇冲洗。
    3. 通过入口适配器吹出干燥的氮气流来干燥 CIJ 的内部通道。如果没有氮气，请仅使用未被泵油雾或气溶胶污染的干燥过滤空气。
  2. 溶剂和反溶剂液流的制备
    1. 混合脂质储备液并用额外的乙醇稀释，在 1.5 mL 微量离心管中产生 500 μL 表 1 中列出的 6 mg/mL 脂质溶液。
      注意：该配方是常用的 Onpattro 组合物，含有 50 摩尔% MC3、10 摩尔% DSPC、38.5 摩尔% 胆固醇和 1.5 摩尔% DMG-PEG2000。
    2. 将 100 mM pH 4 乙酸盐缓冲液原液稀释至 10 mM，总体积为 4 mL，作为 CIJ 混合器流出液淬火槽。
      注意：也可以在淬火槽中添加磁力搅拌棒。
    3. 在 1 mL 注射器中取出步骤 1.4 中制备的 500 μL RNA 溶液。倒置注射器，从含有核酸聚合物的水性抗溶剂流中排出任何空气。
    4. 在 1 mL 注射器中取出 500 μL 步骤 2.2.1 中制备的脂质溶液。倒置注射器并从含有脂质的乙醇溶剂流中排出任何空气。
  3. 在 CIJ 混合器中生产 LNP
    1. 将干净的 CIJ 混合器放在淬火浴样品瓶上。
      注意：环形支架夹或管架可为 CIJ 混合器提供方便的支撑。有关典型的 CIJ 设置，请参见 图 1A 。
    2. 将步骤 2.2.3 和步骤 2.2.4 中填充的两个注射器与 CIJ 混合器入口配合。
    3. 快速压下两个注射器以混合溶剂和反溶剂流，并在淬火池中收集脂质 NP。
      注意：注射器必须快速推进（在 1 秒内），但要平稳且均匀。不对称流动或慢速流动会产生多分散的大型 LNP。
    4. 从淬火槽上取下 CIJ 混合器，注射器仍连接。
      注意：请勿取出注射器或让滞留量流入淬火槽，因为这种材料混合不良，如果混入淬火槽中，将对生产分散性能产生不利影响。
    5. 将 CIJ 放在废液容器上并取出注射器，让残留的滞留体积流入废液容器。丢弃这些注射器并重复第 2.1 节中所述的清洁过程。
    6. 分析使用 CIJ 生成的 LNP，如下文第 5 节所述。

3. 使用四射流 MIVM 混合器配制 LNP

  1. 组装 MIVM 混合器，称为微型 MIVM （μMIVM），以区别于用于扩大生产的大型模型
    1. 收集组装 MIVM 混合器所需的所有单个组件：底部接收器、混合几何盘、顶部盘、O 形圈和扳手。
      注意：MIVM 的构建、组装和操作先前已证明用于疏水性物质的封装，供应商列在 补充文件 1 和 材料表29 中。有关组件和混合器支架术语的示意图，请参见 图 2 。
    2. 将 O 形圈插入混合盘的凹槽中。
    3. 将混合盘孔与顶部盘上的钉子对齐，并将它们推在一起，而不会移动 O 形圈。
    4. 将配合的混合盘、O 形圈和顶部盘组件松散地拧入底部接收器中。
      注：在此步骤之前，从底部接收器上拆下出口管路。
    5. 使用扳手将顶部磁盘拧紧到底部接收器中。
      注意：如果观察到螺纹磨损，可以将食品或制药级防卡化合物涂在顶部圆盘螺纹上。
    6. 将出口管接头插入并拧紧到底部接收器中，以完成 MIVM。
    7. 将组装好的 MIVM 安装到混合器支架中，使出口管通过支撑板流出。
      注意： 应定期执行调整 MIVM 混合器支架的程序，以确保正确配置混合器支架上的机械挡块29.
  2. 溶剂和反溶剂液流的制备
    1. 如 表 2 所示，将两种乙醇脂质溶剂流溶液混合在 1.5 mL 微量离心管中，稀释脂质储备液并根据需要添加额外的乙醇，以达到 6 mg/mL 的最终脂质浓度。
      注：这与 2.2.1 中的脂质溶液组成相同，但总体积为 1000 μL。
    2. 将 100 mM pH 4 乙酸盐缓冲液稀释至 10 mM，总体积为 8 mL，作为 MIVM 流出液淬火浴。
      注意：也可以在淬火槽中添加磁力搅拌棒。
  3. 使用 MIVM 混合器配制 LNP
    1. 将 8 mL 淬火槽放在混合管架下方，使流出管排入急温槽中。
    2. 使用钝头针头将溶剂和反溶剂流吸入 1 mL 气密注射器中。去除所有气泡并丢弃针头。通过倒置和排出注射器中的任何空气来灌注每个注射器。
    3. 将四个注射器按顺时针方向（注射器 1-4， 表 2）组装到混合器上，相对两侧具有相同的流。有关最终外观原理图，请参见 图 1B 。
    4. 握住移动板两侧的轴承座。避免将手指放在外壳的底面上，因为机械挡块会造成夹伤危险。小心地降低移动板，直到它均匀地放在注射器上。
      注意： 注射器柱塞在操作前必须全部处于相等的高度。
    5. 稳定而平稳地压下板，目标是在大约 0.5 秒到 1 秒内完成这些流体积的操作。
    6. 盖上包含 LNP 分散液的淬火槽。
    7. 使用后，请按照下面步骤 3.5 中的说明执行 MIVM 的清洁。
  4. 使用注射泵驱动的 MIVM 混合器配制 LNP
    1. 按照步骤 3.1 中的说明组装 MIVM。
    2. 以所需的成分制备溶剂和反溶剂溶液，并按所需的配方大小制备足够的体积（表 3）。
      注：这些成分与水性反溶剂（步骤 1.4）和乙醇溶剂（步骤 3.2.1）流相同，但按比例放大以用于 表 3 中较大的注射器体积。
    3. 将溶液装入 20 mL 容量的气密注射器中，并使用末端安装的鲁尔接头连接 PTFE 管。通过倒置注射器和管道，然后排出任何空气来灌注注射器和管道。
    4. 将注射器安装到注射泵中，并将注射器连接到 MIVM 上的混合器入口，如图 3A 所示。
      注意：CIJ 也可以通过 泵以相同的 方式操作，但只有一个反溶剂和溶剂流注射器。
    5. 将 100 mM pH 4 乙酸盐缓冲液原液稀释至 10 mM，总体积为 320 mL，作为 MIVM 流出液淬火浴。
    6. 将淬火槽放在 MIVM 出口下方。
    7. 将注射泵的体积流速设置为 20 mL/min。
      注：通过手动设置注射泵上的值，体积流速可在 2 mL/min 至 40 mL/min 之间变化，以形成具有不同微量混合条件的 LNP。
    8. 启动注射泵，但让前 10 秒的污水流入废液烧杯。在 10 秒启动流量期后，在淬火池中收集 MIVM 流出物。
    9. 取出并盖上含有 LNP 分散液的淬火槽，该浓度以选定的 （20 mL/min） 体积流速制成。
      注：通过选择合适的淬火槽体积，可以重复此过程以合成不同流速的 LNP。
    10. 在每次实验之间（改变流速时）通过冲洗至少两倍体积的出口管来清洁 MIVM，以防止在开始下一次 LNP 合成之前收集在前一个流速条件下产生的 LNP。
  5. 使用后的设备清洁
    1. 将混合器从支架上拆下，同时保持注射器的连接，并将其放在废液容器上。取出注射器，让滞留量排入容杯。然后，将混合器组件倒置，并使用扳手拆卸混合器。
    2. 用溶剂（例如乙醇）冲洗出口管路，并用空气或氮气干燥。
    3. 用合适的溶剂（如去离子水或乙醇）冲洗混合几何结构，然后用乙醇冲洗。使用空气或氮气流干燥组件。
    4. 用去离子水冲洗 O 形圈并吸干。
      注意： 如果 O 形圈看起来被拉伸或变形，请在使用前让它风干一夜。保持大量的 O 形圈库存，因为它们是易损件。如果形状在第二天之前没有恢复，请丢弃 O 形圈。
    5. 用溶剂彻底冲洗顶盘，使用空气或氮气流干燥表面和注射器接头。
    6. 用良好的溶剂（例如去离子水或乙醇）冲洗每个注射器。下次使用前，用乙醇进行最后一次冲洗并风干。

4. LNP 的后处理

  1. 缓冲液置换和乙醇去除
    1. 使用适当大小的透析盒和 20 kDa 截留分子量透析柱，在 pH 值为 7.4 的 10 mM HEPES 缓冲液中透析 LNP 分散液。
      注：此步骤既去除残留的 10% 乙醇，又通过用 HEPES 替换乙酸盐缓冲液来增加分散 pH 值。
    2. 将储备液 1 M HEPES 缓冲液稀释至 10 mM，总体积为 1 L。
    3. 使用注射器和针头将 LNP 分散液装入 12 mL 透析盒中。
    4. 将透析盒浸入 1 L HEPES 缓冲液中，并磁力搅拌外部缓冲液。3 小时后更换外部 HEPES 缓冲液，再过 3 小时后取出透析柱，总透析时间为 6 小时。
    5. 从透析柱中取出透析的 LNP 分散液，并丢弃用过的透析柱。
  2. 通过超速离心 浓缩 LNP 悬浮液
    1. 将悬浮液移液到适当大小的离心过滤器中，MWCO 为 100kDa30。
      注：离心过滤器有多种尺寸可供选择，通常从 0.5 mL 到 12 mL。
    2. 将分散液以 2000 x g 离心 10-20 分钟（在室温下），以将浓度增加约 5-20 倍。
      注：离心过程中，每 5 分钟检查一次样品，以确保剩余适量的液体。

5. LNP 的表征

  1. 使用动态光散射 （DLS） 进行流体动力学直径测量
    1. 将 750 μL 或 900 μL 制备好的 LNP 分散液（无需任何稀释）分别分配到塑料微量或方形比色皿中。
      注：较小的体积也可用于合适的比色皿。
    2. 为分散 LNP 的溶剂设置适当的粘度（即，对于 10 vol% 乙醇混合物，为 1.26 cP）。
    3. 在 25 °C 下以 173° 角收集背向散射光，然后使用 Stokes-Einstein 模型和 ISO 标准文件 13321：1996 E 中定义的光散射相关函数级数展开的第一个累积量确定 LNP 的大小。
    4. 重复测量至少 3 次。
  2. Zeta 电位测量
    1. 将 ~800 μL 制备的 LNP 分散体添加到折叠的毛细管 zeta 尺寸测定器中。
      注：为避免气泡滞留在毛细管通道内，将一半的液体分配到池中，倒置，然后旋转。
    2. 重复测量至少 3 次。
      注：缓冲液电导率应介于 0.2-2 milliSiemens/cm 之间，以获得最佳结果。
  3. 通过市售 RNA 定量试剂盒进行包封效率 （EE） 测量
    1. 使用不含核酸酶的水，将检测试剂盒中提供的适量 20x Tris-EDTA （TE） 缓冲液在 pH 7.5 下稀释至 1x 浓度。
    2. 制备 2 wt% 的 Triton X-100 溶液。
    3. 在 1x TE 缓冲液中稀释适量的 LNP 分散液，得到 RNA 的总质量浓度约为 0.6 μg/mL，乙醇含量低于 0.2 vol%。
    4. 制备与上一步类似的样品，但含有 0.5 wt.% Triton X-100，可有效溶解 LNP，分别在不存在和存在 Triton X-100 的情况下促进“游离”RNA 浓度和总 RNA 浓度的区分。
    5. 在 1x TE 缓冲液中制备适量浓度为 0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL 和 1.0 μg/mL 的对照 RNA 溶液。
      注：RNA 试剂盒最初可能需要稀释。
    6. 重复上一步，但浓度为 0.5 wt.% Triton X-100。
    7. 在 1x TE 缓冲液中将 Ribogreen 染料（试剂盒中提供）稀释 200 次。
    8. 将适当体积的稀释 Ribogreen 染料添加到所有制备的对照 RNA 和样品溶液中，无论是否含有 Triton X-100。染料应在对照 RNA 和样品溶液中以 2 倍的比例均匀稀释。因此，染料的总稀释度是测定试剂盒中其原始浓度的 400 倍。
    9. 涡旋混合容器。
    10. 准备一个 96 孔、未经处理、平底、不透明的板，以便在读板器中进行分析。
    11. 将 100 μL 体积的样品和 RNA 对照品分配到板的单独单元中。
      注意：观察含有 Triton X-100 的溶液中气泡的形成。每个样品至少进行 3 次重复，至少需要 350 μL 样品。
    12. 使用读板器在 485 nm 的激发波长和 528 nm 的发射波长下记录荧光强度，每个读数的照明持续时间约为 10 秒。无需摇晃。
      注意：EE 由中 figure-protocol-7408确定，其中 I与 Triton 和不 Triton 分别代表使用和不使用 Triton X-100 的样品的三个重复的平均荧光强度，而 a 与 Triton 和不使用 Triton 表示线性拟合到两个平均校准曲线的斜率，分别是31。

代表性结果

使用双流 CIJ 湍流混合器，可以使用相对少量的材料快速筛选最佳 LNP 配方，前提是它们以适当的速度运行。如图 3A 所示，由可编程注射泵驱动的 μMIVM 混合器用于强调在临界雷诺数以上实现充分微混合以形成小的单分散 LNP 的重要性。表 3 包含用于生产 LNP 的配方摘要，混合器设置遵循步骤 3.4 中概述的方案。LNP 大小的特征是动态光散射 （DLS） 与雷诺数的函数关系。如图 3B 所示，超过 5000 的临界 Re 后，会观察到小的单分散 LNP。此外，当通过手持操作或使用混合架（图 3B 中最右侧的数据点）均匀压下注射器时，可以访问高雷诺数 （~104-10 5）。如图 2A 所示的混合架同时均匀地压下所有注射器27。因此，此类 LNP 也具有最佳大小。如果混合不充分（即 Re 太小），会形成更大的 LNP。在低 Re （照片 1） 和高 Re （照片 2） 下形成的 LNP 代表照片如图 3B 所示。在低 Re 下制备的样品浑浊，表明存在大的胶体光散射结构（Tyndall 效应），但在高 Re 下形成的 LNP 由于来自较小胶体的较弱的蓝移散射而显得清晰。

可电离脂质具有不同的物理化学性质，这会影响用其他方面相同的脂质制剂生产的 LNP 的物理化学性质。CIJ 混频器（图 1A）用于测试这一点。 表 4 列出了使用 FDA 批准的两种可电离脂质制成的配方：ALC-0315 和 MC3。 图 4A 显示，ALC-0315 在 pH 5 下制造的 LNP 为 ~80 nm，而使用 MC3 制造的 LNP 为 ~60 nm。此外，在 pH 值为 5 时，MC3-LNP 具有正 zeta 电位 （~28 mV），而 ALC-LNP 具有中性 zeta 电位 （<10 mV）。表面电荷以及 LNP 整体大小的这种差异源于两种脂质的 pKa。MC3 的 pKa 高于 ALC0315 （6.09）32;因此，较高比例的 MC3 脂质在 pH 值为 5 时充电。两种制剂都含有 1.5 mol% PEG-脂质稳定剂;然而，MC3-LNP 在扩散限制聚集期间由于 LNP 组装过程中的静电排斥较大，从而在较小尺寸下阻止生长，因此稳定在较小的尺寸上。两种配方都显示出高包封效率 （>90%），如图 4B 所示。脂质的化学性质对于决定 LNP 的整体性质和性能至关重要，因此，必须根据目标应用仔细选择它们。

使用两种湍流混合器几何形状（步骤 2.3 和步骤 3.3）制成的 LNP 具有相似的物理化学性质。这种比较进一步扩展到由不良混合技术（例如大容量移液器混合）制成的 LNP，以进一步说明湍流混合器和不均匀混合技术之间的区别（图 1C）。 表 5 提供了用于制造 LNP 的配方摘要，如图 5 所示。在移液器混合技术的情况下，通过上下移液 15-20 秒快速混合等体积的乙醇和水流，然后将混合物移液到 pH 值为 4 的乙酸盐缓冲浴中。 图 5A 显示，无论使用的混合器几何形状（CIJ 或 MIVM）如何，淬灭 10 mM 乙酸盐缓冲浴（pH 4,10 vol% 乙醇）中 LNP 的大小都非常相似且很小 （~50 nm）。然而，使用移液器混合制成的 LNP 的大小是使用湍流混合器制成的 LNP 的两倍。这表明，由不同 CIJ 几何形状制成的 LNP 在以足够高的速度（高于临界雷诺数的湍流状态）制造时表现出相似的特性，而混合不良会导致更大的多分散 LNP。

接下来，用 pH 值为 7.4（100 倍体积）的 10 mM HEPES 缓冲液透析 LNP，以除去乙醇并将 pH 值切换到 7.4。在此过程中，有一些 LNP 融合并生长到稍大的尺寸，如图 5A 所示，这与文献33 中经过充分研究的融合机制一致。总体而言，使用 CIJ 和 MIVM 混合器制备的 LNP 小于 100 nm，而使用移液器混合制备的 LNP 约为 140 nm。如图 5B 所示，这些配方的 zeta 电位小于 10 mV，表明它们在 pH 值为 7.4 时都是中性的。此外，它们都显示出 >95% 的高包封效率（图 5C）。因此，使用湍流混合器技术可以很容易地制造具有最佳物理化学特性的 LNP。通过在 HeLa 细胞中进行 体外 转染来评估这些 LNP 的性能。

基于荧光素酶的体外转染测定方案采用先前的出版物34。图 6A 绘制了表 5 中总结的三种配方的每 1000 个细胞的发光 （RLU）。使用 Lipofectamine 3000 作为阳性对照。需要注意的是，lipofectamine 3000 通常用于 DNA 制剂;然而，在这些实验中，它作为适当的对照起作用。使用 2 喷头 CIJ 和 4 喷头 MIVM 混合器制备的 LNP 的转染效果比使用移液器混合制备的 LNP 好得多。尽管由于每个 LNP 的有效载荷更大，预计较大的颗粒比小颗粒转染得更好，但在这里使用移液器混合制备的 LNP 的转染效果较差。这显然意味着，与使用移液器混合制成的 LNP 相比，使用 CIJ 技术制备的 LNP 的结构存在显着差异。使用 CIJ 和 MIVM 混合器制备的 LNP 的转染效率基本相同。Lipofectamine 3000 的转染效率最低。图 6B 使用基于刃天青钠盐35 的细胞活力测定法评估 LNP 对 HeLa 细胞的体外毒性。所有制剂均显示出低细胞毒性，当绘制为活细胞的百分比时，与未进行任何纳米颗粒处理的对照相比，表现为高水平的细胞活力。

figure-representative results-3215
图 1：生产 LNP 的混合方法。 （A） 双射流受限撞击式射流混合器 （CIJ） 显示了透明混合器和实验室中经常使用的组装 Delrin 混合器装置的照片。（B） 四射流微型多入口涡旋混合器 （μMIVM），显示了透明混合器以及组装好的不锈钢和 Delrin 混合器设置的照片。透明混合器的入口流已移至混合器的侧面，以便更好地观察混合几何形状，而在实际混合器中，入口流从顶部进入。CIJ 和 μMIVM 都以足够的液体速度运行，使流动处于湍流状态，混合产生小于 1 μm 的 Kolmogorov 微量，从而能够在 ~1.5 ms 内达到过饱和度。（C） 移液器混合装置广泛用于通过混合水溶液和乙醇溶液制备小体积 LNP 分散体。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-3896
图 2：μMIVM 及其混合架的扩展视图。 （A） 组装好的 μMIVM，带有玻璃注射器，位于混合器支架下方，有助于均匀和快速地压入注射器。该图转载自 Markwalter 等人29。（B） 拆解后的 μMIVM 显示内部组件。这种混合几何形状与 图 1B 中的透明混合器相同，只是入口流通过顶部圆盘进入，而不是通过横向圆柱形表面。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-4464
图 3：在湍流混合器中增加雷诺数会使 LNP 流体动力学直径减小到平台临界雷诺数。 （A） 注射泵和 μMIVM 设置的示意图，用于通过设置流体积流速来控制湍流混合器中的雷诺数。（B） MIVM 中 LNP 流体动力学直径与雷诺数的关系。增加雷诺数和湍流能量耗散可以改善混合，并导致更均匀的混合、过饱和和颗粒生长。在临界雷诺数以上，由于 Da<<1 条件，即溶剂/反溶剂扩散时间短于 NP 组装时间，LNP 大小随着流速的增加而保持不变。给出的流速是所有四个流的总流速。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-5047
图 4：用不同可电离脂质生产的 LNP 的胶体特性。 （A） 用两种不同的可电离脂质 ALC-0315 和 MC3 产生的 LNP 的流体动力学直径和 zeta 电位。在 LNP 形成后，在淬火槽中以 pH 值为 5 进行测量。可电离脂质的表观 pKa 的差异会影响 LNP 的胶体特性。（B） 两种 LNP 的包封效率测量值（n = 3，误差线代表一个标准偏差）。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-5578
图 5：使用 MC3 可电离脂质封装荧光素酶 mRNA 的不同混合器产生的 LNP 的胶体特性。 （A） 使用 2 射流、4 射流和移液器混合器生产的 LNP 的流体动力学直径。在 LNP 形成后（左侧）和透析成中性 HEPES 缓冲液后（右侧）的淬火槽酸性条件下进行测量。由于可电离脂质的去离子，LNP 大小在 pH 中和过程中增加，导致 LNP 融合和生长。脂质-PEG 稳定剂在形成微米级沉淀物之前阻止这种颗粒聚结生长。（B） 在 10 mM HEPES （pH 7.4） 条件下透析 LNP 的表面电荷测量（作为 ζ 电位）。所有 LNP 都在 2 mV 到 0 mV 的范围内，这表明这些粒子表面是中性的，只有几乎无法检测到的阳离子电荷量。（C） LNP 透析后的包埋效率测量值（n = 3，误差线代表一个标准偏差）。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-representative results-6307
图 6：用制备的 LNP 转染 HeLa 细胞。 （A） 用荧光素处理后表达的荧光素酶的发光。（B） 与 LNP 孵育后 HeLa 细胞的活力。如刃天青代谢测定所示，细胞的活力没有统计学意义的变化（n = 4，误差线代表一个标准偏差）。 请单击此处查看此图的较大版本。

流 /
淬火槽		元件配方股票卷
注射器 1 -
乙醇流
（6 毫克/毫升总脂质）		可电离脂质 （MC3）50 摩尔%50 毫克/毫升0.5 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 2 -
水流
（0.3 毫克/毫升 RNA）		酵母 RNAN/P 610 毫克/毫升0.5 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 4100 毫米，pH 4
淬火槽乙酸盐缓冲液10 毫米，pH 值 4100 毫米，pH 44 毫升

表 1：由 CIJ 混合器生产的标准 patisiran LNP 配方。 酵母 RNA 用作该方案的模型 RNA。所有溶液都经过分子溶解并充分混合，然后装入注射器中。

流 /
淬火槽		元件配方股票卷
注射器 1 -
乙醇流
（6 毫克/毫升总脂质）		可电离脂质 （MC3）50 摩尔%50 毫克/毫升0.5 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 2 -
水流
（0.3 毫克/毫升 RNA）		酵母 RNAN/P 610 毫克/毫升0.5 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 4100 毫米，pH 4
注射器 3 -
乙醇流
（6 毫克/毫升总脂质）		可电离脂质 （MC3）50 摩尔%50 毫克/毫升0.5 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 4 -
水流
（0.3 毫克/毫升 RNA）		酵母 RNAN/P 610 毫克/毫升0.5 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 4100 毫米，pH 4
淬火槽乙酸盐缓冲液10 毫米，pH 值 4100 毫米，pH 48 毫升

表 2：由 MIVM 混合器产生的标准 patisiran LNP 配方。 MIVM 混合器使用四个流 - 两个溶剂和两个反溶剂。可以使用动量不相等的流;但是，此协议选择具有相同 momenta 的流。

流 /
淬火槽		元件配方股票卷
注射器 1 -
乙醇流
（6 毫克/毫升总脂质）		可电离脂质 （MC3）50 摩尔%50 毫克/毫升20 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 2 -
水流
（0.3 毫克/毫升 RNA）		酵母 RNAN/P 610 毫克/毫升20 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 4100 毫米，pH 4
注射器 3 -
乙醇流
（6 毫克/毫升总脂质）		可电离脂质 （MC3）50 摩尔%50 毫克/毫升20 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 4 -
水流
（0.3 毫克/毫升 RNA）		酵母 RNAN/P 610 毫克/毫升20 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 4100 毫米，pH 4
淬火槽
（收集时间
= 30 秒）		HEPES 缓冲液10 毫米，pH 7.51 M，pH 值 7.5320 毫升

表 3：由注射泵驱动的 MIVM 混合器生产的 LNP 配方。 DODMA 用作可电离脂质，酵母 RNA 用作模型 RNA。该方案选择以 40 mL/min 的速度运行示例。

流 /
淬火槽		元件配方股票卷
注射器 1 -
乙醇流
（12 mg/mL 总脂质）		可电离脂质（MC3 或 ALC0315）50 摩尔%50 毫克/毫升0.5 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 2 -
水流
（0.6 毫克/毫升 RNA）		酵母 RNAN/P 610 毫克/毫升0.5 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 值 5100 毫米，pH 值 5
淬火槽乙酸盐缓冲液10 毫米，pH 值 5100 毫米，pH 值 59 毫升

表 4：由 CIJ 混合器生产的两种不同可电离脂质的 LNP 配方。 配方由 ALC-0315 或 MC3 制成，而所有其他成分保持不变。

流 /
淬火槽		元件配方股票卷
注射器 1 -
乙醇流
（6 毫克/毫升总脂质）		可电离脂质 （MC3）50 摩尔%50 毫克/毫升0.5 毫升
两性离子脂质 （DSPC）10 摩尔%5 毫克/毫升
胆固醇38.5 摩尔%5 毫克/毫升
聚乙二醇化脂质 （DMG-PEG2000）1.5 摩尔%4 毫克/毫升
注射器 2 -
水流
（0.3 毫克/毫升 RNA）		FLuc mRNA 抗体N/P 61 毫克/毫升0.5 毫升
乙酸盐缓冲液20 毫米，pH 4100 毫米，pH 4
淬火槽乙酸盐缓冲液10 毫米，pH 值 4100 毫米，pH 44 毫升

表 5：由 CIJ 混合器生产的标准 patisiran LNP 配方。 表达荧光素酶蛋白的 FLuc mRNA 用于使用生物发光测定法测量基因表达。

补充文件 1：CIJ 和 MIVM 混合器的供应商。请点击此处下载此文件。

讨论

已经提出了使用两个受限撞击射流湍流混合器合成含有核酸聚合物的 LNP。当以适当的速度进行时，CIJ 湍流混合器确保混合的时间尺度短于 LNP 组装时间，从而产生均匀的过饱和条件，以形成具有窄尺寸分布的小 LNP21。因此，使用不同湍流混合器几何形状（2 射流 CIJ 和 4 射流 MIVM 混匀器）用相同化学成分制备的 LNP 表现出相似的物理化学性质，并显示出良好的转染效率（图 5 和 图 6）。相比之下，使用移液制备的 LNP 会产生更差的混合，导致 LNP 更大、多分散性更高（图 5A），转染效率较低。人们早就知道，混合和组装动力学在 LNP 加工中起着重要作用;Cullis 等人指出，乙醇和缓冲液的快速对流-扩散混合会导致形成尺寸分布较窄的小颗粒，而缓慢扩散混合会导致较大颗粒具有较宽的尺寸分布9。CIJ 湍流混合器中混合的时间尺度与流向混合器的入口流速成比例减小27。这可以通过无量纲雷诺数 （Re） 来量化，该数测量惯性力和粘性力之间的比率。CIJ 和 MIVM 混合室内部的湍流发生在足够高的 Re 下，因此湍流涡流拉伸导致小长度尺度，从而通过扩散产生快速的溶剂/反溶剂混合。湍流长度尺度取决于 Re，而不是混合装置的特定几何形状。这就是为什么 CIJ 或 MIVM 产生相同的 LNP 颗粒，以及为什么不同尺寸的 MIVM 混合器产生相同的 NP 大小27。在高 Re 对应于高入口速度时，可以可重复地制备 LNP，而不会出现批次间变化（图 3B）。

该方案能够使用湍流 CIJ 混合器配制具有不同物理化学性质的各种 mRNA、DNA 或 siRNA LNP。除了允许成分和浓度的多功能性外，该技术还为在实验室销售（几毫克）时快速筛选配方和以 5 L/min 的生产率将先导配方放大到更大的工业批量提供了一条清晰的途径36。这一直是其他几种技术的主要障碍，包括体混和微流体。例如，批量加工技术无法始终如一地可重复地生产 LNP，即使是几毫升规模的 LNP。微流体技术比散装混合技术有了显着改进，能够生产均匀且可重复的 LNP;然而，它们仅在毫克范围内29。如引言中详述的那样，微流体器件的并行化尝试扩展到生产规模，但并不能消除结垢问题，并且它不能像基于受限撞击射流技术的混合器那样成功扩展。

除了这些优势外，CIJ 混合器还将有助于制造具有靶向能力或进行基因编辑的下一代 LNP。目前的 LNP 配方具有具有相似扩散率的脂质和核酸，因此，即使在实验室规模下混合略微不佳，也可以制造它们。然而，基因编辑方法可能需要封装分子量差异很大的核酸种类，例如小的向导 RNA 分子和大的 mRNA 转录本，以编码 CAS9 蛋白37。这些不同物种的非常不同的扩散时间尺度使得以化学计量比进行均匀包埋具有挑战性。随着混合效率变差，这种均匀封装的问题变得更加明显。同样，靶向非肝细胞可能需要掺入强结合的慢扩散稳定剂（例如具有靶向配体的大分子量嵌段共聚物）。在纳米颗粒组装之前，可以将大至 14 kDa 的靶向配体偶联到封闭共聚物上，这使得它们能够使用 CIJ 混合均匀掺入 NP中 38。CIJ 湍流混合器是制造由具有不同扩散率的部件制成的 LNP 的有用工具。

虽然 CIJ 湍流混合器在配制 LNP 方面表现出优于其他混合器的多项优势，但重要的是要注意与每种几何形状相关的局限性。2 射流 CIJ 混合器要求两个入口流（乙醇和水）具有相等的动量（在 10%-30% 以内），以便在腔室中实现均匀的湍流微混合。出口流由 50：50 溶剂/反溶剂组成，这一事实限制了发生沉淀的混合腔中的过饱和度水平29。4 射流 MIVM 混合器解决了这一缺点，因为它可以利用四个动量不等的射流在混合室中实现高过饱和度条件。此外，两种混合器都要求达到总质量的毫克级，这使得它们不是许多不同 LNP 配方的高通量筛选的理想选择。对于简单的 LNP 制剂，最好使用微流控或微克级移液策略进行筛选，然后在确定一些先导制剂后转移到受限撞击射流技术。考虑混合器中的死体积也很重要。在 CIJ 中，两个喷射混合器，滞留量为 50-100 微升。在计算工艺回收率时，必须从淬火池中捕获的材料量中减去该材料量。这些损失在大规模操作时微不足道，但当产生 5 mL 的总体积时，这些损失将占 10%，如下所示。冲击式射流湍流混合器是在 GMP 规模生产 LNP 的宝贵工具，FDA 批准的两种 COVID-19 疫苗就证明了这一点。

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

BKW 的 NSF 奖学金 （DGA1148900），来自 Tessera Therapeutics Inc.、Bill and Melinda Gates Foundation（BMGF，合同编号 OPP1150755 和 INV-041182）以及 FDA 的支持，授予 75F40122C00186。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
18:0 PC (DSPC)Avanti Polar Lipids850365PHelper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide NeedleBD305167
96 Well Black Wall Black Bottom PlateFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC SurfaceThermo Fisher Scientific165306
Acetic Acid, GlacialFisher ScientificA38-212
ALC-0315Avanti Polar Lipids890900Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mLMillipore SigmaUFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mLMillipore SigmaUFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2620
CholesterolMillipore SigmaC8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)Trilink BiotechnologiesL-7202
Confined Impinging Jets MixerHolland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)N/AContact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA MedChemExpressHY-112251 Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific11995065
DMG-PEG 2000Avanti Polar Lipids880151PPEG-lipid
DODMAAvanti Polar Lipids890899PIonizable lipid
Ethanol 200 ProofDecon Labs, Inc.2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United StatesThermo Fisher Scientific16000044
HeLaATCCCCL-2
HEPES, free acidIBI ScientificIB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL LuerHenke Sass Wolf4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer LockHenke Sass Wolf4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing figure-materials-3228” OD 0.093” IDIdex Health & Science1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fittingIdex Health & ScienceP-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubingIdex Health & ScienceP-940
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo Fisher ScientificL3000001
Luer fittingIdex Health & ScienceP-604Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer standHolland Applied TechnologiesN/ASee Markwalter &  Prud'homme for design.26 Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex MixerHolland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)N/AContact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)C.E. ConoverMM1.5 35.50 V75Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule - CIJIdex Health & ScienceP-200Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting - CIJIdex Health & ScienceP-205Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting - MIVMIdex Health & ScienceP-942Combination with ferrule
Outlet tubing - CIJIdex Health & Science1517Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing - MIVMN/AN/AFit to ferrule ID.
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
PHD 2000 Programmable Syringe PumpHarvard ApparatusN/A
Plastic two-piece syringe 1 mLThermo Fisher ScientificS7510-1
Plug fittingIdex Health & ScienceP-309Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificR11491
Resazurin, Sodium SaltThermo Fisher ScientificR12204
RNase AWAY Surface DecontaminantThermo Fisher Scientific7000TS1
Scintillation vialDWK Lifesciences74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mLSGE100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mLSGE50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCOThermo Fisher Scientific66012
Sodium AcetateMillipore Sigma32319-500G-R
Sodium HydroxideFisher ScientificS320-500
SucroseMillipore SigmaS7903-1KG
Syringe Filters, SterileGenesse Scientific25-243
Triton X-100Millipore Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056
Water, Endotoxin FreeQuality Biological118-325-131RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM7118

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