סינתזה של ננו-חלקיקי שומנים על ידי זרימה טורבולנטית במערבלי סילון פוגעים מוגבלים

Summary

הודגם פרוטוקול מפורט לסינתזה של ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) באמצעות טכנולוגיות מיקסר סילון פוגע כלוא (CIJ), כולל CIJ דו-סילוני ומערבל מערבולות רב-סילוני בעל ארבעה סילונים (μMIVM). מערבלי CIJ יוצרים סביבות מיקרו-ערבוב טורבולנטיות הניתנות לשחזור, וכתוצאה מכך מייצרים LNPs חד-מפוזרים.

Abstract

ננו-חלקיקי שומנים (LNPs) הוכיחו את הפוטנציאל העצום שלהם ככלי משלוח טיפוליים, כפי שמעידים האישור והשימוש העולמי בשני חיסוני RNA שליח COVID-19 (mRNA). בקנה מידה קטן, LNPs מיוצרים לעתים קרובות באמצעות microfluidics; עם זאת, המגבלות של מכשירים אלה מונעות את השימוש בהם בקנה מידה גדול. חיסוני COVID-19 מיוצרים בכמויות גדולות באמצעות מערבלים מערבלים טורבולנטיים של סילון פוגע (CIJ). טכנולוגיית CIJ מאפשרת ייצור בקנה מידה מעבדתי מתוך ביטחון שניתן להתאים אותו להיקפי ייצור. מושגי המפתח בערבוב CIJ הם שאורך הערבוב וסקאלת הזמן נקבעים על ידי עוצמת המערבולות בחלל הערבוב וכי היווצרות הננו-חלקיקים מתרחשת הרחק מהקירות, מה שמבטל את בעיית השקיעה על משטחים ועכירות. עבודה זו מדגימה את תהליך הייצור של LNPs באמצעות טכנולוגיית מערבל סילון מוגבל עם שני גיאומטריות: CIJ דו-סילוני ומערבל מערבולות רב-סילוני ארבעה סילונים (MIVM). היתרונות והחסרונות של כל גיאומטריית ערבוב נדונים. בגיאומטריות אלה, LNPs נוצרים על ידי ערבוב מהיר של זרם ממס אורגני (בדרך כלל אתנול המכיל את הליפידים המיוננים, קו-ליפידים וליפידים מייצבים PEG) עם זרם אנטי-ממס מימי (חיץ מימי המכיל RNA או DNA). פרמטרי ההפעלה של מערבלי CIJ ו- MIVM מוצגים להכנת LNPs הניתנים לשחזור עם גודל מבוקר, פוטנציאל zeta, יציבות ויעילות טרנספקציה. כמו כן מוצגים ההבדלים בין LNPs שנעשו עם ערבוב גרוע (פתרונות פיפטינג) לעומת ערבוב CIJ.

Introduction

טיפולים מבוססי mRNA טומנים בחובם פוטנציאל רב לטיפול ומניעה של מגוון רחב של מחלות, כולל מחלות זיהומיות, הפרעות גנטיות וסרטן¹. שלא כמו טיפולים במולקולות קטנות, שיכולים להתפזר באופן פסיבי על פני קרום התא, חומצות גרעין חייבות להיות עטופות להעברה תוך-תאית². אנקפסולציה מספקת הן מבנה והן יציבות ל-mRNA, מקלה על העברתם התוך-תאית דרך מסלולים אנדוציטיים וכן מונעת התפרקות מרכיבים תוך-תאיים וחוץ-תאיים כגון נוקלאזות³. שורה של חומרים וננו-נשאים פותחו עבור אנקפסולציה והעברה של mRNA, כולל ננו-חלקיקים אנאורגניים, פולימרים, ליפידים וחומרים דמויי שומנים¹. בין אלה, LNPs התגלו כפלטפורמת האספקה הבולטת ביותר עבור טיפולים מבוססי mRNA⁴.

LNPs מורכבים מארבעה רכיבי שומנים: שומנים מיוננים, כולסטרול, שומנים זוויטריונים ומייצב שומנים PEG⁵. ליפידים מיוננים המתאימים להעברת mRNA מפגינים איזון זהיר בין הידרופוביות השומנים לבין קבוע הדיסוציאציה (pKa) של קבוצת אמין טרינרית⁶. pKa השומנים המיוננים בדרך כלל יש pH בין 6.0 ל 6.7, כגון KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) ו- ALC-0315⁷. הגבלת pKa זו על השומנים המיוננים מאפשרת הן את האנקפסולציה של פולימרים של חומצות גרעין כמלחי שומנים הידרופוביים והן את ההעברה התוך-תאית באמצעות תהליך "בריחה אנדוזומית". LNPs נכנסים לתא המטרה דרך מסלולי אנדוציטוזה (שונים) שכולם כרוכים בהחמצה של האנדוזום מ- pH 7.4 ל- pH ~ 5⁸. pKa השומנים המיוננים מבטיח של-LNPs יהיו משטחים כמעט ניטרליים בתנאים פיזיולוגיים, אך יהפכו לקטיוני באנדוזום⁹ חומצי. תגובת pH זו מאפשרת שיבוש סלקטיבי של הממברנה האנדוזומלית בלבד, שחרור פולימר חומצת הגרעין העטוף, ומשמרת את יכולת הקיום של התא, בניגוד לשומנים קטיוניים קבועים המשמשים במערכות טרנספקציה כגון ליפופקטמין. כולסטרול הוא מולקולה הידרופובית, אינטרסטיציאלית במבנה LNP המשפרת את נזילות השומנים. השומנים הזוויטריוניים ממלאים תפקיד מבני ויוצרים דו-שכבה על פני השטח של LNP. פולי(אתילן גליקול)-ליפיד (PEG-lipid) הוא מייצב קולואידי המשפר את יציבות LNP על ידי הקניית מייצב סטרי פולימרי על משטח LNP, אשר מתנגד לצבירה של LNPs. זה מייצב את LNP, במיוחד במהלך שינויים ב- pH המחדשים את צורת הבסיס החופשי של השומנים המיוננים שמתנהגים כמו שמן הידרופובי. מתכון Onpattro (patisiran) (להלן, המכונה נוסחת LNP) משמש לעתים קרובות כנקודת מוצא לניסוח LNP עם שומנים מיוננים MC3, כולסטרול, distearoylphosphatidylcholine (DSPC), ו PEG2000-DMG מומס אתנול מעורבב נגד תמיסה מימית של RNA¹⁰.

ניתן להשתמש במספר טכניקות לייצור LNPs העוטפים פולימרים של חומצות גרעין, כאשר רובן מסתמכות על נושא משותף של ערבוב מהיר של זרם אתנול המכיל שומנים עם זרם מימי המשלב את חומצת הגרעין המעניינת (siRNA, mRNA או DNA)9,11,12,13,14 . בהקשר זה, תהליכי ערבוב בתפזורת כגון ערבוב פיפטה וערבוב מערבולות מציעים אסטרטגיה פשוטה ליצירת LNPs המבטלת את הצורך בשימוש במכשירים מתוחכמים¹². עם זאת, ערבוב בתפזורת אינו מספק התפלגות הומוגנית של רכיבים, מה שמוביל לפיזור גודל LNP תת-אופטימלי יחד עם שונות משמעותית בין אצווה^{לאצווה 15}.

מעבדות משתמשות באופן שגרתי בטכניקות ערבוב מיקרופלואידיות כדי להשיג LNPs הניתנים לשחזור על ידי השגת שליטה מדויקת יותר על תנאי הערבוב 12,13,16. עם זאת, תנאי הזרימה הלמינרית בהתקנים מיקרופלואידים, הטבועים בשל קשקשי האורך הקטנים והמהירויות הנמוכות בתא מיקרופלואידיקה, גורמים לערבוב איטי יחסית של ממס/אנטי-ממס¹⁷. ממדי התא הקטן מגבילים מאוד את התפוקה והמדרגיות הדרושות לייצור GMP של LNPs, אך חוקרים הקבילו תאים מיקרופלואידים כדי לנסות להגדיל את נפחי הייצור¹⁵. גיאומטריה מקבילית של מיקרופלואידיקה אינה מבטלת את בעיית ספיחת השומנים למשטחים במהלך עיבוד בנפח גדול, בעיה המכונה בדרך כלל "עבירה" של מכשיר הערבוב, וישנן בעיות באחידות וביציבות של זרימות שהופכות את קנה המידה של המיקרופלואידיקה למאתגר לייצור בקנה מידה תעשייתי^18,19. אין זה מפתיע שחברות התרופות השתמשו במערבלי סילון סוערים כדי לייצר mRNA-LNPs²⁰ לחיסון COVID-19.

תהליך הייצור של LNPs עמוסי RNA כרוך בערבוב של זרם חיץ מימי המכיל את מטען הרנ"א עם זרם אתנול המכיל את ארבעת רכיבי השומנים השונים. נוסחאות אלה משתמשות בחיץ חומצי עם pH של 4.0 או פחות, אשר טוען את השומנים המיוננים כאשר הזרמים המימיים והאתנוליים מתערבבים. השומנים המיוננים בעלי הטעון החיובי מתקשרים אלקטרוסטטית עם הרנ"א הטעון שלילית, ויוצרים מלח RNA-ליפידים הידרופובי. מיני שומנים הידרופוביים, כולל מלח RNA-שומנים, מזרזים בממסים המעורבים ויוצרים גרעינים הידרופוביים. גרעינים אלה גדלים דרך משקעים של שומנים זוויטריונים וכולסטרול עד שהם מגיעים לנקודה קריטית שבה מספיק שומנים פגילטיים נספגים על פני השטח של LNPs, ועוצרים את המשך הצמיחה -נוקלציה ומנגנון גדילה 21,22,23. הוספת חיץ מימי לתמיסת השומנים, במידה שבה שומנים שוקעים ונוצרים LNPs, תלויה בשני סקאלות זמן נפרדות: תקופת הערבוב ממס-אנטי-ממס,_תערובת τ, ותקופת צמיחת הגרעינים, τ_agg. מספר דמקוהלר חסר הממדים המוגדר כ-Da = τ_mix/τ_agg, לוכד את יחסי הגומלין בין סקאלות זמן אלה²⁴. במקרים של ערבוב איטי (Da > 1), הגודל הסופי של LNPs הוא מבוקר הובלה ומשתנה עם זמן הערבוב. לעומת זאת, במהלך ערבוב מהיר (Da < 1), הנוזל מתפרק לשכבות או שכבות באורך קולמוגרוב (Kolmogrov), כאשר היווצרות LNP נשלטת אך ורק על ידי הדיפוזיה המולקולרית של כל מרכיב, וכתוצאה מכך נוצרת קינטיקה הומוגנית של היווצרות LNP. השגת התרחיש האחרון דורשת כי ריכוז השומנים יעלה על סף קריטי, יצירת מצב של סופר-רוויה התורם לנוקלציה הומוגנית אחידה.

ההערכה היא כי τ_agg נע בין כמה עשרות לכמה מאות אלפיות השנייה²⁵. בתצורתו הבסיסית ביותר, שני הזרמים, האחד מכיל אתנול עם שומנים והשני מכיל חיץ מימי עם מטען RNA, מוזרקים לתוך תא המכונה מערבל "סילון פוגע מוגבל" (CIJ). מערבולות טורבולנטיות מייצרות סקאלות אורך ממס/אנטי-ממס של 1 מיקרומטר בתוך 1.5 אלפיות השנייה כאשר הן מופעלות במהירויות מתאימות. מהירויות הזרם וגיאומטריית הערבוב קובעות את המרת התנע הליניארי למערבולות טורבולנטיות המערבבות את הזרמים. פרמטר זה נקבע על ידי המספר חסר הממד, מספר ריינולדס (Re), שהוא ביחס ליניארי למהירויות הזרימה. Re מחושב מ- Re = Σ (V_iD_i/v_i), כאשר V_i היא מהירות הזרימה בכל קיטור, v_i היא הצמיגות הקינמטית של כל זרם, ו- D_i הוא קוטר כניסת הזרם בהתקני CIJ²⁶ סילון או קוטר התא ב- MIVM 4 סילוני²⁷. הערה: חלק מההפניות ל-CIJ משתמשות בקוטר ובמהירות סילון בודדים בלבד כדי להגדיר את Re²⁸. Re נמצא בטווח של 1-100 במכשיר מיקרופלואידיקה, ואילו במכשירי CIJ ניתן להשיג Re של 125,000. במערבל CIJ, זרמים בעלי תנע שווה מתנגשים, ומפזרים את התנע שלהם עם הפגיעה כערבוב טורבולנטי, מה שמוביל למיקרו-ערבוב יעיל בשל המיקרו-סקאלות הקטנות של קולמוגורוב ומספר דמקוהלר הקטן. סוג נוסף של מיקסר הוא "מערבל מערבולות כניסה מרובות" (MIVM), שבו ארבעה זרמים מכוונים לתוך תא מרכזי. במערך זה, זרימות רציפות לתוך תא הערבוב הסגור מבטיחות סקאלת זמן ערבוב מוגדרת היטב. כל האלמנטים הנוזליים עוברים דרך אזור הערבוב באנרגיה גבוהה בשני סוגי המערבלים. לעומת זאת, התקני ערבוב פשוטים כמו צמתי T אינם מכילים תא המספק אזור ערבוב, וכתוצאה מכך פחות ערבוב של שני הזרמים בשל תנע הזרם הנכנס מוסט ברובו לכיוון היציאה ולא ליצירת מערבולות טורבולנטיות. ניתן להפעיל מערבלי CIJ ו-MIVM במצב אצווה או במצב רציף, מה שמציע גמישות לייצור LNP בקני מידה שונים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד פורמולציות LNP אופטימליות מיוצרות על ידי שימוש בשתי טכנולוגיות סילון פוגעניות מוגבלות: CIJ 2-jet ומערבלי MIVM 4-jet. פעולתם של מערבלי CIJ ו-MIVM הודגמה בעבר להכנת NPs עם חומרי ליבה הידרופוביים²⁹. מאמר זה ווידאו יש להתייעץ כמשאב נוסף על היווצרות NPs עם מערבלים אלה. עדכון זה מתמקד בהיווצרות NP מבוססת שומנים. היכולת לכוונן את גודל LNPs על ידי שינוי תנאי מיקרו-ערבוב מודגמת. בנוסף, מוצגת התועלת של טכנולוגיות CIJ ביצירת LNPs יציבים וחד-פיזוריים עם יעילות משופרת של טרנספקציה חוץ גופית בתאי HeLa בהשוואה ל- LNPs המיוצרים באמצעות ערבוב פיפטה גרוע. יתר על כן, היתרונות והחסרונות של כל גיאומטריית ערבוב CIJ, יחד עם התנאים המתאימים הדרושים להרחבה של מערבלים אלה, נדונים.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חוצצים, זרמים ממסים ונוגדי ממסים

1. להמיס את כל מרכיבי השומנים באתנול בריכוזי מסה נתונים, כפי שמוצג בטבלה 1, כדי ליצור נוסחת LNP פטיסירנית¹⁰. לפני השימוש, חממו את התמיסות לטמפרטורה של 37°C עם סוניקציה עדינה כדי להמיס מחדש את כל המוצקים ששקעו.
   הערה: ניתן להכין ולאחסן תמיסות מלאי גדולות יותר של מספר מיליליטר בטמפרטורה של 4°C.
2. הכינו תמיסת מאגר אצטט בריכוז של 100 mM, pH 4, על ידי שילוב של 186 מ"ג נתרן אצטט ו-464 מ"ג חומצה אצטית ב-80 מ"ל מים נטולי נוקלאז. כוונן את ה- pH עם HCl מרוכז או NaOH לפי הצורך והשלם את הנפח הסופי ל- 100 מ"ל.
3. הכינו תמיסת מלאי חיץ HEPES בריכוז של 1 M, pH 7.5, על ידי המסת 23.82 גרם מלח HEPES ב 80 מ"ל של מים ללא נוקלאז. כוונן את ה- pH עם HCl מרוכז או NaOH לפי הצורך והשלם את הנפח הסופי ל- 100 מ"ל.
4. דללו את פולימר חומצת הגרעין המעניין ואת מלאי חיץ האצטט של 100 מילימטר במים נטולי נוקלאז כדי לייצר תמיסה של 300 מיקרוגרם/מ"ל של RNA במאגר אצטט של 30 מילימטר. הכן נפח מתאים של פתרון עבודה עבור הניסויים המתוכננים, ופרוטוקול זה דורש 1500 μL בסך הכל עבור מערבלי CIJ ו- MIVM.
   הערה: RNA המתקבל מהספק כבר יהיה במאגר מתאים, בדרך כלל בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל (רנ"א שמרים) או 1 מ"ג/מ"ל (mRNA מקודד לוציפראז, LucRNA, או mRNA מקודד GFP, GFP-RNA). RNA שמרים עשוי לשמש כמודל RNA בעלות נמוכה עבור משקעים.

2. ניסוח LNPs באמצעות מערבל CIJ דו-סילוני

1. הכנה וניקוי של ציוד
   1. נקו את מערבלי CIJ מיד לפני השימוש על ידי שטיפת המיקסר באתנול. ממלאים שני מזרקים של 5 מ"ל באתנול ונועלים כל אחד מהם ליציאת כניסה של CIJ. מדכאים במהירות את המזרקים ואוספים את שפכי המיקסר כפסולת.
      הערה: ניתן לבנות ולהפעיל מערבלי CIJ כמתואר לעיל²⁹. ניתן להשתמש בעמדות תמיכה שונות להחזקת מערבל CIJ, כולל מעמד טבעת, מחזיק צינור צנטריפוגה או צלוחיות ארלנמאייר. ספקי CIJ מפורטים בטבלת החומרים ובקובץ המשלים 1.
   2. הסר את מזרקי סומק אתנול מן CIJ. מזרקים אלה עשויים להיות מאוחסנים ולשימוש חוזר עבור שטיפות אתנול נוספות של CIJ.
   3. יבש את התעלות הפנימיות של CIJ על ידי נשיפת זרם חנקן יבש דרך מתאמי הכניסה. יש להשתמש רק באוויר יבש ומסונן שאינו מזוהם בתרסיס שמן משאבה או בתרסיסים אם חנקן אינו זמין.
2. הכנת זרמים ממסים ואנטי-ממסים
   1. ערבבו את תמיסות מלאי השומנים ודללו עם אתנול נוסף כדי לייצר 500 מיקרוליטר של תמיסת השומנים 6 מ"ג/מ"ל המפורטת בטבלה 1 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      הערה: נוסחה זו היא הרכב Onpattro הנפוץ המכיל 50% mole% MC3, 10 mole% DSPC, 38.5 mole% כולסטרול, ו 1.5 mole% DMG-PEG2000.
   2. לדלל את מלאי חיץ 100 mM pH 4 אצטט ל 10 mM בנפח כולל של 4 מ"ל כמו מערבל CIJ שפכים מרווה אמבטיה.
      הערה: ניתן להוסיף גם חטיף ערבוב מגנטי לאמבט המרווה (quench bath).
   3. למשוך 500 μL של פתרון RNA מוכן בשלב 1.4 מזרק 1 מ"ל. הפוך את המזרק והרחק כל אוויר מזרם אנטי-ממס מימי זה המכיל פולימר חומצת גרעין.
   4. למשוך 500 μL של פתרון שומנים מוכן בשלב 2.2.1 מזרק 1 מ"ל. הפוך את המזרק והרחק כל אוויר מזרם ממס אתנולי זה המכיל שומנים.
3. ייצור LNP במערבל CIJ
   1. מניחים את מערבל CIJ הנקי מעל בקבוקון האמבטיה מרווה.
      הערה: מהדק מעמד טבעת או מתלה צינור מהווים תמיכה נוחה למיקסר CIJ. ראו איור 1A עבור הגדרת CIJ טיפוסית.
   2. חבר את שני המזרקים שמולאו בשלב 2.2.3 ושלב 2.2.4 ליציאות הכניסה של מיקסר CIJ.
   3. לחץ על שני המזרקים במהירות כדי לערבב את זרמי הממס והאנטי-ממס ולאסוף NPs שומנים באמבט המרווה .
      הערה: יש לקדם את המזרקים במהירות (בפחות משנייה אחת) אך בצורה חלקה ואחידה. זרימה אסימטרית או זרימה איטית תייצר LNPs רב-מפוזרים, גדולים.
   4. הסר את מערבל CIJ מעל האמבטיה מרווה, כאשר המזרקים עדיין מחוברים.
      הערה: אין להסיר את המזרקים או לאפשר לנפח ההחזקה לזרום לתוך אמבט המרווה מכיוון שחומר זה מעורבב בצורה גרועה וישפיע לרעה על תכונות פיזור הייצור אם יערבב באמבט המרווה .
   5. החזיקו את ה-CIJ מעל מיכל פסולת והוציאו את המזרקים, מה שמאפשר לנפח ההחזקה השיורי לזרום לתוך מיכל הפסולת. השליכו מזרקים אלה וחזרו על תהליך הניקוי כמתואר בסעיף 2.1.
   6. לנתח LNPs המיוצרים עם CIJ כמתואר בסעיף 5 להלן.

3. ניסוח LNPs באמצעות מערבל MIVM ארבעה סילונים

1. הרכבה של מערבל MIVM, המכונה מיקרו-גודל MIVM (μMIVM) כדי להבדיל אותו מדגמים גדולים יותר המשמשים לייצור בקנה מידה גדול יותר
   1. אסוף את כל הרכיבים הנפרדים הדרושים להרכבת מערבל MIVM: המקלט התחתון, דיסק גיאומטריית הערבוב, הדיסק העליון, טבעת ה- O ומפתח הברגים.
      הערה: בנייה, הרכבה ותפעול של MIVM הודגמו בעבר לאנקפסולציה של מינים הידרופוביים, והספקים מפורטים בקובץ משלים 1 ובטבלת החומרים²⁹. ראו איור 2 לקבלת שרטוט של רכיבים וטרמינולוגיה של מעמד מיקסר.
   2. הושיבו את טבעת ה-O בחריץ בדיסק הערבוב.
   3. ישר את חורי דיסק הערבוב עם היתדות בדיסק העליון ודחוף אותם יחד מבלי להזיז את טבעת ה- O.
   4. הברג את דיסק הערבוב המזווג, טבעת ה- O ומכלול הדיסק העליון למקלט התחתון באופן רופף.
      הערה: הסר את צינורות היציאה מהמקלט התחתון לפני שלב זה.
   5. הדק את הדיסק העליון למקלט התחתון באמצעות מפתח ברגים.
      הערה: ניתן למרוח תרכובת נוגדת תפיסה באיכות מזון או תרופה על חוטי הדיסק העליונים אם נצפתה כריתת חוטים.
   6. הכנס והדק את צינור היציאה המתאים למקלט התחתון כדי להשלים את ה- MIVM.
   7. הרכיבו את ה-MIVM המורכב לתוך מעמד המיקסר כך שצינורות היציאה יצאו דרך צלחת התמיכה.
      הערה: יש לבצע מעת לעת את הליך התאמת מעמד המיקסר MIVM כדי לוודא שהעצירות המכניות במעמד המיקסר מוגדרות כראוי²⁹.
2. הכנת זרמים ממסים ואנטי-ממסים
   1. ערבבו את שתי תמיסות זרם ממס השומנים האתנוליות בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, כמפורט בטבלה 2, על ידי דילול תמיסות מלאי השומנים והוספת אתנול נוסף לפי הצורך כדי להגיע לריכוז שומנים סופי של 6 מ"ג/מ"ל.
      הערה: זהו אותו הרכב תמיסת שומנים כמו ב- 2.2.1 אך עם נפח כולל של 1000 μL.
   2. יש לדלל את מלאי החיץ של 100 mM pH 4 אצטט ל-10 mM בנפח כולל של 8 מ"ל כאמבט מרווה של שפכי MIVM.
      הערה: ניתן להוסיף גם חטיף ערבוב מגנטי לאמבט המרווה (quench bath).
3. ניסוח LNPs באמצעות מיקסר MIVM
   1. הניחו את אמבט המרווה בנפח 8 מ"ל מתחת למעמד המיקסר, כך שצינורות הזרימה החוצה יתרוקנו לתוך אמבט המרווה.
   2. משוך את זרמי הממס והאנטי-ממס לתוך מזרקים אטומים לגז 1 מ"ל באמצעות מחט קצה קהה. הסר את כל בועות האוויר והשלך את המחט. מקציפים כל מזרק על ידי היפוך וסילוק כל אוויר מהמזרק.
   3. מרכיבים את ארבעת המזרקים על המיקסר בכיוון השעון (מזרקים 1-4, טבלה 2) עם אותם זרמים משני הצדדים. ראו איור 1B לסכמת המראה הסופי.
   4. החזק את בית המסב משני צידי הצלחת הניידת. הימנע הנחת האצבעות על הפנים התחתונות של הדיור, כמו זה מהווה סכנת צביטה עקב עצירות מכניות. בזהירות להוריד את הצלחת הניידת עד שהוא מונח באופן שווה על מזרקים.
      הערה: כל בוכנות המזרק חייבות להיות בגובה שווה לפני הפעולה.
   5. לחץ בהתמדה ובצורה חלקה על הצלחת, במטרה להשלים את הפעולה בערך 0.5 שניות עד 1 שניות עבור נפחי זרם אלה.
   6. מכסים את אמבט המרווה המכיל את פיזור LNP.
   7. בצע את ניקוי ה-MIVM לאחר השימוש, בהתאם להוראות בשלב 3.5 להלן.
4. ניסוח LNPs באמצעות מערבל MIVM המונע על ידי משאבת מזרק
   1. הרכיבו את ה-MIVM כמתואר בשלב 3.1.
   2. הכינו את תמיסות הממס והאנטי-ממס בהרכב הרצוי ובנפח מספיק לגודל הפורמולציה הנדרש (טבלה 3).
      הערה: אלה הם אותם הרכבים כמו זרמי האנטי-ממס המימי (שלב 1.4) והממס האתנולי (שלב 3.2.1), אך הם מותאמים לשימוש עם נפחי המזרקים הגדולים יותר בטבלה 3.
   3. טען את התמיסות לתוך מזרקים אטומים לגז עם נפחים של 20 מ"ל וחבר צינורות PTFE עם מתאם luer מותקן בקצה. מקציפים את המזרקים והצינובים על ידי היפוך המזרק והצינור ולאחר מכן הוצאת כל אוויר.
   4. הרכיבו את המזרקים לתוך משאבת מזרקים וחברו את המזרקים לפתחי המיקסר ב-MIVM, כפי שמוצג באיור 3A.
      הערה: ניתן להפעיל את ה-CIJ גם באמצעות משאבות באותו אופן, אך עם מזרק זרם אחד בלבד נגד ממסים וממסים.
   5. יש לדלל את מלאי החיץ של 100 mM pH 4 אצטט ל-10 mM בנפח כולל של 320 מ"ל כאמבט מרווה שפכי MIVM.
   6. הניחו את אמבט המרווה מתחת לשקע MIVM.
   7. הגדר את קצב הזרימה הנפחי במשאבת המזרק ל- 20 מ"ל/דקה.
      הערה: קצבי הזרימה הנפחית עשויים להשתנות מ- 2 מ"ל/דקה ל- 40 מ"ל/דקה על-ידי הגדרה ידנית של הערכים במשאבת המזרק ליצירת LNPs עם תנאי מיקרו-ערבוב שונים.
   8. הפעל את משאבת המזרק, אך אפשר ל -10 שניות הראשונות של הקולחים לזרום לתוך פסולת. יש לאסוף את שפכי MIVM באמבט המרווה לאחר תקופת הזרמת הפעלה זו של 10 שניות.
   9. יש להסיר ולסגור את אמבט המרווה המכיל פיזור LNP שנעשה בקצב הזרימה הנפחי שנבחר (20 מ"ל/דקה).
      הערה: ניתן לחזור על הליך זה כדי לסנתז LNPs בקצבי זרימה שונים על ידי בחירת נפחי אמבטיה מרווה מתאימים.
   10. נקו את ה-MIVM בין כל ניסוי (בעת שינוי קצב הזרימה) על ידי שטיפה החוצה לפחות פי שניים מנפח צינורות היציאה כדי למנוע איסוף של LNP שנעשה בתנאי קצב הזרימה הקודם לפני תחילת סינתזת LNP הבאה.
5. ניקוי ציוד לאחר השימוש
   1. מנתקים את המיקסר מהמעמד תוך שמירה על המזרקים מחוברים, ומחזיקים אותו מעל מיכל פסולת. הסר את המזרקים, ותן לנפח ההחזקה להתנקז לתוך המיכל. לאחר מכן, החזיקו את מכלול המיקסר הפוך והשתמשו במפתח הברגים כדי לפרק את המיקסר.
   2. שטפו את צינורות היציאה בממס (למשל אתנול) וייבשו באוויר או בחנקן.
   3. שטפו את גיאומטריית הערבוב עם ממס מתאים, כגון מים שעברו דה-יוניזציה או אתנול, ולאחר מכן שטפו באתנול. יבש את הרכיבים באמצעות זרם של אוויר או חנקן.
   4. יש לשטוף את טבעת ה-O במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש כתם.
      הערה: אם טבעת ה-O נראית מתוחה או מעוותת, הניחו לה להתייבש באוויר למשך הלילה לפני השימוש בה. שמור מלאי גדול של אורינגים מכיוון שהם חלקים מתכלים. אם הצורה אינה מתאוששת עד למחרת, השליכו את טבעת ה-O.
   5. שטפו היטב את הדיסק העליון עם ממס, באמצעות זרם אוויר או חנקן כדי לייבש את פני השטח ואת אביזרי המזרק.
   6. שטפו כל מזרק עם ממס טוב (למשל, מים נטולי יונים, או אתנול). יש למרוח שטיפה סופית עם אתנול ולייבש באוויר לפני השימוש הבא.

4. עיבוד לאחר עיבוד של LNPs

1. החלפת חיץ והסרת אתנול
   1. נטרל את פיזור LNP כנגד חיץ HEPES של 10 mM ב- pH 7.4 באמצעות קלטת דיאליזה בגודל מתאים עם מחסנית דיאליזה בעל משקל מולקולרי של 20 kDa .
      הערה: שלב זה גם מסיר את שאריות 10% אתנול וגם מגביר את pH הפיזור על ידי החלפת מאגר אצטט עם HEPES.
   2. לדלל את מאגר 1 M HEPES ל 10 mM בנפח כולל של 1 L.
   3. טען את פיזור LNP לתוך קלטת דיאליזה 12 מ"ל באמצעות מזרק ומחט.
   4. טבול את מחסנית הדיאליזה במאגר 1 ליטר של HEPES וערבב מגנטית את המאגר החיצוני. החלף את מאגר HEPES החיצוני לאחר 3 שעות, והסר את מחסנית הדיאליזה לאחר 3 שעות נוספות למשך זמן דיאליזה כולל של 6 שעות.
   5. משוך את פיזור LNP החויג ממחסנית הדיאליזה והשליך את המחסנית המשומשת.
2. ריכוז תרחיף LNP באמצעות אולטרה-צנטריפוגה
   1. פיפטפו את המתלים לתוך מסנן צנטריפוגלי בגודל מתאים עם MWCO של 100kDa³⁰.
      הערה: מסננים צנטריפוגליים זמינים במגוון גדלים, בדרך כלל מ-0.5 מ"ל עד 12 מ"ל.
   2. צנטריפוגה את הפיזור ב 2000 x גרם במשך 10-20 דקות (בטמפרטורת החדר) כדי להגדיל את הריכוז על ידי גורם של כ 5-20x.
      הערה: במהלך הצנטריפוגה, בדוק את הדגימה כל 5 דקות כדי לוודא שנשארת כמות מתאימה של נוזל.

5. אפיון LNPs

1. מדידות קוטר הידרודינמי עם פיזור אור דינמי (DLS)
   1. יש להוציא 750 μL או 900 μL של פיזור LNP מוכן (ללא כל דילול) לתוך מיקרו פלסטיק או קובט מרובע, בהתאמה.
      הערה: ניתן להשתמש בנפחים קטנים יותר גם בקוביות מתאימות.
   2. הגדר את הצמיגות המתאימה עבור הממס שבו LNPs מפוזרים (כלומר, 1.26 cP עבור תערובת אתנול 10 vol%).
   3. איסוף אור מפוזר לאחור בזווית של 173° ב- 25°C, ולאחר מכן קביעת הגודל של LNP באמצעות מודל סטוקס-איינשטיין והצובר הראשון של הרחבת סדרת פונקציית מתאם פיזור האור כפי שהוגדר במסמך תקן ISO 13321:1996 E.
   4. חזור על המדידות לפחות שלוש פעמים.
2. מדידות פוטנציאליות של Zeta
   1. הוסף ~ 800 μL של פיזור LNP מוכן לתאים נימים מקופלים בגודל זטה.
      הערה: כדי למנוע מלכודת בועות בתוך תעלת הנימים, מחצית מהנוזל מופץ לתוך התאים, מוחזק הפוך ולאחר מכן מסובב.
   2. חזור על המדידות לפחות שלוש פעמים.
      הערה: מוליכות החיץ צריכה להיות בין 0.2-2 מיליסימנס/ס"מ לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
3. מדידות יעילות אנקפסולציה (EE) באמצעות ערכת כימות RNA זמינה מסחרית
   1. יש לדלל את הכמות המתאימה של חיץ 20x Tris-EDTA (TE) ב-pH 7.5 המסופק בערכת הבדיקה לריכוז של 1x באמצעות מים נטולי נוקלאז.
   2. הכינו תמיסת Triton X-100 ב-2 ואט%.
   3. לדלל את הכמות המתאימה של פיזור LNP במאגר TE 1x כדי להניב ריכוז מסה כולל של כ 0.6 מיקרוגרם / מ"ל עבור RNA, עם תוכן אתנול מתחת 0.2 vol%.
   4. הכינו דגימות דומות כמו בשלב הקודם, אך מכילות 0.5 wt.% Triton X-100, אשר למעשה ממיס את LNPs, מה שמקל על ההבחנה בין ריכוזי RNA "חופשיים" ומוחלטים בהיעדר ונוכחות של Triton X-100, בהתאמה.
   5. הכינו כמויות מתאימות של תמיסות RNA בקרה בריכוזים של 0 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.4 מיקרוגרם/מ"ל, 0.6 מיקרוגרם/מ"ל, 0.8 מיקרוגרם/מ"ל ו-1.0 מיקרוגרם/מ"ל במאגר TE 1x.
      הערה: ייתכן שבתחילה יהיה צורך לדלל את ערכת הרנ"א.
   6. חזור על השלב הקודם אך ב- 0.5 wt.% Triton X-100.
   7. לדלל את צבע Ribogreen (מסופק בערכה) 200 פעמים ב 1x TE buffer.
   8. הוסף נפחים מתאימים של צבע ריבוגרין המדולל לכל RNA הבקרה ופתרונות הדגימה המוכנים, עם או בלי Triton X-100. הצבע צריך להיות מדולל באופן שווה הן על פני רנ"א בקרה והן על פני תמיסות דגימה פי שניים. כתוצאה מכך, הדילול הכולל של הצבע הוא פי 400 מהריכוז המקורי שלו בערכת הבדיקה.
   9. מערבלים את המיכלים.
   10. הכינו צלחת אטומה בעלת 96 בארות, לא מטופלת, שטוחה ואטומה לניתוח בקורא צלחות.
   11. יש לחלק נפחים של 100 μL של דגימות ופקדי RNA לתאים נפרדים של הצלחת.
       הערה: שימו לב להיווצרות בועות בתמיסות המכילות Triton X-100. לפחות שלושה עותקים משוכפלים נערכים עבור כל דגימה, הדורשים לפחות 350 μL של דגימות.
   12. הקלט עוצמת פלואורסצנטיות באמצעות קורא הלוחות באורך גל עירור של 485 ננומטר ובאורך גל פליטה של 528 ננומטר, עם משך הארה של כ -10 שניות לקריאה. אין צורך בטלטול.
       הערה: ה-EE נקבע מ - , כאשר I_{עם טריטון} ואני_{ללא טריטון} מייצגים את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של שלושה העתקים של דגימות עם ובלי טריטון X-100, בהתאמה, ו- A_{עם טריטון} ו- A_{ללא טריטון} מציינים את שיפוע ההתאמה הליניארית לשתי עקומות הכיול הממוצעות עם ובלי טריטון X-100, בהתאמה³¹.

תוצאות

סינון של פורמולציות LNP אופטימליות יכול להיות מושג במהירות עם כמויות קטנות יחסית של חומר באמצעות מערבלים טורבולנטיים CIJ שני זרמים, בתנאי שהם מופעלים במהירויות המתאימות. מערבל μMIVM המונע על-ידי משאבת מזרקים ניתנת לתכנות, כפי שמתואר באיור 3A, משמש כדי להדגיש את החשיבות של השגת מיקרו-ערבוב מספיק, מעל מספר קריטי של ריינולדס ליצירת LNPs קטנים וחד-מפוזרים. טבלה 3 מכילה את סיכום הפורמולציות המשמשות לייצור LNPs, והגדרת המיקסר עוקבת אחר הפרוטוקול המתואר בשלב 3.4. גדלי LNP התאפיינו בפיזור אור דינמי (DLS) כפונקציה של מספר ריינולדס. כפי שניתן לראות באיור 3B, מעבר ל-Re קריטי של 5000, נצפים LNPs קטנים וחד-מפוזרים. יתר על כן, ניתן לגשת למספרי ריינולדס גבוהים (~10^{4-10 5}) כאשר המזרקים מדוכאים באופן אחיד על ידי פעולה ידנית או באמצעות מעמד הערבוב (נקודת הנתונים הימנית ביותר באיור 3B). מעמד הערבוב, המוצג באיור 2A, מדכא באופן אחיד את כל המזרקים בו זמנית²⁷. כתוצאה מכך, LNPs כאלה יש גם גדלים אופטימליים. עם ערבוב לקוי (כלומר, קטן מדי של Re), LNPs גדולים יותר נוצרים. תמונות המייצגות LNPs שנוצרו ברמות נמוכות (תמונה 1) וגבוהות Re (תמונה 2) מוצגות באיור 3B. דגימות שנעשו ב-Re נמוך הן עכורות, מה שמצביע על נוכחות של מבני פיזור אור קולואידים גדולים (אפקט טינדל - Tyndall), אך LNPs שנוצרו ב-Re גבוה נראים ברורים עקב פיזור חלש יותר של קולואידים קטנים יותר.

לליפידים מיוננים יש תכונות פיזיקליות-כימיות שונות, המשפיעות על התכונות הפיזיקוכימיות של LNPs המיוצרים עם נוסחאות שומנים זהות אחרת. מערבל CIJ (איור 1A) משמש כדי לבדוק זאת. טבלה 4 מפרטת את הפורמולציות שיוצרו באמצעות שני ליפידים מיוננים שאושרו על ידי ה-FDA: ALC-0315 ו-MC3. איור 4A מראה שה-LNPs המיוצרים ב-pH 5 מ-ALC-0315 הם ~80 ננומטר, בעוד ש-LNPs המיוצרים באמצעות MC3 הם ~60 ננומטר. יתר על כן, ב- pH 5, ל- MC3-LNPs יש פוטנציאל זטה חיובי (~ 28 mV), בעוד של- ALC-LNPs יש פוטנציאל זטה נייטרלי (<10 mV). הבחנה זו במטען פני השטח, כמו גם בגודל הכולל של LNPs, נובעת מה- pKa של שני השומנים. ל-MC3 יש pKa גבוה יותר (6.44) בהשוואה ל-ALC0315 (6.09)³²; לכן, חלק גבוה יותר של שומנים MC3 טעונים ב- pH 5. שתי הפורמולציות כוללות מייצב שומנים PEG-1.5% mol%; עם זאת, MC3-LNPs מתייצבים בגודל קטן יותר עקב דחיות אלקטרוסטטיות גדולות יותר במהלך הרכבת LNP במהלך הצבירה מוגבלת הדיפוזיה, אשר עוצרת את הצמיחה בגודל הקטן יותר. שתי הפורמולציות מראות יעילות אנקפסולציה גבוהה (>90%), כפי שניתן לראות באיור 4B. הכימיה של שומנים היא קריטית בקביעת המאפיינים הכוללים כמו גם את הביצועים של LNPs, ולכן, הם חייבים להיבחר בקפידה על בסיס יישום היעד.

LNPs המיוצרים באמצעות שתי גאומטריות מערבל טורבולנטי (שלב 2.3 ושלב 3.3) הם בעלי תכונות פיסיקוכימיות דומות. השוואה זו מורחבת עוד יותר ל-LNPs העשויים מטכניקות ערבוב גרועות, כגון ערבוב פיפטות בתפזורת, כדי להמחיש עוד יותר את ההבחנה בין מערבלים טורבולנטיים לבין טכניקות ערבוב לא אחידות (איור 1C). טבלה 5 מספקת את סיכום הניסוחים המשמשים לייצור LNPs, כפי שמוצג באיור 5. במקרה של טכניקת ערבוב פיפטה, נפחים שווים של אתנול וזרמים מימיים מעורבבים במהירות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה במשך 15-20 שניות, ולאחר מכן פיפט את התערובת לתוך אמבט חיץ אצטט ב pH 4. איור 5A מראה שהגדלים של LNPs באמבט חיץ אצטט 10 mM (pH 4, 10 vol% אתנול) דומים להפליא וקטנים להפליא (~50 ננומטר) ללא קשר לגיאומטריית המיקסר שבה משתמשים (CIJ או MIVM). עם זאת, LNPs המיוצרים באמצעות ערבוב פיפטה הם בגודל כפול של LNPs המיוצרים באמצעות מערבלים טורבולנטיים. זה מראה כי LNPs העשויים מגיאומטריות CIJ שונות מפגינים תכונות דומות כאשר הם מיוצרים במהירויות גבוהות מספיק (משטר טורבולנטי מעל מספר ריינולדס הקריטי), בעוד ערבוב גרוע גורם LNPs גדולים יותר, polydisperse.

לאחר מכן, LNPs מחויגים כנגד חיץ HEPES 10 mM, pH 7.4 (נפח 100x), כדי להסיר אתנול ולהעביר את ה- pH ל 7.4. במהלך התהליך הזה יש איחוי וגדילה של LNP לגודל מעט גדול יותר, כפי שמוצג באיור 5A, אשר עולה בקנה אחד עם מנגנון האיחוי שנחקר היטב בספרות³³. בסך הכל, ה-LNPs המיוצרים באמצעות מערבלי CIJ ו-MIVM הם פחות מ-100 ננומטר, בעוד שה-LNPs המיוצרים באמצעות ערבוב פיפטה הם בסביבות 140 ננומטר. כפי שניתן לראות באיור 5B, פוטנציאלי הזטה עבור הפורמולציות האלה הם פחות מ-10 mV, מה שמצביע על כך שכולם ניטרליים ב-pH 7.4. בנוסף, כולם מראים יעילות אנקפסולציה גבוהה של >95% (איור 5C). לפיכך, LNPs עם תכונות פיסיקוכימיות אופטימליות ניתן לייצר בקלות באמצעות טכנולוגיות מערבל טורבולנטי. הביצועים של LNPs אלה מוערכים על ידי ביצוע טרנספקציה חוץ גופית בתאי HeLa.

פרוטוקול בדיקת טרנספקציה חוץ גופית מבוסס לוציפראז מאומץ מפרסום קודם³⁴. איור 6A משרטט את עוצמת האור (RLU) לכל 1000 תאים עבור שלושת הניסוחים המסוכמים בטבלה 5. Lipofectamine 3000 משמש כבקרה חיובית. חשוב לציין כי lipofectamine 3000 משמש בדרך כלל עבור ניסוחים DNA; עם זאת, זה עבד כבקרה נאותה בניסויים אלה. LNPs המיוצרים באמצעות מערבלי MIVM 2-jet CIJ ו-4-jet MIVM מתעלים הרבה יותר טוב מאשר LNPs המיוצרים באמצעות ערבוב פיפטה. אף על פי שהחלקיקים הגדולים צפויים להדביק טוב יותר מהחלקיקים הקטנים בשל המטען הגדול יותר לכל LNP, ה-LNPs שנעשו באמצעות ערבוב פיפטה כאן עוברים בצורה פחות יעילה. זה מרמז בבירור כי יש הבדל משמעותי במבנים של LNPs שנעשו עם טכנולוגיות CIJ לעומת LNPs שנעשו עם ערבוב פיפטה. יעילות הטרנספקציה של LNPs המיוצרים עם מערבלי CIJ ו- MIVM זהה במהותה. Lipofectamine 3000 מראה את יעילות transfection הנמוכה ביותר. איור 6B מעריך את רעילות LNP במבחנה על תאי HeLa באמצעות בדיקת כדאיות תאים המבוססת על מלח נתרן רזזורין³⁵. כל הפורמולציות מראות ציטוטוקסיות נמוכה, המתבטאת ברמות גבוהות של כדאיות התא כאשר הן מתוות כאחוז מהתאים החיים לעומת הבקרה שאין לה כל טיפול בננו-חלקיקים.

איור 1: שיטות ערבוב לייצור LNPs. (A) מערבל סילוני דו-סילוני מוגבל (CIJ) המציג תצלום של מערבל שקוף ומערך מערבל דלרין מורכב המשמש באופן קבוע במעבדה. (B) מערבל מערבולות מיקרו רב-סילוני (μMIVM) בעל ארבעה סילונים, המציג תמונה של מערבל שקוף ומערך מערבל מורכב מפלדת אל-חלד ודלתין. זרמי הכניסה של המיקסר השקוף הועברו לדפנות המיקסר להדמיה טובה יותר של גיאומטריית הערבוב, בעוד שבמיקסר המעשי, זרמי הכניסה נכנסים מלמעלה. הן CIJ והן μMIVM פועלים במהירות נוזל מספקת כי הזרימות נמצאות במשטר הטורבולנטי, וערבוב מייצר מיקרו-סקאלות קולמוגורוב קטנות מ-1 מיקרומטר, מה שמאפשר השגת סופר-רוויה ב~1.5 מילישניות. (C) מערך ערבוב פיפטה נמצא בשימוש נרחב להכנת נפחים קטנים של פיזור LNP על ידי ערבוב תמיסות מימיות ואתנוליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מבט מורחב על μMIVM ועמדת הערבוב שלו. (A) מורכב μMIVM, עם מזרקי זכוכית, מתחת למעמד המיקסר המאפשר שקע אחיד ומהיר של המזרקים. נתון זה משוכפל מתוך Markwalter et ^al.29. (B) μMIVM מפורק המציג את הרכיבים הפנימיים. גיאומטריית הערבוב הזו זהה למערבל השקוף באיור 1B, פרט לכך שזרמי הכניסה נכנסים דרך הדיסקה העליונה ולא דרך המשטח הגלילי הצידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הגדלת מספר ריינולדס במערבל מערבולות מקטינה את הקוטר ההידרודינמי LNP עד למספר ריינולדס קריטי .(A) תיאור סכמטי של משאבת המזרק ומערך μMIVM המשמש לשליטה במספר ריינולדס במערבל הטורבולנטי על ידי קביעת קצבי זרימה נפחיים של זרם. (B) קוטר הידרודינמי LNP לעומת מספר ריינולדס ב-MIVM. הגדלת מספר ריינולדס ופיזור האנרגיה הסוערת משפרת את הערבוב ומובילה לערבוב הומוגני יותר, סופר-רוויה וצמיחה של חלקיקים. מעל מספר ריינולדס הקריטי, גדלי LNP נשארים קבועים עם קצבי זרימה הולכים וגדלים עקב תנאי Da<<1, כלומר, זמן הדיפוזיה של ממס/אנטי-ממס קצר יותר מזמן ההרכבה של NP. קצבי הזרימה שניתנו הם קצבי הזרימה הכוללים של כל ארבעת הזרמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תכונות קולואידיות של LNPs המיוצרים עם ליפידים מיוננים שונים. (A) קטרים הידרודינמיים ופוטנציאלי זטה של LNPs המיוצרים עם שני ליפידים מיוננים שונים: ALC-0315 ו-MC3. המדידות נעשות ב- pH 5 באמבט המרווה לאחר היווצרות LNP. הבדלים ב- pKa לכאורה של השומנים המיוננים משפיעים על התכונות הקולואידיות של LNPs. (B) מדידות יעילות אנקפסולציה של שני ה- LNPs (n = 3, קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תכונות קולואידיות של LNPs המיוצרים עם מערבלים שונים העוטפים mRNA של לוציפראז באמצעות שומנים מייוננים MC3. (A) קטרים הידרודינמיים של LNPs המיוצרים עם מערבלי 2 סילון, 4 סילון ופיפטה. המדידות מבוצעות הן בתנאים החומציים של אמבט המרווה לאחר היווצרות LNP (צד שמאל) והן לאחר דיאליזה לתוך חיץ HEPES נייטרלי (צד ימין). גודל LNP גדל במהלך נטרול pH עקב דה-יוניזציה של השומנים המיוננים, מה שמוביל לאיחוי וצמיחה של LNP. מייצב השומנים-PEG עוצר את צמיחת התלכדות החלקיקים לפני היווצרותם של משקעים בגודל מיקרון. (B) מדידות מטען פני השטח (כפוטנציאל ζ) על LNPs מחויגים בתנאי HEPES של 10 mM, pH 7.4. כל ה-LNPs נמצאים בטווח של 2 mV מתוך 0 mV, מה שמצביע על כך שמשטחי חלקיקים אלה הם ניטרליים ויש להם רק כמות כמעט בלתי ניתנת לגילוי של מטען קטיוני. (C) מדידות יעילות אנקפסולציה לאחר דיאליזה של LNPs (n = 3, קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: טרנספקציה של תאי HeLa עם LNPs שהוכנו מראש. (A) לומינסצנטיות של אנזים לוציפראז מבוטא לאחר טיפול בלוציפרין. (B) כדאיות תאי HeLa לאחר דגירה עם LNPs. תאים לא מראים שינוי מובהק סטטיסטית בכדאיות, כפי שמצוין על ידי בדיקה מטבולית של רזזורין (n = 4, פסי שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זרם(ים) / אמבט מרווה	רכיב	ניסוח	מניות	נפח
מזרק 1 - זרם אתנול (6 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים)	שומנים מיוננים (MC3)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 2 - נחל מימי (0.3 מ"ג/מ"ל RNA)	RNA שמרים	N/P 6	10 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4
אמבט מרווה	חוצץ אצטט	10 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4	4 מ"ל

טבלה 1: נוסחת LNP פטיסירנית סטנדרטית המיוצרת על ידי מערבל CIJ. רנ"א שמרים משמש כמודל RNA לפרוטוקול זה. כל התמיסות מומסות מולקולרית ומערבבות היטב לפני העמסתן במזרקים.

זרם(ים) / אמבט מרווה	רכיב	ניסוח	מניות	נפח
מזרק 1 - זרם אתנול (6 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים)	שומנים מיוננים (MC3)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 2 - נחל מימי (0.3 מ"ג/מ"ל RNA)	RNA שמרים	N/P 6	10 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4
מזרק 3 - זרם אתנול (6 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים)	שומנים מיוננים (MC3)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 4 - נחל מימי (0.3 מ"ג/מ"ל RNA)	RNA שמרים	N/P 6	10 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4
אמבט מרווה	חוצץ אצטט	10 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4	8 מ"ל

טבלה 2: נוסחת LNP פטיסירנית סטנדרטית המיוצרת על ידי מערבל MIVM. מערבל MIVM משתמש בארבעה זרמים - שני ממסים ושני אנטי-ממסים. ניתן להשתמש בזרמים עם מומנט לא שווה; עם זאת, זרמים עם מומנט שווה נבחרים עבור פרוטוקול זה.

זרם(ים) / אמבט מרווה	רכיב	ניסוח	מניות	נפח
מזרק 1 - זרם אתנול (6 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים)	שומנים מיוננים (MC3)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	20 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 2 - נחל מימי (0.3 מ"ג/מ"ל RNA)	RNA שמרים	N/P 6	10 מ"ג/מ"ל	20 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4
מזרק 3 - זרם אתנול (6 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים)	שומנים מיוננים (MC3)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	20 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 4 - נחל מימי (0.3 מ"ג/מ"ל RNA)	RNA שמרים	N/P 6	10 מ"ג/מ"ל	20 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4
אמבט מרווה (זמן איסוף = 30 שניות)	חיץ HEPES	10 מילימול, pH 7.5	1 מטר, pH 7.5	320 מ"ל

טבלה 3: נוסחת LNP המיוצרת על ידי מערבל MIVM המונע על ידי משאבת מזרק. DODMA משמש כשומני מיינן יחד עם RNA שמרים כמודל RNA. דוגמה להפעלה עם 40 מ"ל/דקה נבחרה עבור פרוטוקול זה.

זרם(ים) / אמבט מרווה	רכיב	ניסוח	מניות	נפח
מזרק 1 - זרם אתנול (סה"כ 12 מ"ג/מ"ל שומנים)	שומנים מייננים (MC3 או ALC0315)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 2 - נחל מימי (0.6 מ"ג/מ"ל RNA)	RNA שמרים	N/P 6	10 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 5	100 מילימול, pH 5
אמבט מרווה	חוצץ אצטט	10 מילימול, pH 5	100 מילימול, pH 5	9 מ"ל

טבלה 4: נוסחאות LNP משני ליפידים מיוננים שונים המיוצרים על ידי מערבל CIJ. הפורמולציות מיוצרות מ-ALC-0315 או MC3, בעוד שכל שאר הרכיבים נשמרים זהים.

זרם(ים) / אמבט מרווה	רכיב	ניסוח	מניות	נפח
מזרק 1 - זרם אתנול (6 מ"ג/מ"ל סה"כ שומנים)	שומנים מיוננים (MC3)	50 מול %	50 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	שומני Zwitterion (DSPC)	10 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	כולסטרול	38.5 מול %	5 מ"ג/מ"ל
	שומנים פגילטיים (DMG-PEG2000)	1.5 מול %	4 מ"ג/מ"ל
מזרק 2 - נחל מימי (0.3 מ"ג/מ"ל RNA)	FLuc mRNA	N/P 6	1 מ"ג/מ"ל	0.5 מ"ל
	חוצץ אצטט	20 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4
אמבט מרווה	חוצץ אצטט	10 מילימול, pH 4	100 mM, pH 4	4 מ"ל

טבלה 5: נוסחת LNP פטיסירנית סטנדרטית המיוצרת על ידי מערבל CIJ. FLuc mRNA המבטא חלבון לוציפראז משמש למדידת ביטוי גנים באמצעות בדיקת ביולומינסנציה.

קובץ משלים 1: ספקים של מיקסרים CIJ ו-MIVM. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הוצגה סינתזה של LNPs המכילים פולימרים של חומצות גרעין באמצעות שני מערבלים טורבולנטיים סילוניים מוגבלים ופוגעים. כאשר הם מבוצעים במהירויות מתאימות, מערבלים טורבולנטיים CIJ מבטיחים שסקאלת הזמן של הערבוב קצרה מזמן ההרכבה של LNP, ומייצרים תנאי סופר-רוויה הומוגניים ליצירת LNPs קטנים עם התפלגות בגודל צר²¹. כתוצאה מכך, LNPs המיוצרים עם אותה כימיה באמצעות גאומטריות מערבלות טורבולנטיות שונות (CIJ 2-jet ומערבל MIVM 4-jet) מציגים תכונות פיסיקוכימיות דומות ומראים יעילות טרנספקציה טובה (איור 5 ואיור 6). לעומת זאת, LNPs המיוצרים באמצעות פיפטינג שמייצר ערבוב גרוע יותר מביאים ל-LNPs גדולים ורב יותר (איור 5A) עם יעילות העברה נמוכה יותר. זה כבר זמן רב הבין כי קינטיקה ערבוב הרכבה לשחק תפקיד משמעותי בעיבוד LNP; Cullis et al. ציינו כי ערבוב קונבקטיבי-דיפוזי מהיר של אתנול וחיץ מוביל להיווצרות חלקיקים קטנים עם התפלגות גודל צרה, בעוד ערבוב דיפוזי איטי מוביל לחלקיקים גדולים יותר עם התפלגות גודל רחבה⁹. סקאלת הזמן של ערבוב במערבלים טורבולנטיים CIJ יורדת באופן יחסי לקצבי זרימת הכניסה של הזרמים למיקסר²⁷. זה מכומת על ידי מספר ריינולדס חסר הממדים (Re), אשר מודד את היחס בין הכוחות האינרציאליים והצמיגים. המערבולות בתוך תאי הערבול של CIJ ו-MIVM מתרחשות ב-Re גבוה מספיק, כך שמתיחת המערבולת הטורבולנטית גורמת לקשקשים קטנים של אורך המייצרים ערבוב מהיר של ממס/אנטי-ממס על ידי דיפוזיה. סולם האורך הטורבולנטי תלוי ב- Re ולא בגיאומטריה הספציפית של התקן הערבוב. זו הסיבה לכך שה-CIJ או ה-MIVM מייצרים את אותם חלקיקי LNP, ומדוע גדלים שונים של מערבלי MIVM מייצרים את אותם גדלי NP²⁷. ב-Re גבוה, המתאים למהירויות כניסה גבוהות, LNPs יכולים להיות ניתנים לשחזור ללא שינויים בין אצווה לאצווה (איור 3B).

פרוטוקול זה מאפשר ניסוח של מגוון mRNA, DNA או siRNA LNPs בעלי תכונות פיסיקוכימיות שונות באמצעות מערבלי CIJ טורבולנטיים. בנוסף לכך שהיא מאפשרת רב-תכליתיות בהרכב ובריכוזים, טכניקה זו מספקת נתיב ברור לסינון מהיר של פורמולציות במכירת ספסלים (כמה מיליגרם) והרחבת פורמולציות העופרת לגדלי אצווה תעשייתיים גדולים יותר בקצב ייצור של 5 ליטר/דקה³⁶. זה היה מכשול גדול עבור כמה טכניקות אחרות, כולל ערבוב בתפזורת ומיקרופלואידיקה. לדוגמה, טכניקות עיבוד בתפזורת אינן מצליחות לייצר LNPs באופן עקבי, אפילו בקנה מידה של מיליליטר אחד. טכניקות מיקרופלואידיות מספקות שיפור משמעותי לעומת טכניקות ערבוב בתפזורת כדי לאפשר ייצור LNPs אחידים וניתנים לשחזור; עם זאת, הם רק בטווח מיליגרם²⁹. כפי שמפורט במבוא, הקבלה של התקנים מיקרופלואידים מספקת ניסיון לקנה מידה למאזני ייצור אך אינה מבטלת את בעיית הפולינג, ולא ניתן להגדיל אותה בהצלחה כמו מערבלים המבוססים על טכנולוגיית סילון פוגעת מוגבלת.

מלבד יתרונות אלה, מערבלי CIJ יסייעו בייצור הדור הבא של LNPs המציגים יכולות מיקוד או מבצעים עריכת גנים. ניסוחי LNP הנוכחיים מכילים ליפידים וחומצות גרעין בעלי דיפוזיות דומות, ולכן, ניתן להכין אותם גם עם ערבוב מעט גרוע בקנה מידה של ספסל. עם זאת, גישות לעריכת גנים עשויות לדרוש אנקפסולציה של מיני חומצות גרעין בעלי משקלים מולקולריים שונים מאוד, כגון מולקולות RNA מנחות קטנות ותעתיקים גדולים של mRNA, כדי לקודד חלבון CAS9³⁷. סקאלות זמן הדיפוזיה השונות מאוד של מינים שונים אלה הופכות את האנקפסולציה האחידה ביחסים סטויכיומטריים למאתגרת. בעיה זו של אנקפסולציה אחידה הופכת בולטת יותר ככל שיעילות הערבוב נעשית ירודה יותר. באופן דומה, התמקדות בתאים שאינם כבדיים עשויה להזדקק לשילוב של מייצבים בעלי קשר חזק לפיזור איטי (כגון קופולימרים גדולים של בלוק משקל מולקולרי עם ליגנדות מטרה). ניתן להצמיד ליגנדות בגודל של עד 14 kDa לחסימת קופולימרים לפני הרכבת ננו-חלקיקים, מה שמאפשר את שילובם האחיד ב-NPs באמצעות ערבוב CIJ³⁸. מערבלים טורבולנטיים CIJ הם כלים שימושיים לייצור LNPs המיוצרים עם רכיבים בעלי דיפוזיות שונות.

בעוד מערבלים טורבולנטיים CIJ מדגימים מספר יתרונות על פני מערבלים אחרים לניסוח LNPs, חשוב לציין את המגבלות הקשורות לכל גיאומטריה. מערבל CIJ דו-סילוני דורש שלשני זרמי הכניסה (אתנול ומים) יהיה מומנט שווה (בטווח של 10%-30%) כדי להשיג מיקרו-ערבוב טורבולנטי אחיד בתא. העובדה שזרם היציאה כולל 50:50 ממס/אנטי-ממס מגבילה את רמת הסופר-רוויה בחלל הערבוב שבו מתרחשים משקעים²⁹. חיסרון זה מטופל על ידי מיקסר MIVM 4 סילון, מכיוון שהוא יכול להשתמש בארבעה סילונים עם מומנט לא שווה כדי להשיג תנאי סופר-רוויה גבוהים בתא הערבוב. בנוסף, שני המיקסרים נדרשים להיות בסדר גודל של מיליגרם של המסה הכוללת, מה שהופך אותם לבחירה לא אידיאלית לסינון בתפוקה גבוהה של פורמולציות LNP רבות ושונות. עבור פורמולציות LNP פשוטות, הסינון עשוי להיעשות בצורה הטובה ביותר עם מיקרופלואידיקה או אסטרטגיות פיפטינג בקנה מידה של מיקרוגרם ולאחר מכן להעביר לטכנולוגיית סילון פוגע מוגבל כאשר זוהו כמה פורמולציות עופרת. חשוב גם לקחת בחשבון את הכרכים המתים במיקסרים. ב- CIJ, שני מערבלי סילון, נפחי ההחזקה הם 50-100 מיקרוליטר. כמות זו של חומר יש להפחית מן הסכום נתפס באמבטיה מרווה בעת חישוב ההתאוששות מהתהליך. הפסדים אלה אינם משמעותיים כאשר פועלים בקנה מידה גדול, אך יהוו הפסדים של 10% כאשר נפחים כוללים של 5 מ"ל מיוצרים, כפי שמוצג כאן. מערבלי הסילון הטורבולנטיים הפוגעים הם כלי רב ערך לייצור LNPs בקנה מידה GMP, כפי שמעידים שני חיסוני COVID-19 שאושרו על ידי ה- FDA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Helper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305167
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Confined Impinging Jets Mixer	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Ionizable lipid
Ethanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United States	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, free acid	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID	Idex Health & Science	1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting	Idex Health & Science	P-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer stand	Holland Applied Technologies	N/A	See Markwalter &  Prud'homme for design.26 Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex Mixer	Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule - CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting - CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting - MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing - CIJ	Idex Health & Science	1517	Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing - MIVM	N/A	N/A	Fit to ferrule ID.
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	N/A
Plastic two-piece syringe 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sodium Salt	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Sodium Acetate	Millipore Sigma	32319-500G-R
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Syringe Filters, Sterile	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Water, Endotoxin Free	Quality Biological	118-325-131	RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118