閉じ込めインピンギングジェットミキサーにおける乱流による脂質ナノ粒子の合成

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud'homme

doi:10.3791/67047

閉じ込めインピンギングジェットミキサーにおける乱流による脂質ナノ粒子の合成

DOI:

10.3791/67047

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August 23rd, 2024

Sai Nikhil Subraveti¹, Brian K. Wilson¹, Navid Bizmark¹, Jason Liu¹, Robert K. Prud'homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

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要約

2ジェットCIJおよび4ジェットマルチインレットボルテックスミキサー(μMIVM)を含む閉じ込め衝突ジェット(CIJ)ミキサー技術を使用して脂質ナノ粒子(LNP)を合成するための詳細なプロトコルが実証されています。CIJミキサーは、再現性のある乱流マイクロミキシング環境を生成し、単分散LNPを生成します。

要約

脂質ナノ粒子(LNP)は、2種類のCOVID-19メッセンジャーRNA(mRNA)ワクチンが承認され、世界中で使用されていることからも明らかなように、治療送達担体として大きな可能性を秘めています。小規模では、LNPは多くの場合、マイクロ流体工学を使用して製造されます。ただし、これらのデバイスには制限があるため、大規模に使用することはできません。COVID-19ワクチンは、CIJ(Exclusiveed Impinging Jet)乱流ミキサーを使用して大量に製造されています。CIJの技術は、生産量まで拡張できるという自信を持って、実験室規模での生産を可能にします。CIJミキシングの重要な概念は、ミキシングの長さと時間スケールがミキシングキャビティ内の乱流強度によって決定され、ナノ粒子の形成が壁から離れて発生するため、表面への堆積や汚れの問題が解消されることです。この研究では、2ジェットCIJと4ジェットマルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)の2つの形状の閉じ込めインピンギングジェットミキサー技術を使用してLNPを作成するプロセスを実証しています。各ミキシングジオメトリの長所と短所について説明します。これらの形状では、LNPは、有機溶媒ストリーム(通常はイオン化可能な脂質、共脂質、および安定化PEG脂質を含むエタノール)と水性抗溶媒ストリーム(RNAまたはDNAを含む水性緩衝液)とを迅速に混合することによって形成されます。CIJミキサーとMIVMミキサーの操作パラメータを示し、サイズ、ゼータ電位、安定性、トランスフェクション効果が制御された再現性のあるLNPを調製します。また、混合不良(ピペッティング溶液)で製造されたLNPとCIJ混合の違いについても説明します。

概要

mRNAベースの治療薬は、感染症、遺伝性疾患、がんなど、幅広い疾患の治療と予防に大きな可能性を秘めています¹。細胞膜全体に受動的に拡散する低分子治療薬とは異なり、細胞内送達のためには核酸をカプセル化する必要があります²。カプセル化は、mRNAに構造と安定性の両方を提供し、エンドサイトーシス経路を介した細胞内送達を促進するとともに、ヌクレアーゼ3などの細胞内および細胞外成分からの分解^{を防ぎます。}mRNAのカプセル化と送達のために、無機ナノ粒子、ポリマー、脂質、脂質様材料¹など、多くの材料やナノキャリアが開発されています。その中でも、LNPはmRNAベースの治療薬の最も一般的な送達プラットフォームとして浮上しています⁴。

LNPは、イオン化可能脂質、コレステロール、双性イオン性脂質、PEG-脂質安定剤⁵の4つの脂質成分で構成されています。mRNA導入に適したイオン化可能な脂質は、脂質の疎水性と三元アミン基⁶の解離定数(pKa)との間に慎重なバランスを示します。イオン化脂質pKaは、KC-2(DLin-KC2-DMA)、MC-3(DLin-MC3-DMA)、ALC-0315⁷など、通常、pHが6.0〜6.7です。イオン化可能な脂質に対するこのpKa制限により、核酸ポリマーの疎水性脂質塩としてのカプセル化と、「エンドソームエスケープ」プロセスによる細胞内送達の両方が可能になります。LNPは、pH 7.4からpH ~5⁸までのエンドソームの酸性化を伴う(さまざまな)エンドサイトーシス経路を通じて標的細胞に侵入します。イオン化可能な脂質pKaは、LNPが生理学的条件下ではほぼ中性の表面を持つことを保証しますが、酸性化エンドソーム⁹ではカチオン性になります。このpH応答により、エンドソーム膜のみを選択的に破壊し、カプセル化された核酸ポリマーを放出し、リポフェクタミンなどのトランスフェクションシステムで使用される永久カチオン性脂質とは異なり、細胞の生存率を維持します。コレステロールは、LNP構造内の疎水性の間質分子であり、脂質の流動性を改善します。双性イオン脂質は構造的な役割を果たし、LNP表面上に二重層を形成します。ポリ(エチレングリコール)-脂質(PEG-脂質)は、LNPの表面に高分子立体安定剤を付与することによりLNPの安定性を高めるコロイド状安定剤であり、これによりLNPの凝集に抵抗します。これにより、特にpHが変化すると、疎水性油のように振る舞うイオン化可能な脂質の遊離塩基型が再生されます。Onpattro(パティシラン)レシピ(以下、LNP製剤と呼ぶ)は、イオン化可能な脂質MC3、コレステロール、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、およびPEG2000-DMGをエタノールに溶解し、^RNA10の水溶液に混合したLNP製剤の出発点としてよく使用されます。

核酸ポリマーをカプセル化するLNPを製造するためにいくつかの技術を使用することができ、それらのほとんどは、脂質を含むエタノールストリームと目的の核酸(siRNA、mRNA、または^DNA)を組み込んだ水性ストリームを迅速に混合するという共通のテーマに依存しています9,11,12,13,14 .この点で、ピペットミキシングやボルテックスミキシングなどのバルクミキシングプロセスは、高度な機器を使用する必要性を排除するLNPを形成するための簡単な戦略を提供します¹²。しかし、バルクミキシングでは成分の均一な分布が得られないため、LNPサイズ分布が最適ではなく、バッチ間のばらつきも大きくなります¹⁵。

ラボでは、マイクロ流体混合技術を日常的に使用して、混合条件12,13,16のより正確な制御を達成することにより、再現性のあるLNPを取得しています。しかし、マイクロ流体デバイスの層流条件は、マイクロ流体チャンバー内の長さスケールが小さく、速度が遅いため、比較的遅い溶媒/抗溶媒混合をもたらします¹⁷。チャンバーの寸法が小さいため、LNPのGMP生産に必要なスループットとスケーラビリティが大幅に制限されますが、研究者はマイクロ流体チャンバーを並列化して生産量の規模を拡大しようとしています¹⁵。並列化されたマイクロ流体形状は、一般に混合装置の「ファウリング」と呼ばれる問題である大量処理中の表面への脂質吸着の問題を排除するものではなく、マイクロ流体工学のスケールアップを工業規模の生産に困難にする流れの均一性と安定性の問題があります^18,19.製薬会社が乱流インピンギングジェットミキサーを使用してCOVID-19ワクチン接種mRNA-LNPを製造したことは驚くことではありません²⁰。

RNAをロードしたLNPの製造プロセスでは、RNAペイロードを含む水性バッファーストリームと、4つの異なる脂質成分を含むエタノールストリームをブレンドする必要があります。これらの製剤は、pH 4.0 以下の酸性緩衝液を利用しており、水性とエタノールの流れが混ざり合うときにイオン化可能な脂質を帯電させます。正に帯電したイオン化脂質は、負に帯電したRNAと静電的に相互作用し、疎水性のRNA-脂質塩を形成します。RNA-脂質塩を含む疎水性脂質種は、混合溶媒中に沈殿し、疎水性核を形成します。これらの核は、双性イオン性脂質とコレステロールの沈殿を通じて成長し、十分なペグ化脂質がLNPの表面に吸着する臨界点に達するまで成長し、さらなる成長-核形成と成長メカニズム21,22,23を停止します。脂質が沈殿し、LNPが形成される程度まで、脂質溶液への水緩衝液の添加は、溶媒-抗溶媒混合期間τ混合期間と核成長期間τ_凝集の2つの異なる時間スケールに依存します。無次元のダムケーラー数は、Da = τ_mix/τ_agg として定義され、これらの時間スケール²⁴ の間の相互作用を捉えています。低速混合(Da > 1)の場合、LNPの最終サイズは輸送制御され、混合時間によって変化します。逆に、高速混合(Da < 1)では、流体はコルモグロフ長の縞模様または層に断片化され、LNP形成は各成分の分子拡散によってのみ支配され、LNP形成の均一な速度論がもたらされます。後者のシナリオを達成するには、脂質濃度が臨界閾値を超え、均一で均一な核形成を助長する過飽和状態を確立する必要があります。

τ_agg は数十から数百ミリ秒の範囲であると推定されます²⁵。最も基本的な構成では、脂質を含むエタノールを含むストリームとRNAカーゴを含む水性バッファーを含むストリームの2つのストリームは、「閉じ込められた衝突ジェット」(CIJ)ミキサーと呼ばれるチャンバーに注入されます。乱流渦は、適切な速度で操作すると、1.5 ms以内で1 μmの溶媒/抗溶媒縞長スケールを生成します。流れの速度と混合ジオメトリは、線形運動量が流れを混合する乱流渦への変換を決定します。これは、無次元数であるレイノルズ数(Re)によってパラメータ化され、流れの速度に線形に比例します。Reは、Re = Σ(V_iD_i/v_i)から計算され、ここで、V_iは各蒸気の流速、v_iは各流の動粘度、D_iは2ジェットCIJ装置²⁶の流入口直径、または4ジェットMIVM27のチャンバー直径である。注: CIJ の一部の参照では、Re²⁸ を定義するために 1 つのジェット直径と速度のみを使用しています。Reはマイクロ流体デバイスでは1〜100の範囲ですが、CIJデバイスでは125,000のReを達成できます。CIJミキサーでは、同じ運動量を持つストリームが衝突し、衝撃時にその運動量が乱流混合として散逸し、小さなコルモゴロフマイクロスケールと小さなダムケーラー数により効率的なマイクロミキシングにつながります。別のタイプのミキサーは、「マルチインレットボルテックスミキサー」(MIVM)で、4つのストリームが中央のチャンバーに導かれます。このセットアップでは、閉じ込められたミキシングチャンバーへの連続的な流れにより、明確に定義されたミキシングタイムスケールが保証されます。すべての流体要素は、両方のタイプのミキサーで高エネルギー混合ゾーンを通過します。対照的に、T字路のような単純な混合装置には、混合ゾーンを提供するチャンバーが含まれていないため、流入するストリームの勢いが乱流渦の発生ではなく出口方向に大きく偏向されるため、2つのストリームの混合が少なくなります。CIJミキサーとMIVMミキサーはどちらもバッチモードまたは連続モードで操作できるため、さまざまなスケールでのLNP生産に柔軟性があります。

このプロトコルでは、2ジェットCIJと4ジェットMIVMミキサーの2つの閉じ込めインポンピングジェット技術を使用して、最適なLNP製剤を作成する方法について説明します。CIJおよびMIVMミキサーの操作は、疎水性コア材料²⁹を用いたNPの調製について以前に実証されている。その記事とビデオは、これらのミキサーによるNPの形成に関する追加のリソースとして参照する必要があります。今回のアップデートでは、脂質ベースのNP形成に焦点を当てています。マイクロミキシング条件を変えることでLNPのサイズを調整する能力が実証されています。さらに、CIJテクノロジーは、低ピペット混合を使用して作製したLNPと比較して、HeLa細胞の in vitro トランスフェクション効率が向上した安定した単分散LNPを形成することの有用性を示しています。さらに、各CIJミキシングジオメトリの長所と短所、およびこれらのミキサーのスケールアップに必要な適切な条件について説明します。

プロトコル

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. バッファー、溶媒、抗溶媒の流れの調製

表1に示すように、すべての脂質成分を所定の質量濃度でエタノールに溶解し、パチシランLNP製剤¹⁰を作製する。使用前に、溶液を穏やかな超音波処理で37°Cに加熱し、沈殿した固形物を再溶解します。
注:数ミリリットルのより大きなストック溶液を調製し、4°Cで保存することができます。
100 mM、pH 4の濃度で、186 mgの酢酸ナトリウムと464 mgの酢酸を80 mLのヌクレアーゼフリー水に混ぜ合わせて、酢酸緩衝液を調製します。必要に応じて濃縮HClまたはNaOHでpHを調整し、最終容量を100mLにします。
23.82 gのHEPES塩を80 mLのヌクレアーゼフリー水に溶解して、1 M、pH 7.5の濃度のHEPES緩衝液を調製します。必要に応じて濃縮HClまたはNaOHでpHを調整し、最終容量を100mLにします。
目的の核酸ポリマーと100 mM酢酸緩衝液ストックをヌクレアーゼフリー水で希釈し、30 mM酢酸緩衝液中の300 μg/mLのRNA溶液を生成します。設計された実験には十分な量の作業溶液を調製し、このプロトコルではCIJミキサーとMIVMミキサーの両方で合計1500μLが必要です。
注:供給者から得られたRNAは、通常10 mg / mL(酵母RNA)または1 mg / mL(ルシフェラーゼコードmRNA、LucRNA、またはGFPコードmRNA、GFP-RNA)の濃度で、すでに適切な緩衝液中にあります。酵母RNAは、沈殿物用の低コストのモデルRNAとして使用できます。

2. 2ジェットCIJミキサーによるLNPの定式化

機器の準備と清掃
1. CIJミキサーは、使用直前にミキサーをエタノールで洗い流して清掃してください。2つの5 mLシリンジにエタノールを入れ、それぞれをCIJの入口ポートにロックします。シリンジを急速に押し下げ、ミキサーの廃液を廃棄物として収集します。
  注:CIJミキサーは、前述の²⁹のように構成および操作できます。CIJミキサーを保持するために、リングスタンド、遠心分離管ホルダー、三角フラスコなど、さまざまなサポートスタンドを使用できます。CIJのサプライヤーは 、資料表 と 補足ファイル1に記載されています。
2. エタノールフラッシュシリンジをCIJから取り外します。.これらのシリンジは、CIJの追加のエタノールリンスに保管して再利用できます。.
3. インレットアダプターに乾燥した窒素の流れを吹き付けて、CIJの内部チャネルを乾燥させます。窒素が利用できない場合は、ポンプオイルのミストやエアロゾルで汚染されていない、乾燥したろ過された空気のみを使用してください。
溶媒および抗溶媒ストリームの調製
1. 脂質ストック溶液を混合し、追加のエタノールで希釈して、表1 に記載されている6 mg/mLの脂質溶液500 μLを1.5 mLの微量遠心チューブで生成します。
  注:この製剤は、50モルMC3、10モル%DSPC、38.5モルコレステロール、および1.5モルDMG−PEG2000を含む一般的に使用されるOnpattro組成物です。
2. 100 mM pH 4 アセテート緩衝液ストックを 10 mM に希釈し、総容量 4 mL で CIJ ミキサーの廃液クエンチ浴として使用します。
  注:マグネチックスターバーをクエンチバスに追加することもできます。
3. ステップ1.4で調製した500 μLのRNA溶液を1 mLシリンジで引き出します。シリンジを反転させ、核酸ポリマーを含むこの水性抗溶媒ストリームから空気を排出します。
4. ステップ2.2.1で調製した脂質溶液500 μLを1 mLシリンジで引き出します。シリンジを反転させ、脂質を含むこのエタノール溶媒の流れから空気を排出します。
CIJミキサーでのLNP生産
1. 清潔なCIJミキサーをクエンチバスバイアルの上に置きます。
  注意: リングスタンドclamp またはチューブラックは、CIJミキサーの便利なサポートになります。一般的な CIJ セットアップについては、 図 1A を参照してください。
2. ステップ 2.2.3 とステップ 2.2.4 で充填した 2 つのシリンジを CIJ ミキサーのインレットポートに嵌合させます。
3. 両方のシリンジを急速に押し下げて、溶媒と抗溶媒の流れを混合し、クエンチバスで脂質NPを収集します。
  注:シリンジは迅速に(1秒未満で)進める必要がありますが、スムーズかつ均一に進める必要があります。非対称流または低速流は、多分散の大きなLNPを生成します。
4. シリンジを取り付けたまま、クエンチバスの上からCIJミキサーを取り外します。
  注:シリンジを取り外したり、ホールドアップボリュームをクエンチバスに流したりしないでください、この材料は混合が不十分で、クエンチバスに混合すると製造分散特性に悪影響を与えるためです。
5. CIJを廃棄物容器にかざし、シリンジを取り外して、残りのホールドアップ量を廃棄物容器に流します。これらの注射器を廃棄し、セクション2.1で説明されているようにクリーニングプロセスを繰り返します。
6. CIJで生成されたLNPを、以下のセクション5で説明するように分析します。

3. 4ジェットMIVMミキサーによるLNPの定式化

MIVMミキサーのアセンブリは、スケールアップ生産に使用される大型モデルと区別するためにマイクロサイズMIVM(μMIVM)と呼ばれます
1. MIVMミキサーの組み立てに必要なすべての個々のコンポーネント(下部レシーバー、ミキシングジオメトリディスク、上部ディスク、Oリング、スパナレンチ)を収集します。
  注:MIVMの構築、組み立て、および操作は、疎水性種のカプセル化について以前に実証されており、サプライヤーは 補足ファイル1 および 材料表²⁹に記載されています。コンポーネントの概略図とミキサースタンドの用語については、図2 を参照してください。
2. Oリングをミキシングディスクの溝に装着します。
3. ミキシングディスクの穴を上部ディスクのペグに合わせ、Oリングを外さずに押し込みます。
4. 嵌合したミキシングディスク、Oリング、および上部ディスクアセンブリを下部レシーバーに緩くねじ込みます。
  注意: この手順の前に、下部レシーバーからアウトレットチューブを取り外してください。
5. スパナレンチを使用して、上部ディスクを下部レシーバーに締めます。
  注:スレッドのかじりが観察された場合は、食品または医薬品グレードの焼け付き防止コンパウンドを上部ディスクスレッドに塗布できます。
6. アウトレットチューブを下部レシーバーに挿入して締め、MIVMを完成させます。
7. 組み立てたMIVMをミキサースタンドに取り付けて、出口チューブがサポートプレートから出るようにします。
  注意: MIVMミキサースタンドを調整する手順は、ミキサースタンドの機械的なストップが正しく構成されていることを確認するために定期的に実行する必要があります²⁹。
溶媒および抗溶媒ストリームの調製
1. 表2に示すように、2つのエタノール性脂質溶媒ストリーム溶液を1.5 mLの微量遠心チューブで混合し、脂質ストック溶液を希釈し、必要に応じてエタノールを追加して、最終脂質濃度6 mg / mLに到達します。
  注:これは2.2.1と同じ脂質溶液組成ですが、総容量は1000μLです。
2. 100 mM pH 4 アセテート緩衝液ストックを 10 mM に希釈し、総容量 8 mL で MIVM 溶出液クエンチ浴として使用します。
  注:マグネチックスターバーをクエンチバスに追加することもできます。
MIVMミキサーを用いたLNPの定式化
1. 8 mLのクエンチバスをミキサースタンドの下に置き、流出チューブがクエンチバスに空になるようにします。
2. 溶媒と抗溶媒の流れを、先端が鈍い針を使用して1 mLの気密シリンジに吸い上げます。すべての気泡を取り除き、針を廃棄します。シリンジから空気を反転させて排出することにより、各シリンジをプライミングします。
3. 4つのシリンジを時計回りにミキサーに組み立てます(シリンジ1-4、表2)、反対側に同じ流れがあります。最終的な外観の概略図については、 図 1B を参照してください。
4. 可動プレートの両側にあるベアリングハウジングを保持します。ハウジングの底面に指を置くと、機械的な停止による挟み込みの危険性があるため、避けてください。可動プレートがシリンジに均等に収まるまで、モバイルプレートを慎重に下げます。
  注意: シリンジプランジャーは、操作前にすべて同じ高さにある必要があります。
5. プレートを着実かつスムーズに押し下げ、これらのストリームボリュームに対して約0.5秒から1秒で操作を完了することを目指しています。
6. LNP分散液を含むクエンチバスにキャップをします。
7. 使用後は、以下の手順3.5の指示に従って、MIVMのクリーニングを実行してください。
シリンジポンプで駆動するMIVMミキサーを用いたLNPの製剤化
1. ステップ 3.1 の説明に従って MIVM を組み立てます。
2. 溶媒溶液および抗溶媒溶液を、必要な組成サイズに対して十分な量で、目的の組成で調製します(表3)。
  注:これらは、水性抗溶媒(ステップ1.4)およびエタノール溶媒(ステップ3.2.1)の流れと同じ組成ですが、表3のより大きなシリンジ容量で使用するためにスケールアップされています。
3. 溶液を20 mLの容量の気密シリンジにロードし、端にルアーアダプターを取り付けたPTFEチューブを取り付けます。シリンジとチューブを反転させてから、シリンジとチューブをプライミングし、空気を排出します。
4. 図 3A に示すように、シリンジをシリンジポンプに取り付け、シリンジを MIVM のミキサー入口に取り付けます。
  注:CIJは、同じ方法でポンプ を介して 操作することもできますが、1つの抗溶剤および溶剤ストリームシリンジのみを使用します。
5. 100 mM pH 4 アセテート緩衝液ストックを 10 mM に希釈し、総容量 320 mL で MIVM 溶出液クエンチ浴として使用します。
6. クエンチバスをMIVM出口の下に置きます。
7. シリンジポンプの体積流量を20mL/minに設定します。
  注:体積流量は、シリンジポンプで値を手動で設定して、さまざまなマイクロミキシング条件でLNPを形成することにより、2 mL / minから40 mL / minまで変更できます。
8. シリンジポンプを始動しますが、最初の10秒間の廃液が廃棄物ビーカーに流れ込むのを待ちます。この 10 秒のスタートアップフロー期間の後、MIVM の廃液をクエンチバスに収集します。
9. 選択した(20 mL/分)体積流量で調製したLNP分散液を含むクエンチバスを取り外し、キャップをします。
  注:この手順を繰り返すことで、適切なクエンチバス容量を選択することにより、異なる流速でLNPを合成することができます。
10. 各実験の合間に(流量を変更する場合)に、次のLNP合成を開始する前に、前の流量条件で行われたLNPの収集を防ぐために、少なくとも2倍の量の出口チューブを洗い流してMIVMを清掃します。
使用後の機器クリーニング
1. シリンジを取り付けたままミキサーをスタンドから取り外し、廃棄物容器にかざします。シリンジを取り外し、ホールドアップボリュームを容器に排出します。次に、ミキサーアセンブリを逆さまに持ち、スパナレンチを使用してミキサーを分解します。
2. 出口チューブを溶剤(エタノールなど)ですすぎ、空気または窒素で乾燥させます。
3. 脱イオン水やエタノールなどの適切な溶媒で混合形状をすすぎ、続いてエタノールですすいでください。空気または窒素の流れを使用してコンポーネントを乾燥させます。
4. Oリングを脱イオン水ですすぎ、吸い取って乾かします。
  注意: Oリングが伸びたり変形したりしているように見える場合は、一晩風乾させてから使用してください。Oリングは消耗部品であるため、大量の在庫を維持してください。翌日までに形状が回復しない場合は、Oリングを廃棄してください。
5. 上部ディスクを溶剤で十分にすすぎ、空気または窒素の流れを使用して表面とシリンジフィッティングを乾燥させます。
6. 各シリンジを良好な溶媒ですすいでください(例:.、脱イオン水またはエタノール)。.エタノールで最後のすすぎを適用し、次に使用する前に風乾します。

4. LNPの後処理

バッファー交換とエタノール除去
1. 20 kDaの分子量カットオフ透析カートリッジを備えた適切なサイズの透析カセットを使用して、pH 7.4の10 mM HEPESバッファーに対してLNP分散液を透析します。
  注:このステップでは、酢酸緩衝液をHEPESに置き換えることにより、残留10%エタノールを除去し、分散液のpHを上昇させます。
2. ストック1 M HEPESバッファーを10 mMに希釈し、総容量1 Lにします。
3. シリンジとニードルを使用して、LNP分散液を12 mL透析カセットにロードします。
4. 透析カートリッジを1LのHEPESバッファーに浸し、外部バッファーを磁気的に攪拌します。3時間後に外部HEPESバッファーを交換し、さらに3時間後に透析カートリッジを取り外して、合計6時間の透析時間を確保します。
5. 透析したLNP分散液を透析カートリッジから取り出し、使用済みカートリッジを廃棄します。
超遠心分離 による LNP懸濁液濃縮
1. 懸濁液をMWCOが100kDa³⁰の適切なサイズの遠心フィルターにピペットで移します。
  注:遠心フィルターは、通常0.5mLから12mLまで、さまざまなサイズで入手可能です。
2. 分散液を2000 x g で10〜20分間(室温)遠心分離し、濃度を約5〜20倍に増やします。
  注:遠心分離中は、5分ごとにサンプルをチェックして、適切な量の液体が残っていることを確認してください。

5. LNPの特性評価

動的光散乱(DLS)による流体力学的直径測定
1. 調製したLNP分散液750 μLまたは900 μL(希釈液なし)を、それぞれプラスチック製のマイクロキュベットまたは角型キュベットに分注します。
  注意: 少量のものは、適切なキュベットにも使用できます。
2. LNPが分散する溶媒に適切な粘度を設定します(つまり、10 vol%エタノール混合物の場合は1.26 cP)。
3. 後方散乱光を 25 °C で 173° の角度で収集し、続いて Stokes-Einstein モデルと ISO 標準ドキュメント 13321:1996 E で定義されている光散乱相関関数級数拡張の最初のキュムラントを使用して LNP のサイズを決定します。
4. 測定を少なくとも3回繰り返します。
ゼータ電位測定
1. ~800 μL の調製済みLNP分散液を折り畳まれたキャピラリーゼータサイザーセルに加えます。
  注:キャピラリーチャネル内に気泡が閉じ込められるのを避けるために、液体の半分を細胞に分注し、逆さまに保持してから回転させます。
2. 測定を少なくとも3回繰り返します。
  注:最良の結果を得るには、バッファーの導電率を0.2〜2ミリシーメンス/cmにする必要があります。
市販のRNA定量キットによるカプセル化効率(EE)測定
1. アッセイキットに付属のpH 7.5の20x Tris-EDTA(TE)バッファーをヌクレアーゼフリー水を使用して1倍の濃度に希釈します。
2. Triton X-100溶液を2重量%で調製します。
3. 1x TEバッファーで適切な量のLNP分散液を希釈し、RNAの総質量濃度が約0.6 μg/mL、エタノール含有量が0.2 vol%未満になるようにします。
4. 前のステップと同様のサンプルを調製しますが、0.5重量%のTriton X-100を含んでおり、LNPを効果的に溶解し、Triton X-100の非存在下と存在下でそれぞれ「遊離」RNA濃度と全RNA濃度の区別を容易にします。
5. 1x TEバッファーに0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mLの濃度のコントロールRNA溶液を適量調製します。
  注:RNAキットは、最初に希釈する必要がある場合があります。
6. 前の手順を繰り返しますが、0.5重量%のTriton X-100です。
7. Ribogreen色素(キットに付属)を1x TEバッファーで200倍に希釈します。
8. Triton X-100の有無にかかわらず、調製したすべてのコントロールRNAおよびサンプル溶液に、希釈したRibogreen色素を適量追加します。色素は、コントロールRNAとサンプル溶液の両方で2倍に均等に希釈する必要があります。その結果、色素の全希釈率は、アッセイキット内の元の濃度の400倍になります。
9. コンテナを渦で混ぜます。
10. プレートリーダーで分析するために、96ウェル、未処理、平底、不透明プレートを準備します。
11. 100 μLの量のサンプルとRNAコントロールをプレートの別々の細胞に分注します。
  注:Triton X-100を含む溶液での気泡形成に注意してください。各サンプルに対して少なくとも 3 回の繰り返しを行い、少なくとも 350 μL のサンプルが必要です。
12. プレートリーダーを使用して、励起波長485 nm、発光波長528 nm、照明持続時間1回あたり約10秒で蛍光強度を記録します。振る必要はありません。
  注:EEはから決定され、Iと_{Tritonの併用} 、および_I はTriton X-100の有無にかかわらず、それぞれ3回のサンプルの反復の平均蛍光強度を表し、_{aはTritonあり、aはTritonあり} 、_a はTriton X-100ありとない場合の2つの平均検量線に対する線形適合の傾きを示し、それぞれ³¹。

代表的な結果

最適なLNP製剤のスクリーニングは、適切な速度で操作すれば、2ストリームCIJ乱流ミキサーを使用して、比較的少量の材料で迅速に達成できます。図 3A に示すように、プログラム可能なシリンジポンプで駆動される μMIVM ミキサーは、小さな単分散 LNP を形成するために、臨界レイノルズ数を超える十分なマイクロミキシングを達成することの重要性を強調するために使用されます。表 3 に LNP の製造に使用される配合の概要を示し、ミキサーのセットアップはステップ 3.4 で概説したプロトコルに従います。LNPサイズは、レイノルズ数の関数として動的光散乱(DLS)によって特徴付けられました。図3Bに示すように、臨界Reが5000を超えると、小さくて単分散のLNPが観察されます。さらに、シリンジをハンドヘルド操作またはミキシングスタンド(図3Bの右端のデータポイント)を使用してシリンジを均一に押し下げると、高いレイノルズ数(~10^{4-10 5})にアクセスできます。図2Aに示すミキシングスタンドは、すべてのシリンジを同時に均一に押し下げる²⁷。その結果、このようなLNPも最適なサイズになります。混合が不十分な場合(つまり、Reが小さすぎる場合)、より大きなLNPが形成されます。低Re(写真1)と高Re(写真2)で形成されたLNPを代表する写真を図3Bに示します。低Reで作製した試料は濁っており、大きなコロイド光散乱構造の存在を示しています(チンダル効果)が、高Reで形成されたLNPは、小さなコロイドからの弱い青方偏移散乱により、透明に見えます。

イオン化可能な脂質は、異なる物理化学的特性を持ち、他の点では同一の脂質製剤で製造されたLNPの物理化学的特性に影響を与えます。CIJミキサー(図1A)を使用してこれをテストします。表4 は、FDAが承認した2つのイオン化脂質(ALC-0315とMC3)を使用して作られた製剤を示しています。 図4A は、ALC-0315からpH 5で作製されたLNPが~80 nmであるのに対し、MC3を使用して作製されたLNPは~60 nmであることを示しています。さらに、pH 5 では、MC3-LNP は正のゼータ電位 (~28 mV) を持ち、ALC-LNP は中性のゼータ電位 (<10 mV) を持ちます。この表面電荷の区別とLNPの全体的なサイズは、2つの脂質のpKaから生じます。MC3は、ALC0315(6.09)と比較すると、pKa(6.44)が高くなっています³²。したがって、pH 5ではMC3脂質のより高い画分がチャージされます。どちらの製剤にも1.5 mol%のPEG-脂質安定剤が含まれています。しかし、MC3-LNPは、拡散限定凝集中のLNPアセンブリ中の静電反発が大きいため、より小さなサイズで安定し、より小さなサイズでの成長を阻止します。 図4Bに示すように、どちらの配合も高いカプセル化効率(>90%)を示しています。脂質の化学的性質は、LNPの全体的な特性と性能を決定する上で重要であるため、ターゲットアプリケーションに基づいて慎重に選択する必要があります。

乱流ミキサー形状(ステップ2.3とステップ3.3)の両方を使用して製造されたLNPは、同様の物理化学的特性を持っています。この比較は、バルクピペット混合などの貧弱な混合技術から作られたLNPにさらに拡張され、乱流ミキサーと不均一な混合技術の違いをさらに説明します(図1C)。図5に示すように、表5にLNPの製造に使用される配合の概要を示します。ピペット混合法の場合、等量のエタノールと水性流を15〜20秒間ピペッティングして急速に混合し、続いて混合物をpH 4のアセテート緩衝槽にピペッティングします。図 5A は、10 mM 酢酸バッファー槽 (pH 4、10 vol% エタノール) のクエンチ水中の LNP のサイズが、使用するミキサー形状 (CIJ または MIVM) に関係なく、驚くほど類似しており、小さい (~50 nm) ことを示しています。しかし、ピペットミキシングで作製したLNPは、乱流ミキサーで作製したLNPの2倍の大きさです。これは、異なるCIJ形状から作られたLNPは、十分に高い速度(臨界レイノルズ数を超える乱流領域)で作られると同様の特性を示す一方で、混合が不十分な場合、より大きな多分散LNPになることを示しています。

次に、LNPを10 mM HEPES緩衝液、pH 7.4(容量100倍)で透析し、エタノールを除去してpHを7.4に切り替えます。このプロセス中に、 図5Aに示すように、LNPの融合とわずかに大きいサイズへの成長があり、これは文献³³で十分に研究された融合メカニズムと一致しています。全体として、CIJおよびMIVMミキサーを使用して製造されたLNPは100nm未満ですが、ピペットミキシングを使用して製造されたLNPは約140nmです。 図5Bに示すように、これらの製剤のゼータ電位は10 mV未満であり、pH 7.4ですべて中性であることを示しています。さらに、それらはすべて>95%の高いカプセル化効率を示しています(図5C)。したがって、最適な物理化学的特性を持つLNPは、乱流ミキサー技術を使用して簡単に製造できます。これらのLNPの性能は、HeLa細胞で in vitro トランスフェクションを行うことによって評価されます。

ルシフェラーゼベースのin vitroトランスフェクションアッセイプロトコルは、以前の出版物³⁴から採用されています。図6Aは、表5に要約した3つの製剤について、1000細胞あたりの発光(RLU)をプロットしたものです。リポフェクタミン3000はポジティブコントロールとして使用されます。リポフェクタミン3000は一般的にDNA製剤に使用されることに注意することが重要です。しかし、これらの実験では適切なコントロールとして機能しました。2ジェットCIJおよび4ジェットMIVMミキサーを使用して製造されたLNPは、ピペット混合を使用して製造されたLNPよりもはるかに優れたトランスフェクションを示します。LNPあたりのペイロードが大きいため、大きな粒子は小さな粒子よりも優れたトランスフェクションが期待されますが、ここでピペットミキシングを使用して作成されたLNPは、トランスフェクションの効果が低くなります。これは、CIJ技術で作られたLNPとピペットミキシングで作られたLNPの構造に大きな違いがあることを明確に示しています。CIJミキサーとMIVMミキサーで作製したLNPのトランスフェクション効率は基本的に同じです。リポフェクタミン 3000 は、最も低いトランスフェクション効率を示します。図6Bは、レサズリンナトリウム塩³⁵に基づく細胞生存率アッセイを用いて、HeLa細胞に対するin vitroでのLNP毒性を評価しています。すべての製剤は低い細胞毒性を示しており、ナノ粒子処理を受けていない対照と比較して、生存細胞の割合としてプロットすると、高レベルの細胞生存率が示されます。

figure-representative results-3890
図1:LNPを製造するための混合方法。 (A)透明なミキサーと実験室で定期的に使用される組み立てられたデルリンミキサーのセットアップの写真を示す2ジェット閉じ込めインピンギングジェットミキサー(CIJ)。(B)透明なミキサーと組み立てられたステンレス鋼およびデルリンミキサーのセットアップの写真を示す4ジェットマイクロマルチインレットボルテックスミキサー(μMIVM)。透明ミキサーの入口ストリームは、ミキシング形状の視覚化を改善するためにミキサーの側面に移動していますが、実際のミキサーでは、入口ストリームは上から入ります。CIJとμMIVMはどちらも、乱流領域で流れる十分な液体速度で動作し、混合は1μm未満のコルモゴロフマイクロスケールを生成し、~1.5ミリ秒で過飽和を達成することができます。 (C) 水溶液とエタノール溶液を混合して少量のLNP分散液を調製するために広く使用されているピペット混合セットアップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-4679
図2:μMIVMとそのミキシングスタンドの拡大図。 (A)シリンジの均一で迅速な下降を容易にするミキサースタンドの下に、ガラスシリンジを使用してμMIVMを組み立てました。この図はMarkwalter et ^al.29から転載されています。(B)内部部品を示す分解されたμMIVM。このミキシング形状は、 図1Bの透明ミキサーと同じですが、入口ストリームは側面の円筒面ではなく、上部ディスクから流入します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-5298
図3:乱流ミキサーでレイノルズ数を増やすと、LNPの流体力学的直径がプラトー臨界レイノルズ数まで減少します。 (A)シリンジポンプとμMIVMセットアップの概略図で、ストリームの体積流量を設定することにより乱流ミキサーのレイノルズ数を制御するために使用されます。(B)MIVMのLNP流体力学的直径とレイノルズ数。レイノルズ数と乱流エネルギー散逸を増やすと、混合が改善され、粒子の混合、過飽和、成長がより均一になります。臨界レイノルズ数を超えると、LNPサイズはDa<<1条件により、流量が増加しても一定に保たれます。つまり、溶媒/抗溶媒拡散時間がNPアセンブリ時間よりも短くなります。記載されている流量は、4つのストリームすべての合計流量です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-5983
図4:異なるイオン化脂質で生成されたLNPのコロイド特性。 (A)ALC-0315とMC3の2つの異なるイオン化脂質で生成されたLNPの流体力学的直径とゼータ電位。測定は、LNP形成後のクエンチバスでpH 5で行われます。イオン化可能な脂質の見かけのpKaの違いは、LNPのコロイド特性に影響を与えます。 (B)両方のLNPのカプセル化効率測定(n = 3、エラーバーは1標準偏差を表します)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-6542
図5:MC3イオン化可能脂質を用いてルシフェラーゼmRNAをカプセル化した異なるミキサーで作製したLNPのコロイド特性。 (A)2ジェット、4ジェット、およびピペットミキサーで製造されたLNPの流体力学的直径。測定は、LNP形成後(左側)と透析後(右側)のクエンチバスの酸性条件下で行われます。LNPサイズは、イオン化可能な脂質の脱イオン化によりpH中和中に成長し、LNPの融合と成長につながります。脂質-PEG安定剤は、ミクロンサイズの沈殿物が形成される前に、この粒子の合体成長を阻止します。(B)10 mM HEPES、pH 7.4条件での透析LNPの表面電荷測定(ζ電位として)。すべてのLNPは0mVから2mV以内にあり、これはこれらの粒子表面が中性であり、ほとんど検出できない量のカチオン電荷しか持っていないことを示しています。(C)LNPの透析後のカプセル化効率測定(n = 3、エラーバーは1標準偏差)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-7330
図6:調製されたままのLNPによるHeLa細胞のトランスフェクション。 (A)ルシフェリン処理後の発現ルシフェラーゼ酵素の発光。(B)LNPとのインキュベーション後のHeLa細胞の生存率細胞は、レサズリン代謝アッセイで示されているように、生存率に統計的に有意な変化を示していません(n = 4、エラーバーは1標準偏差を表します)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ストリーム / クエンチバス	コンポーネント	定式化	株式	容積
シリンジ 1 - エタノールストリーム (総脂質6mg/mL)	イオン化脂質(MC3)	50モル%	50 mg / mLの	0.5ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	酵母RNA	N/P 6	10 mg / mLの	0.5ミリリットル
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 4	100 mM、pH 4	0.5ミリリットル
クエンチバス	アセテートバッファー	10 mM、pH 4	100 mM、pH 4	4ミリリットル

表1:CIJミキサーで製造された標準パチシランLNP製剤。 酵母RNAは、このプロトコルのモデルRNAとして使用されます。すべての溶液を分子的に溶解し、完全に混合してからシリンジにロードします。

ストリーム / クエンチバス	コンポーネント	定式化	株式	容積
シリンジ 1 - エタノールストリーム (総脂質6mg/mL)	イオン化脂質(MC3)	50モル%	50 mg / mLの	0.5ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	酵母RNA	N/P 6	10 mg / mLの	0.5ミリリットル
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 4	100 mM、pH 4	0.5ミリリットル
シリンジ 3 - エタノールストリーム (総脂質6mg/mL)	イオン化脂質(MC3)	50モル%	50 mg / mLの	0.5ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 4 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	酵母RNA	N/P 6	10 mg / mLの	0.5ミリリットル
シリンジ 4 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 4	100 mM、pH 4	0.5ミリリットル
クエンチバス	アセテートバッファー	10 mM、pH 4	100 mM、pH 4	8ミリリットル

表2:MIVMミキサーで製造された標準パチシランLNP製剤。 MIVMミキサーは、2つの溶媒と2つの抗溶媒の4つのストリームを利用します。不等モーメントのストリームを使用できます。ただし、このプロトコルでは、モーメンタが等しいストリームが選択されます。

ストリーム / クエンチバス	コンポーネント	定式化	株式	容積
シリンジ 1 - エタノールストリーム (総脂質6mg/mL)	イオン化脂質(MC3)	50モル%	50 mg / mLの	20ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	酵母RNA	N/P 6	10 mg / mLの	20ミリリットル
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 4	100 mM、pH 4	20ミリリットル
シリンジ 3 - エタノールストリーム (総脂質6mg/mL)	イオン化脂質(MC3)	50モル%	50 mg / mLの	20ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 4 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	酵母RNA	N/P 6	10 mg / mLの	20ミリリットル
シリンジ 4 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 4	100 mM、pH 4	20ミリリットル
クエンチバス (収集時間 = 30秒)	HEPESバッファー	10 mM、pH 7.5	1 M、pH 7.5	320ミリリットル

表3:シリンジポンプで駆動されるMIVMミキサーによって製造されたLNP製剤。 DODMAは、モデルRNAとして酵母RNAとともにイオン化可能な脂質として利用されています。このプロトコールでは、40 mL/minでの実行例が選択されています。

ストリーム / クエンチバス	コンポーネント	定式化	株式	容積
シリンジ 1 - エタノールストリーム (総脂質12mg/mL)	イオン化脂質(MC3またはALC0315)	50モル%	50 mg / mLの	0.5ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.6 mg/mL RNA)	酵母RNA	N/P 6	10 mg / mLの	0.5ミリリットル
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.6 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 5	100 mM、pH 5	0.5ミリリットル
クエンチバス	アセテートバッファー	10 mM、pH 5	100 mM、pH 5	9ミリリットル

表4:CIJミキサーで作製した2つの異なるイオン化可能脂質からのLNP製剤。 製剤はALC-0315またはMC3のいずれかから作られますが、他のすべての成分は同じままです。

ストリーム / クエンチバス	コンポーネント	定式化	株式	容積
シリンジ 1 - エタノールストリーム (総脂質6mg/mL)	イオン化脂質(MC3)	50モル%	50 mg / mLの	0.5ミリリットル
	Zwitterion脂質(DSPC)	10モル%	5 mg / mLの
	コレステロール	38.5モル%	5 mg / mLの
	ペグ化脂質(DMG-PEG2000)	1.5モル%	4 mg / mLの
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	FLuc mRNA	N/P 6	1 mg/mL	0.5ミリリットル
シリンジ 2 - 水性ストリーム (0.3 mg/mL RNA)	アセテートバッファー	20 mM、pH 4	100 mM、pH 4	0.5ミリリットル
クエンチバス	アセテートバッファー	10 mM、pH 4	100 mM、pH 4	4ミリリットル

表5:CIJミキサーで製造された標準パチシランLNP製剤。 ルシフェラーゼタンパク質を発現するFLuc mRNAは、生物発光アッセイを用いて遺伝子発現を測定するために用いられます。

補足ファイル1:CIJおよびMIVMミキサーのサプライヤー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

2つの閉じ込められたインピンギングジェット乱流ミキサーを使用した核酸ポリマーを含むLNPの合成が発表されました。適切な速度で実施すると、CIJ乱流ミキサーは、混合の時間スケールがLNPアセンブリ時間よりも短くなることを保証し、狭いサイズ分布²¹の小さなLNPを形成するための均質な過飽和条件を生成します。その結果、異なるタービュレントミキサー形状(2ジェットCIJおよび4ジェットMIVMミキサー)を使用して同じ化学的性質で製造されたLNPは、同様の物理化学的特性を示し、良好なトランスフェクション効率を示します(図5 および図6)。対照的に、ピペッティングを使用して作製したLNPは、混合が不十分であるため、トランスフェクション効率が低く、より大きく、より多分散したLNPが得られます(図5A)。混合と組み立ての動力学がLNP処理において重要な役割を果たすことは長い間理解されてきました。Cullisらは、エタノールとバッファーの急速な対流拡散混合は、狭いサイズ分布の小さな粒子の形成をもたらすが、一方、ゆっくりとした拡散混合は、広いサイズ分布のより大きな粒子をもたらすことを指摘^した9。CIJ乱流ミキサーにおける混合の時間スケールは、^{ミキサー27}へのストリームの入口流量に比例して減少する。これは、慣性力と粘性力の比を測定する無次元レイノルズ数(Re)によって定量化されます。CIJとMIVMのミキシングチャンバー内の乱流は、十分に高いReで発生するため、乱流の渦の伸びにより長さが小さくなり、拡散による溶媒/抗溶媒の混合が急速に行われます。乱流の長さスケールは、ミキシングデバイスの特定の形状ではなく、Reに依存します。そのため、CIJまたはMIVMのいずれかが同じLNP粒子を作成し、さまざまなサイズのMIVMミキサーが同じNPサイズ²⁷を作成する理由です。高いReでは、高い入口速度に対応して、LNPをバッチ間のばらつきなしに再現性よく作製できます(図3B)。

このプロトコールでは、乱流CIJミキサーを使用して、異なる物理化学的特性を持つさまざまなmRNA、DNA、またはsiRNA LNPを製剤化することができます。この手法は、組成と濃度の多様性を可能にするだけでなく、ベンチセールで処方を迅速にスクリーニングし(数ミリグラム)、リード製剤を5 L/minの生産速度でより大きな工業用バッチサイズにスケールアップするための明確な道筋を提供します³⁶。これは、バルクミキシングやマイクロ流体工学など、他のいくつかの技術にとって大きなハードルとなっています。例えば、バルク処理技術では、数ミリリットルのスケールでもLNPを一貫して再現性よく製造することはできません。マイクロ流体技術は、バルク混合技術よりも大幅に改善され、均一で再現性のあるLNPの製造を可能にします。ただし、ミリグラムの範囲^{にすぎません29}。冒頭で詳述したように、マイクロ流体デバイスの並列化は、生産規模へのスケーリングの試みを提供しますが、ファウリングの問題を排除するわけではなく、閉じ込められた衝突ジェット技術に基づくミキサーほどうまくスケーリングすることはできません。

これらの利点以外にも、CIJミキサーは、ターゲティング機能を発揮したり、遺伝子編集を行ったりする次世代LNPの製造に役立ちます。現在のLNP製剤は、脂質と核酸が同様の拡散性を持つため、ベンチスケールではわずかに混合が不十分でも作ることができます。しかし、遺伝子編集アプローチでは、CAS9タンパク質をコードするために、小さなガイドRNA分子や大きなmRNA転写産物など、分子量が大きく異なる核酸種をカプセル化する必要があるかもしれない³⁷。これらの異なる種の拡散時間スケールは非常に異なるため、化学量論的比率での均一なカプセル化は困難です。この均一なカプセル化の問題は、混合効率が悪くなるほど顕著になります。同様に、非肝細胞を標的とするためには、強く結合したゆっくりと拡散する安定剤(標的化リガンドを持つ高分子量のブロック共重合体など)を組み込む必要があるかもしれません。14 kDaまでのリガンドを標的とすることで、ナノ粒子の集合前に共重合体をブロックすることができ、CIJミキシング³⁸を用いてNPに均一に組み込むことができます。CIJ乱流ミキサーは、異なる拡散率を持つ成分で作られたLNPを製造するための便利なツールです。

CIJ乱流ミキサーは、LNPの定式化において他のミキサーに比べていくつかの利点がありますが、各形状に関連する制限に注意することが重要です。2ジェットCIJミキサーでは、チャンバー内で均一な乱流マイクロミキシングを達成するために、両方の入口流(エタノールと水)が等しい運動量(10%〜30%以内)を持つ必要があります。出口ストリームが50:50の溶媒/抗溶媒からなるという事実は、沈殿が発生する混合キャビティ内の過飽和のレベルを制限する²⁹。この欠点は、4ジェットMIVMミキサーによって対処され、不等モーメントの4つのジェットを利用して、ミキシングチャンバー内で高い過飽和状態を達成できます。さらに、どちらのミキサーも総質量のミリグラムオーダーである必要があるため、多くの異なるLNP製剤のハイスループットスクリーニングには理想的ではありません。単純なLNP製剤の場合、スクリーニングはマイクロ流体またはマイクログラムスケールのピペッティング戦略で行うのが最善であり、いくつかのリード製剤が同定されたら、閉じ込められたインポンピングジェット技術に移すのが最適です。ミキサーのデッドボリュームを考慮することも重要です。CIJでは、2つのジェットミキサー、ホールドアップ容量は50〜100マイクロリットルです。この材料量は、プロセスからの回収を計算するときに、クエンチバスで捕捉された量から差し引く必要があります。これらの損失は、大規模に操作する場合は重要ではありませんが、ここに示すように、合計容量が5 mLになると10%の損失になります。インピンギングジェット乱流ミキサーは、FDAが承認した2つのCOVID-19ワクチンが証明しているように、GMPスケールでLNPを製造するための貴重なツールです。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Helper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305167
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Confined Impinging Jets Mixer	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Ionizable lipid
Ethanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United States	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, free acid	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID	Idex Health & Science	1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting	Idex Health & Science	P-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer stand	Holland Applied Technologies	N/A	See Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex Mixer	Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule - CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting - CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting - MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing - CIJ	Idex Health & Science	1517	Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing - MIVM	N/A	N/A	Fit to ferrule ID.
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	N/A
Plastic two-piece syringe 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sodium Salt	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Sodium Acetate	Millipore Sigma	32319-500G-R
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Syringe Filters, Sterile	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Water, Endotoxin Free	Quality Biological	118-325-131	RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

参考文献

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