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  • Repräsentative Ergebnisse
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  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Synthese von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) unter Verwendung von Confined Impinging Jet (CIJ)-Mischertechnologien demonstriert, einschließlich eines zweistrahligen CIJ und eines vierstrahligen Multi-Inlet-Vortex-Mischers (μMIVM). Die CIJ-Mischer erzeugen reproduzierbare, turbulente Mikromischumgebungen, die zur Produktion von monodispersen LNPs führen.

Zusammenfassung

Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben ihr enormes Potenzial als therapeutische Verabreichungsmittel unter Beweis gestellt, wie die Zulassung und weltweite Verwendung von zwei COVID-19-Boten-RNA-Impfstoffen (mRNA) zeigt. In kleinem Maßstab werden LNPs oft mit Hilfe von Mikrofluidik hergestellt. Die Einschränkungen dieser Geräte schließen jedoch einen großflächigen Einsatz aus. Die COVID-19-Impfstoffe werden in großen Mengen mit Hilfe von turbulenten Mischern mit begrenztem Aufpralljet (CIJ) hergestellt. Die CIJ-Technologie ermöglicht die Produktion im Labormaßstab mit der Gewissheit, dass sie auf Produktionsmengen skaliert werden kann. Die Schlüsselkonzepte beim CIJ-Mischen sind, dass die Mischlänge und die Zeitskala durch die Turbulenzintensität im Mischhohlraum bestimmt werden und dass die Nanopartikelbildung abseits der Wände erfolgt, wodurch das Problem der Ablagerung auf Oberflächen und der Verschmutzung beseitigt wird. Diese Arbeit demonstriert den Prozess der Herstellung von LNPs unter Verwendung der Technologie eines begrenzten Aufprallstrahlmischers mit zwei Geometrien: dem zweistrahligen CIJ und dem vierstrahligen Multi-Inlet-Vortex-Mischer (MIVM). Es werden die Vor- und Nachteile der einzelnen Mischgeometrien diskutiert. In diesen Geometrien werden LNPs durch schnelles Mischen eines organischen Lösungsmittelstroms (in der Regel Ethanol, das die ionisierbaren Lipide, Co-Lipide und stabilisierenden PEG-Lipide enthält) mit einem wässrigen Anti-Lösungsmittelstrom (wässriger Puffer, der RNA oder DNA enthält) gebildet. Die Betriebsparameter für die CIJ- und MIVM-Mischer werden vorgestellt, um reproduzierbare LNPs mit kontrollierter Größe, Zetapotenzial, Stabilität und Transfektionseffektivität herzustellen. Die Unterschiede zwischen LNPs, die mit schlechtem Mischen (Pipettierlösungen) hergestellt wurden, im Vergleich zum CIJ-Mischen werden ebenfalls dargestellt.

Einleitung

mRNA-basierte Therapeutika bergen ein großes Potenzial für die Behandlung und Prävention einer Vielzahl von Krankheiten, darunter Infektionskrankheiten, genetische Störungen und Krebs1. Im Gegensatz zu niedermolekularen Therapeutika, die passiv über die Zellmembran diffundieren können, müssen Nukleinsäuren für die intrazelluläre Verabreichung verkapselt werden2. Die Verkapselung verleiht der mRNA sowohl Struktur als auch Stabilität, erleichtert ihre intrazelluläre Verabreichung über endozytäre Wege und verhindert den Abbau von intra- und extrazellulären Komponenten wie Nukleasen3. Für die Verkapselung und Verabreichung von mRNA wurde eine Vielzahl von Materialien und Nanocarriern entwickelt, darunter anorganische Nanopartikel, Polymere, Lipide und lipidähnliche Materialien1. Unter diesen haben sich LNPs zur wichtigsten Verabreichungsplattform für mRNA-basierte Therapeutika entwickelt4.

LNPs bestehen aus vier Lipidkomponenten: ionisierbarem Lipid, Cholesterin, zwitterionischem Lipid und PEG-Lipidstabilisator5. Ionisierbare Lipide, die für die mRNA-Verabreichung geeignet sind, weisen ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen der Lipidhydrophobizität und der Dissoziationskonstante (pKa) einer ternären Amingruppe6 auf. Das ionisierbare Lipid pKa hat typischerweise einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,7, wie z. B. KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) und ALC-03157. Diese pKa-Beschränkung des ionisierbaren Lipids ermöglicht sowohl die Verkapselung von Nukleinsäurepolymeren als hydrophobe Lipidsalze als auch die intrazelluläre Abgabe durch einen "Endosomen-Escape"-Prozess. LNPs gelangen über (verschiedene) Endozytosewege in eine Zielzelle, die alle eine Ansäuerung des Endosoms von pH 7,4 auf pH ~58 beinhalten. Das ionisierbare Lipid pKa sorgt dafür, dass LNPs unter physiologischen Bedingungen nahezu neutrale Oberflächen haben, in einem säuernden Endosom jedoch kationisch werden9. Diese pH-Reaktion ermöglicht die selektive Aufspaltung nur der endosomalen Membran, die Freisetzung des verkapselten Nukleinsäurepolymers und bewahrt die Lebensfähigkeit der Zellen, im Gegensatz zu dauerhaft kationischen Lipiden, die in Transfektionssystemen wie Lipofectamine verwendet werden. Cholesterin ist ein hydrophobes, interstitielles Molekül in der LNP-Struktur, das die Lipidfließfähigkeit verbessert. Das zwitterionische Lipid spielt eine strukturelle Rolle und bildet eine Doppelschicht auf der LNP-Oberfläche. Das Poly(ethylenglykol)-lipid (PEG-Lipid) ist ein kolloidaler Stabilisator, der die LNP-Stabilität erhöht, indem er der LNP-Oberfläche einen polymeren sterischen Stabilisator verleiht, der der Aggregation von LNPs widersteht. Dies stabilisiert das LNP, insbesondere bei Änderungen des pH-Werts, die die freie Basenform des ionisierbaren Lipids regenerieren, das sich wie ein hydrophobes Öl verhält. Die Rezeptur von Onpattro (Patisiran) (im Folgenden als LNP-Formulierung bezeichnet) wird häufig als Ausgangspunkt für die LNP-Formulierung mit ionisierbarem Lipid MC3, Cholesterin, Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und PEG2000-DMG verwendet, die in Ethanol gelöst und gegen eine wässrige Lösung von RNA10 gemischt werden.

Zur Herstellung von LNPs, die Nukleinsäurepolymere verkapseln, können verschiedene Techniken verwendet werden, wobei die meisten von ihnen auf dem gemeinsamen Thema beruhen, einen Ethanolstrom, der Lipide enthält, schnell mit einem wässrigen Strom zu mischen, der die gewünschte Nukleinsäure (siRNA, mRNA oder DNA) enthält9,11,12,13,14. In dieser Hinsicht bieten Bulk-Mischverfahren wie das Pipettenmischen und das Vortex-Mischen eine einfache Strategie zur Bildung von LNPs, die den Einsatz hochentwickelter Instrumente überflüssig macht12. Das Mischen in großen Mengen bietet jedoch keine homogene Verteilung der Komponenten, was zu einer suboptimalen LNP-Größenverteilung und einer erheblichen Variabilität von Charge zu Charge führt15.

Laboratorien verwenden routinemäßig mikrofluidische Mischtechniken, um reproduzierbare LNPs zu erhalten, indem eine genauere Kontrolle der Mischbedingungen erreichtwird 12,13,16. Die laminaren Strömungsbedingungen in mikrofluidischen Bauelementen, die aufgrund der kleinen Längenskalen und niedrigen Geschwindigkeiten in einer Mikrofluidikkammer inhärent sind, führen jedoch zu einer vergleichsweise langsamen Vermischung von Lösungsmittel und Lösungsmittel17. Die kleinen Kammerabmessungen schränken den Durchsatz und die Skalierbarkeit, die für die GMP-Produktion von LNPs erforderlich sind, stark ein, aber die Forscher haben mikrofluidische Kammern parallelisiert, um zu versuchen, das Produktionsvolumenzu skalieren 15. Eine parallelisierte Mikrofluidik-Geometrie beseitigt nicht das Problem der Lipidadsorption an Oberflächen während der Verarbeitung großer Volumina, ein Problem, das allgemein als "Fouling" der Mischvorrichtung bezeichnet wird, und es gibt Probleme mit der Gleichmäßigkeit und Stabilität der Strömungen, die das Scaleup der Mikrofluidik für die Produktion im industriellen Maßstab schwierig machen18,19. Es ist nicht verwunderlich, dass Pharmaunternehmen turbulente Aufprallstrahlmischer zur Herstellung von mRNA-LNPs für die COVID-19-Impfungeinsetzten 20.

Der Herstellungsprozess von RNA-beladenen LNPs beinhaltet das Mischen eines wässrigen Pufferstroms, der die RNA-Nutzlast enthält, mit einem Ethanolstrom, der die vier verschiedenen Lipidkomponenten enthält. Diese Formulierungen verwenden einen sauren Puffer mit einem pH-Wert von 4,0 oder weniger, der das ionisierbare Lipid auflädt, wenn sich die wässrigen und ethanolischen Ströme vermischen. Die positiv geladenen ionisierbaren Lipide interagieren elektrostatisch mit den negativ geladenen RNAs und bilden ein hydrophobes RNA-Lipidsalz. Hydrophobe Lipidspezies, einschließlich des RNA-Lipidsalzes, fallen in den gemischten Lösungsmitteln aus und bilden hydrophobe Zellkerne. Diese Kerne wachsen durch die Ausfällung von zwitterionischem Lipid und Cholesterin bis zu einem kritischen Punkt, an dem ausreichend pegyliertes Lipid an der Oberfläche der LNPs adsorbiert wird, wodurch das weitere Wachstum und der Wachstumsmechanismus gestopptwerden 21,22,23. Die Zugabe von wässrigem Puffer zur Lipidlösung hängt in dem Ausmaß, in dem Lipide ausfallen und LNPs gebildet werden, von zwei unterschiedlichen Zeitskalen ab: der Lösungsmittel-Antisolvent-Mischperiode,τ-Mischung, und der Kernwachstumsperiode, τagg. Die dimensionslose Damköhler-Zahl, definiert als Da = τmix/τagg, erfasst das Zusammenspiel zwischen diesen Zeitskalen24. Bei langsamem Mischen (Da > 1) wird die endgültige Größe von LNPs transportgesteuert und variiert mit der Mischzeit. Umgekehrt wird das Fluid beim schnellen Mischen (Da < 1) in Kolmogrov-lange Streifen oder Schichten fragmentiert, wobei die LNP-Bildung ausschließlich durch die molekulare Diffusion der einzelnen Bestandteile bestimmt wird, was zu einer homogenen Kinetik der LNP-Bildung führt. Um das letztere Szenario zu erreichen, muss die Lipidkonzentration einen kritischen Schwellenwert überschreiten, wodurch ein Zustand der Übersättigung erreicht wird, der für eine gleichmäßige homogene Keimbildung förderlich ist.

Es wird geschätzt, dass τagg von einigen Dutzend bis zu einigen hundert Millisekundenreicht 25. In ihrer einfachsten Konfiguration werden die beiden Ströme, von denen der eine Ethanol mit Lipiden und der andere einen wässrigen Puffer mit RNA-Fracht enthält, in eine Kammer injiziert, die als "Confined Impinging Jet" (CIJ)-Mischer bekannt ist. Turbulente Wirbel erzeugen Lösungsmittel-/Lösungsmittel-Streifenlängenskalen von 1 μm innerhalb von 1,5 ms, wenn sie bei geeigneten Geschwindigkeiten betrieben werden. Die Strömungsgeschwindigkeiten und die Mischgeometrie bestimmen die Umwandlung des linearen Impulses in turbulente Wirbel, die die Ströme vermischen. Dies wird durch die dimensionslose Zahl, die Reynoldszahl (Re), parametrisiert, die linear proportional zu den Strömungsgeschwindigkeiten ist. Re wird berechnet aus Re = Σ (ViDi/vi), wobei Vi die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Dampf, vi die kinematische Viskosität jedes Stroms und Di der Stromeinlassdurchmesser in 2-Strahl-CIJ-Vorrichtungen26 oder der Kammerdurchmesser in 4-Strahl-MIVMs27 ist. Anmerkung: Einige Referenzen für den CIJ verwenden nur einen einzigen Strahldurchmesser und eine einzige Geschwindigkeits, um Re28 zu definieren. Re liegt in einem mikrofluidischen Gerät im Bereich von 1-100, während in den CIJ-Geräten ein Re von 125.000 erreicht werden kann. In einem CIJ-Mischer kollidieren Ströme mit gleichem Impuls und geben ihren Impuls beim Aufprall als turbulente Durchmischung ab, was aufgrund der kleinen Kolmogorov-Mikroskalen und der kleinen Damköhlerzahl zu einer effizienten Mikromischung führt. Eine andere Art von Mischern ist der "Multiple Inlet Vortex Mixer" (MIVM), bei dem vier Ströme in eine zentrale Kammer geleitet werden. Bei diesem Aufbau sorgen kontinuierliche Ströme in die geschlossene Mischkammer für eine genau definierte Mischzeitskala. Alle Fluidelemente durchlaufen bei beiden Mischertypen die Hochenergiemischzone. Im Gegensatz dazu enthalten einfache Mischvorrichtungen wie T-Übergänge keine Kammer, die eine Mischzone bietet, was zu einer geringeren Durchmischung der beiden Ströme führt, da der einströmende Strömungsimpuls weitgehend in Austrittsrichtung und nicht in turbulente Wirbelerzeugung abgelenkt wird. Sowohl CIJ- als auch MIVM-Mischer können im Batch- oder kontinuierlichen Modus betrieben werden und bieten Flexibilität für die LNP-Produktion in verschiedenen Größenordnungen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie optimale LNP-Formulierungen durch den Einsatz von zwei Technologien mit begrenztem Aufpralljet hergestellt werden: 2-Strahl-CIJ und 4-Strahl-MIVM-Mischer. Der Betrieb von CIJ- und MIVM-Mischern wurde bereits für die Aufbereitung von NPs mit hydrophoben Kernmaterialien29 demonstriert. Dieser Artikel und das Video sollten als zusätzliche Ressource zur Bildung von NPs mit diesen Mischern konsultiert werden. Dieses Update konzentriert sich auf die lipidbasierte NP-Bildung. Es wird die Möglichkeit demonstriert, die Größe von LNPs durch Variation der Mikromischbedingungen zu optimieren. Darüber hinaus wird der Nutzen von CIJ-Technologien bei der Bildung stabiler, monodisperser LNPs mit verbesserter In-vitro-Transfektionseffizienz in HeLa-Zellen im Vergleich zu LNPs, die mit schlechter Pipettenmischung hergestellt wurden, gezeigt. Darüber hinaus werden die Vor- und Nachteile der einzelnen CIJ-Mischgeometrien sowie die geeigneten Bedingungen für das Scale-up dieser Mischer diskutiert.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Puffern, Lösungsmittel- und Lösungsmittelströmen

  1. Alle Lipidkomponenten werden in Ethanol bei gegebenen Massenkonzentrationen gelöst, wie in Tabelle 1 gezeigt, um eine Patisiran LNP-Formulierung10 herzustellen. Vor der Verwendung die Lösungen mit sanfter Beschallung auf 37 °C erhitzen, um alle ausgefällten Feststoffe wieder aufzulösen.
    HINWEIS: Größere Stammlösungen von mehreren Millilitern können aufbereitet und bei 4 °C gelagert werden.
  2. Bereiten Sie eine Acetatpufferlösung in einer Konzentration von 100 mM, pH 4, her, indem Sie 186 mg Natriumacetat und 464 mg Essigsäure in 80 ml nukleasefreiem Wasser kombinieren. Passen Sie den pH-Wert je nach Bedarf mit konzentriertem HCl oder NaOH an und füllen Sie das endgültige Volumen auf 100 mL auf.
  3. Bereiten Sie eine HEPES-Pufferlösung in einer Konzentration von 1 M, pH 7,5, vor, indem Sie 23,82 g HEPES-Salz in 80 mL nukleasefreiem Wasser lösen. Passen Sie den pH-Wert je nach Bedarf mit konzentriertem HCl oder NaOH an und füllen Sie das endgültige Volumen auf 100 mL auf.
  4. Verdünnen Sie das gewünschte Nukleinsäurepolymer und den 100 mM Acetatpuffer mit nukleasefreiem Wasser, um eine 300 μg/ml-RNA-Lösung in 30 mM Acetatpuffer herzustellen. Bereiten Sie ein angemessenes Volumen der Arbeitslösung für die geplanten Experimente vor, und dieses Protokoll erfordert insgesamt 1500 μl sowohl für die CIJ- als auch für die MIVM-Mischer.
    HINWEIS: Die vom Lieferanten erhaltene RNA befindet sich bereits in einem geeigneten Puffer, typischerweise in einer Konzentration von 10 mg/ml (Hefe-RNA) oder 1 mg/ml (Luciferase-kodierende mRNA, LucRNA oder GFP-kodierende mRNA, GFP-RNA). Hefe-RNA kann als kostengünstige Modell-RNA für Präzipitationen verwendet werden.

2. Formulierung von LNPs mit einem zweistrahligen CIJ-Mischer

  1. Vorbereitung und Reinigung der Ausrüstung
    1. Reinigen Sie CIJ-Mischer unmittelbar vor dem Gebrauch, indem Sie den Mischer mit Ethanol spülen. Füllen Sie zwei 5-ml-Spritzen mit Ethanol und verriegeln Sie sie jeweils in einer Einlassöffnung des CIJ. Drücken Sie die Spritzen schnell zusammen und sammeln Sie das Mischerabwasser als Abfall.
      HINWEIS: CIJ-Mischer können wie zuvor beschrieben konstruiert und betrieben werden29. Zur Aufnahme des CIJ-Mischers können verschiedene Stützständer verwendet werden, darunter ein Ringständer, ein Zentrifugenröhrchenhalter oder ein Erlenmeyerkolben. Die CIJ-Lieferanten sind in der Werkstofftabelle und der Zusatzdatei 1 aufgeführt.
    2. Entfernen Sie die Ethanolspülspritzen aus dem CIJ. Diese Spritzen können gelagert und für zusätzliche Ethanolspülungen des CIJ wiederverwendet werden.
    3. Trocknen Sie die internen Kanäle von CIJ, indem Sie einen trockenen Stickstoffstrom durch die Einlassadapter blasen. Verwenden Sie nur trockene, gefilterte Luft, die nicht mit Pumpenölnebel oder Aerosolen verunreinigt ist, wenn kein Stickstoff verfügbar ist.
  2. Vorbereitung von Lösemittel- und Antilösemittelströmen
    1. Mischen Sie die Lipidstammlösungen und verdünnen Sie sie mit zusätzlichem Ethanol, um 500 μl der in Tabelle 1 aufgeführten 6 mg/ml-Lipidlösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen herzustellen.
      HINWEIS: Diese Formulierung ist die häufig verwendete Onpattro-Zusammensetzung, die 50 Mol-% MC3, 10 Mol-% DSPC, 38,5 Mol-% Cholesterin und 1,5 Mol-% DMG-PEG2000 enthält.
    2. Verdünnen Sie das 100 mM pH-4-Acetat-Puffermaterial auf 10 mM in einem Gesamtvolumen von 4 mL als Abschreckbad für das CIJ-Mischerabschreckbad.
      HINWEIS: Dem Abschreckbad kann auch ein magnetischer Rührstab hinzugefügt werden.
    3. 500 μl der in Schritt 1.4 hergestellten RNA-Lösung werden in eine 1-ml-Spritze entnommen. Drehen Sie die Spritze um und stoßen Sie jegliche Luft aus diesem wässrigen Lösungsmittelstrom aus, der das Nukleinsäurepolymer enthält.
    4. 500 μl der in Schritt 2.2.1 hergestellten Lipidlösung werden in eine 1-ml-Spritze gegeben. Drehen Sie die Spritze um und stoßen Sie jegliche Luft aus diesem ethanolischen Lösungsmittelstrom aus, der Lipide enthält.
  3. LNP-Produktion in einem CIJ-Mischer
    1. Positionieren Sie den sauberen CIJ-Mischer über dem Abschreckbadfläschchen.
      HINWEIS: Eine Ringständerklemme oder ein Rohrgestell sind eine praktische Stütze für den CIJ-Mischer. In Abbildung 1A finden Sie ein typisches CIJ-Setup.
    2. Verbinden Sie die beiden in Schritt 2.2.3 und Schritt 2.2.4 eingefüllten Spritzen mit den Einlassöffnungen des CIJ-Mischers.
    3. Drücken Sie beide Spritzen schnell zusammen, um die Lösungsmittel- und Antilösungsmittelströme zu mischen und die Lipid-NPs im Quenchbad zu sammeln.
      HINWEIS: Die Spritzen müssen schnell (in weniger als 1 s), aber reibungslos und gleichmäßig vorgeschoben werden. Asymmetrische Strömung oder langsame Strömung führt zu polydispersen, großen LNPs.
    4. Entfernen Sie den CIJ-Mischer über dem Abschreckbad, während die Spritzen noch angebracht sind.
      HINWEIS: Entfernen Sie die Spritzen nicht und lassen Sie das Rückhaltevolumen nicht in das Abschreckbad fließen, da dieses Material schlecht gemischt ist und sich negativ auf die Produktionsdispergiereigenschaften auswirkt, wenn es in das Abschreckbad gemischt wird.
    5. Halten Sie das CIJ über einen Abfallbehälter und entfernen Sie die Spritzen, so dass das verbleibende Rückhaltevolumen in den Abfallbehälter fließen kann. Entsorgen Sie diese Spritzen und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
    6. Analysieren Sie LNPs, die mit dem CIJ erstellt wurden, wie in Abschnitt 5 unten beschrieben.

3. Formulierung von LNPs mit einem vierstrahligen MIVM-Mischer

  1. Montage eines MIVM-Mischers, der zur Unterscheidung als Micro-Size-MIVM (μMIVM) bezeichnet wird, um ihn von größeren Modellen zu unterscheiden, die für die Scale-up-Produktion verwendet werden
    1. Sammeln Sie alle Einzelkomponenten, die für den Zusammenbau eines MIVM-Mischers erforderlich sind: den unteren Empfänger, die Mischgeometriescheibe, die obere Scheibe, den O-Ring und den Schraubenschlüssel.
      HINWEIS: Die Konstruktion, Montage und der Betrieb von MIVM wurden zuvor für die Verkapselung hydrophober Spezies demonstriert, und die Lieferanten sind in der Zusatzdatei 1 und der Materialtabelle29 aufgeführt. In Abbildung 2 finden Sie ein Schema der Komponenten und der Terminologie des Mischständers.
    2. Setzen Sie den O-Ring in die Nut in der Mischscheibe ein.
    3. Richten Sie die Löcher der Mischscheibe an den Stiften auf der oberen Scheibe aus und schieben Sie sie zusammen, ohne den O-Ring zu lösen.
    4. Schrauben Sie die passende Mischscheibe, den O-Ring und die obere Scheibenbaugruppe locker in den unteren Behälter ein.
      HINWEIS: Entfernen Sie vor diesem Schritt den Auslassschlauch vom unteren Behälter.
    5. Ziehen Sie die obere Scheibe mit dem Schraubenschlüssel in den unteren Empfänger ein.
      HINWEIS: Eine Anti-Seize-Verbindung in Lebensmittel- oder Pharmaqualität kann auf die oberen Scheibengewinde aufgetragen werden, wenn ein Gewindefressen beobachtet wird.
    6. Führen Sie den Auslassschlauch in den unteren Empfänger ein und ziehen Sie ihn fest, um die MIVM abzuschließen.
    7. Montieren Sie die montierte MIVM so in den Mischständer, dass der Auslassschlauch durch die Stützplatte austritt.
      HINWEIS: Das Verfahren zum Einstellen des MIVM-Mischpults sollte regelmäßig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die mechanischen Anschläge am Mischpult korrekt konfiguriert sind29.
  2. Vorbereitung von Lösemittel- und Antilösemittelströmen
    1. Mischen Sie die beiden ethanolischen Lipidlösungsmittelstromlösungen in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, wie in Tabelle 2 angegeben, indem Sie die Lipidstammlösungen verdünnen und bei Bedarf zusätzliches Ethanol hinzufügen, um eine endgültige Lipidkonzentration von 6 mg/ml zu erreichen.
      HINWEIS: Dies ist die gleiche Zusammensetzung der Lipidlösung wie in 2.2.1, jedoch mit einem Gesamtvolumen von 1000 μl.
    2. Verdünnen Sie das 100 mM pH-4-Acetat-Puffermaterial auf 10 mM in einem Gesamtvolumen von 8 mL als MIVM-Ablaufabschreckbad.
      HINWEIS: Dem Abschreckbad kann auch ein magnetischer Rührstab hinzugefügt werden.
  3. Formulierung von LNPs mit einem MIVM-Mischer
    1. Platzieren Sie das 8-ml-Abschreckbad unter dem Mischpult, so dass der Abflussschlauch in das Abschreckbad entleert wird.
    2. Ziehen Sie die Lösungsmittel- und Lösungsmittelströme mit einer stumpfen Nadel in gasdichte 1-ml-Spritzen auf. Entfernen Sie alle Luftblasen und entsorgen Sie die Nadel. Entlüften Sie jede Spritze, indem Sie die Spritze umdrehen und jegliche Luft aus ihr ausstoßen.
    3. Montieren Sie die vier Spritzen im Uhrzeigersinn (Spritzen 1-4, Tabelle 2) mit den gleichen Strahlen auf den gegenüberliegenden Seiten. In Abbildung 1B finden Sie das Schema für das endgültige Erscheinungsbild.
    4. Halten Sie das Lagergehäuse auf beiden Seiten der beweglichen Platte. Vermeiden Sie es, die Finger auf die Unterseite des Gehäuses zu legen, da dies aufgrund der mechanischen Anschläge eine Einklemmgefahr darstellt. Senken Sie die bewegliche Platte vorsichtig ab, bis sie gleichmäßig auf den Spritzen aufliegt.
      HINWEIS: Die Kolben der Spritze müssen sich vor dem Betrieb alle auf gleicher Höhe befinden.
    5. Drücken Sie die Platte gleichmäßig und sanft nieder, mit dem Ziel, den Vorgang für diese Stromvolumina in etwa 0,5 s bis 1 s abzuschließen.
    6. Verschließen Sie das Abschreckbad, das die LNP-Dispersion enthält.
    7. Führen Sie die Reinigung der MIVM nach Gebrauch durch, indem Sie die Anweisungen in Schritt 3.5 unten befolgen.
  4. Formulierung von LNPs mit einem MIVM-Mischer, der von einer Spritzenpumpe angetrieben wird
    1. Assemblieren Sie die MIVM wie in Schritt 3.1 beschrieben.
    2. Bereiten Sie das Lösungsmittel und die Lösungsmittellösungen in der gewünschten Zusammensetzung und in einem ausreichenden Volumen für die erforderliche Formulierungsgröße vor (Tabelle 3).
      HINWEIS: Dies sind die gleichen Zusammensetzungen wie die wässrigen Lösungsmittelströme (Schritt 1.4) und das ethanolische Lösungsmittel (Schritt 3.2.1), wurden jedoch für die Verwendung mit den größeren Spritzenvolumina in Tabelle 3 hochskaliert.
    3. Laden Sie die Lösungen in gasdichte Spritzen mit 20 mL Volumen und befestigen Sie den PTFE-Schlauch mit einem am Ende angebrachten Luer-Adapter. Entlüften Sie die Spritzen und den Schlauch, indem Sie die Spritze und den Schlauch umdrehen und dann die Luft ausstoßen.
    4. Montieren Sie die Spritzen in eine Spritzenpumpe und befestigen Sie die Spritzen an den Mischereinlässen an der MIVM, wie in Abbildung 3A gezeigt.
      HINWEIS: Der CIJ kann auf die gleiche Weise auch über Pumpen betrieben werden, jedoch mit nur einer Lösemittel- und Lösungsmittelstrahlspritze.
    5. Verdünnen Sie das 100 mM pH 4 Acetat-Puffermaterial auf 10 mM in einem Gesamtvolumen von 320 mL als MIVM-Abschreckbad.
    6. Stellen Sie das Abschreckbad unter den MIVM-Auslass.
    7. Stellen Sie den Volumenstrom an der Spritzenpumpe auf 20 mL/min ein.
      HINWEIS: Die volumetrischen Durchflussraten können von 2 ml/min bis 40 ml/min variiert werden, indem die Werte an der Spritzenpumpe manuell so eingestellt werden, dass LNPs mit unterschiedlichen Mikromischbedingungen gebildet werden.
    8. Starten Sie die Spritzenpumpe, aber lassen Sie die ersten 10 s des Abwassers in ein Abfallbecherglas fließen. Sammeln Sie das MIVM-Abwasser nach dieser 10-s-Anlaufzeit im Abschreckbad.
    9. Entfernen Sie das Abschreckbad mit LNP-Dispersion, die bei der gewählten Volumenstromrate (20 mL/min) hergestellt wurde, und verschließen Sie es.
      HINWEIS: Dieses Verfahren kann wiederholt werden, um LNPs mit unterschiedlichen Durchflussraten zu synthetisieren, indem geeignete Quenchbadvolumina ausgewählt werden.
    10. Reinigen Sie die MIVM zwischen jedem Experiment (wenn Sie die Durchflussrate ändern), indem Sie mindestens das doppelte Volumen der Auslassschläuche ausspülen, um eine Ansammlung von LNPs zu verhindern, die unter der vorherigen Durchflussratenbedingung vor Beginn der nächsten LNP-Synthese durchgeführt wurde.
  5. Reinigung der Geräte nach dem Gebrauch
    1. Nehmen Sie den Mischer vom Ständer, während Sie die Spritzen befestigt halten, und halten Sie ihn über einen Abfallbehälter. Entfernen Sie die Spritzen und lassen Sie das Rückhaltevolumen in den Behälter ablaufen. Halten Sie dann die Mischerbaugruppe auf den Kopf und zerlegen Sie den Mischer mit dem Schraubenschlüssel.
    2. Spülen Sie den Auslassschlauch mit Lösungsmittel (z. B. Ethanol) ab und trocknen Sie ihn mit Luft oder Stickstoff.
    3. Spülen Sie die Mischgeometrie mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. entionisiertem Wasser oder Ethanol, und spülen Sie anschließend mit Ethanol. Trocknen Sie die Komponenten mit einem Luft- oder Stickstoffstrom.
    4. Spülen Sie den O-Ring mit entionisiertem Wasser ab und tupfen Sie ihn trocken.
      HINWEIS: Wenn der O-Ring gedehnt oder verformt aussieht, lassen Sie ihn über Nacht an der Luft trocknen, bevor Sie ihn verwenden. Halten Sie einen großen Vorrat an O-Ringen bereit, da es sich um Verschleißteile handelt. Wenn sich die Form bis zum nächsten Tag nicht erholt, entsorgen Sie den O-Ring.
    5. Spülen Sie die obere Scheibe gründlich mit Lösungsmittel ab und trocknen Sie die Oberfläche und die Spritzenanschlüsse mit einem Luft- oder Stickstoffstrahl.
    6. Spülen Sie jede Spritze mit einem guten Lösungsmittel (z. B. entionisiertes Wasser oder Ethanol) aus. Vor dem nächsten Gebrauch eine abschließende Spülung mit Ethanol auftragen und an der Luft trocknen.

4. Nachbearbeitung von LNPs

  1. Pufferaustausch und Ethanolentfernung
    1. Dialysieren Sie die LNP-Dispersion gegen einen 10 mM HEPES-Puffer bei pH 7,4 unter Verwendung einer Dialysekassette geeigneter Größe mit einer Dialysekartusche mit einem Molekulargewichtscutoff-Gehalt von 20 kDa.
      HINWEIS: Dieser Schritt entfernt sowohl das restliche 10%ige Ethanol als auch den pH-Wert der Dispersion, indem der Acetatpuffer durch HEPES ersetzt wird.
    2. Der Vorrat mit 1 M HEPES-Puffer wird auf 10 mM in einem Gesamtvolumen von 1 l verdünnt.
    3. Laden Sie die LNP-Dispersion mit einer Spritze und einer Nadel in eine 12-ml-Dialysekassette.
    4. Tauchen Sie die Dialysepatrone in den 1 l HEPES-Puffer und rühren Sie den externen Puffer magnetisch um. Wechseln Sie den externen HEPES-Puffer nach 3 h und entfernen Sie die Dialysepatrone nach weiteren 3 h für eine Gesamtdialysezeit von 6 h.
    5. Ziehen Sie die dialysierte LNP-Dispersion aus der Dialysekassette und entsorgen Sie die verbrauchte Patrone.
  2. LNP-Suspensionskonzentration durch Ultrazentrifugation
    1. Pipettieren Sie die Suspension in einen Zentrifugalfilter geeigneter Größe mit einem MWCO von 100 kDa30.
      HINWEIS: Zentrifugalfilter sind in einer Reihe von Größen erhältlich, in der Regel von 0,5 ml bis 12 ml.
    2. Die Dispersion wird bei 2000 x g für 10-20 min (bei Raumtemperatur) zentrifugiert, um die Konzentration um den Faktor ca. 5-20x zu erhöhen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie während der Zentrifugation alle 5 Minuten die Probe, um sicherzustellen, dass eine angemessene Menge Flüssigkeit übrig bleibt.

5. Charakterisierung von LNPs

  1. Hydrodynamische Durchmessermessungen mit dynamischer Lichtstreuung (DLS)
    1. 750 μl bzw. 900 μl der vorbereiteten LNP-Dispersion (ohne Verdünnungen) in eine Mikro- bzw. Quadratküvette aus Kunststoff abgeben.
      HINWEIS: Kleinere Volumina können auch in geeigneten Küvetten verwendet werden.
    2. Stellen Sie die geeignete Viskosität für das Lösungsmittel ein, in dem die LNPs dispergiert sind (d. h. 1,26 cP für ein Gemisch mit 10 Vol.-%).
    3. Sammeln Sie zurückgestreutes Licht in einem Winkel von 173° bei 25 °C, gefolgt von der Größenbestimmung von LNP unter Verwendung des Stokes-Einstein-Modells und der ersten Kumulante der Reihenerweiterung der Lichtstreuungskorrelationsfunktion, wie sie im ISO-Normdokument 13321:1996 E definiert ist.
    4. Wiederholen Sie die Messungen mindestens dreimal.
  2. Messung des Zetapotenzials
    1. Geben Sie ~800 μl LNP-Dispersion in gefaltete kapillare Zetasizer-Zellen.
      HINWEIS: Um Blaseneinschlüsse im Kapillarkanal zu vermeiden, wird die Hälfte der Flüssigkeit in die Zellen abgegeben, auf den Kopf gestellt und dann gedreht.
    2. Wiederholen Sie die Messungen mindestens dreimal.
      HINWEIS: Die Leitfähigkeit des Puffers sollte zwischen 0,2 und 2 MilliSiemens / cm liegen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  3. Messungen der Verkapselungseffizienz (EE) mit einem kommerziell erhältlichen RNA-Quantifizierungskit
    1. Verdünnen Sie die entsprechende Menge des im Assay-Kit bereitgestellten 20x Tris-EDTA (TE)-Puffers bei pH 7,5 auf eine 1-fache Konzentration mit nukleasefreiem Wasser.
    2. Bereiten Sie eine Triton X-100-Lösung mit 2 Gew.-% vor
    3. Verdünnen Sie die entsprechende Menge an LNP-Dispersionen im 1x TE-Puffer, um eine Gesamtmassenkonzentration von ca. 0,6 μg/ml für RNA und einen Ethanolgehalt unter 0,2 Vol.-% zu erhalten.
    4. Bereiten Sie ähnliche Proben wie im vorherigen Schritt vor, die jedoch 0,5 Gew.-% Triton X-100 enthalten, das die LNPs effektiv auflöst und die Unterscheidung zwischen "freien" und Gesamt-RNA-Konzentrationen in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Triton X-100 erleichtert.
    5. Bereiten Sie geeignete Mengen an Kontroll-RNA-Lösungen in Konzentrationen von 0 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,4 μg/ml, 0,6 μg/ml, 0,8 μg/ml und 1,0 μg/ml im 1x TE-Puffer vor.
      HINWEIS: Möglicherweise muss das RNA-Kit zunächst verdünnt werden.
    6. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, jedoch mit 0,5 Gew.-% Triton X-100.
    7. Verdünnen Sie den Ribogreen-Farbstoff (im Kit enthalten) 200 Mal im 1x TE-Puffer.
    8. Geben Sie geeignete Mengen des verdünnten Ribogreen-Farbstoffs zu allen vorbereiteten Kontroll-RNA und Probenlösungen, unabhängig davon, ob sie mit oder ohne Triton X-100 verwendet werden. Der Farbstoff sollte gleichmäßig mit dem Faktor zwei sowohl über die Kontroll-RNA als auch über die Probenlösungen verdünnt werden. Folglich beträgt die Gesamtverdünnung des Farbstoffs das 400-fache seiner ursprünglichen Konzentration im Assay-Kit.
    9. Mischen Sie die Behälter mit einem Vortex.
    10. Bereiten Sie eine unbehandelte, undurchsichtige Platte mit 96 Bohrlöchern und flachem Boden für die Analyse in einem Plattenlesegerät vor.
    11. Dispensieren Sie 100 μl Volumina von Proben und RNA-Kontrollen in separate Zellen der Platte.
      HINWEIS: Achten Sie auf Blasenbildung in Lösungen, die Triton X-100 enthalten. Für jede Probe werden mindestens drei Replikate durchgeführt, für die mindestens 350 μl Proben erforderlich sind.
    12. Erfassen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Platten-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 528 nm mit einer Beleuchtungsdauer von ca. 10 s pro Messwert. Es ist kein Schütteln erforderlich.
      HINWEIS: Der EE wird bestimmt von figure-protocol-20270, wobei Imit Triton und Iohne Triton die gemittelte Fluoreszenzintensität von drei Replikaten von Proben mit bzw. ohne Triton X-100 darstellen und amit Triton und aohne Triton die Steigung der linearen Anpassungen an die beiden gemittelten Kalibrierkurven mit und ohne Triton X-100 bzw.31 bezeichnen.

Repräsentative Ergebnisse

Das Screening optimaler LNP-Formulierungen kann mit relativ kleinen Materialmengen unter Verwendung von turbulenten Zweistrommischern CIJ schnell erreicht werden, vorausgesetzt, sie werden mit entsprechenden Geschwindigkeiten betrieben. Ein μMIVM-Mischer, der von einer programmierbaren Spritzenpumpe angetrieben wird, wie in Abbildung 3A dargestellt, wird verwendet, um die Bedeutung einer ausreichenden Mikromischung oberhalb einer kritischen Reynolds-Zahl zu verdeutlichen, um kleine, monodisperse LNPs zu bilden. Tabelle 3 enthält eine Zusammenfassung der Formulierungen, die zur Herstellung von LNPs verwendet werden, und der Mischeraufbau folgt dem in Schritt 3.4 beschriebenen Protokoll. Die LNP-Größen wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) in Abhängigkeit von der Reynoldszahl charakterisiert. Wie in Abbildung 3B gezeigt, werden ab einem kritischen Re von 5000 kleine und monodisperse LNPs beobachtet. Darüber hinaus können hohe Reynolds-Zahlen (~10 4-105) erreicht werden, wenn die Spritzen gleichmäßig durch Handbedienung oder durch Verwendung des Mischstandes gedrückt werden (Datenpunkt ganz rechts in Abbildung 3B). Der Mischstand, der in Figur 2A dargestellt ist, drückt gleichmäßig alle Spritzen gleichzeitigzusammen 27. Dadurch haben solche LNPs auch optimale Größen. Bei unzureichender Durchmischung (d. h. bei zu kleinem Re) werden größere LNPs gebildet. Fotos, die für LNPs repräsentativ sind, die bei niedrigem (Foto 1) und hohem Re (Foto 2) gebildet wurden, sind in Abbildung 3B dargestellt. Proben, die bei niedrigem Re entnommen wurden, sind trüb, was auf das Vorhandensein großer kolloidaler Lichtstreustrukturen hinweist (Tyndall-Effekt), aber LNPs, die bei hohem Re gebildet wurden, erscheinen aufgrund der schwächeren, blauverschobenen Streuung von kleineren Kolloiden klar.

Ionisierbare Lipide haben unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften von LNPs beeinflussen, die mit ansonsten identischen Lipidformulierungen hergestellt werden. Um dies zu testen, wird ein CIJ-Mischer (Abbildung 1A) verwendet. Tabelle 4 listet die Formulierungen auf, die unter Verwendung von zwei von der FDA zugelassenen ionisierbaren Lipiden hergestellt wurden: ALC-0315 und MC3. Abbildung 4A zeigt, dass die LNPs, die bei pH 5 aus ALC-0315 hergestellt wurden, ~80 nm groß sind, während LNPs, die mit MC3 hergestellt wurden, ~60 nm groß sind. Darüber hinaus haben MC3-LNPs bei pH 5 ein positives Zetapotenzial (~28 mV), während die ALC-LNPs ein neutrales Zetapotenzial (<10 mV) haben. Diese Unterscheidung in der Oberflächenladung sowie der Gesamtgröße von LNPs ergibt sich aus dem pKa der beiden Lipide. MC3 hat einen höheren pKa (6,44) im Vergleich zu ALC0315 (6,09)32; daher ist ein höherer Anteil an MC3-Lipiden bei pH 5 geladen. Beide Formulierungen haben einen 1,5 mol% PEG-Lipid-Stabilisator; Die MC3-LNPs stabilisieren sich jedoch aufgrund größerer elektrostatischer Abstoßungen während der LNP-Assemblierung während der diffusionsbegrenzten Aggregation, was das Wachstum bei der kleineren Größe stoppt. Beide Formulierungen weisen eine hohe Verkapselungseffizienz (>90 %) auf, wie in Abbildung 4B dargestellt. Die Chemie der Lipide ist entscheidend für die Bestimmung der Gesamteigenschaften sowie der Leistung der LNPs, und daher müssen sie sorgfältig auf der Grundlage der Zielanwendung ausgewählt werden.

LNPs, die unter Verwendung beider turbulenter Mischergeometrien (Schritt 2.3 und Schritt 3.3) hergestellt werden, haben ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften. Dieser Vergleich wird auf LNPs ausgeweitet, die mit schlechten Mischtechniken hergestellt wurden, wie z. B. dem Mischen von Bulk-Pipetten, um die Unterscheidung zwischen turbulenten Mischern und ungleichmäßigen Mischtechniken weiter zu veranschaulichen (Abbildung 1C). Tabelle 5 enthält eine Zusammenfassung der Formulierungen, die zur Herstellung von LNPs verwendet werden, wie in Abbildung 5 dargestellt. Bei der Pipettenmischtechnik werden gleiche Volumina von Ethanol und wässrigen Strömen schnell gemischt, indem 15-20 s lang auf und ab pipettiert wird, gefolgt von einem Pipettieren der Mischung in ein Acetat-Pufferbad bei pH 4. Abbildung 5A zeigt, dass die Größen der LNPs im Quench-10-mM-Acetat-Pufferbad (pH 4, 10 Vol.-% Ethanol) unabhängig von der verwendeten Mischergeometrie (CIJ oder MIVM) auffallend ähnlich und klein (~50 nm) sind. LNPs, die durch Pipettenmischung hergestellt werden, sind jedoch doppelt so groß wie LNPs, die mit turbulenten Mischern hergestellt werden. Dies zeigt, dass die LNPs aus unterschiedlichen CIJ-Geometrien ähnliche Eigenschaften aufweisen, wenn sie bei ausreichend hohen Geschwindigkeiten (turbulenter Bereich oberhalb der kritischen Reynolds-Zahl) hergestellt werden, während eine schlechte Durchmischung zu größeren, polydispersen LNPs führt.

Als nächstes werden die LNPs gegen einen 10 mM HEPES-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 (100-faches Volumen) dialysiert, um Ethanol zu entfernen und den pH-Wert auf 7,4 umzuschalten. Während dieses Prozesses kommt es zu einer gewissen LNP-Fusion und einem Wachstum zu einer etwas größeren Größe, wie in Abbildung 5A gezeigt, was mit dem in der Literatur gut untersuchten Fusionsmechanismus übereinstimmt33. Insgesamt sind die LNPs, die mit CIJ- und MIVM-Mischern hergestellt werden, kleiner als 100 nm, während die LNPs, die mit Pipettenmischung hergestellt werden, etwa 140 nm groß sind. Wie in Abbildung 5B gezeigt, liegen die Zetapotentiale für diese Formulierungen bei weniger als 10 mV, was darauf hindeutet, dass sie alle bei einem pH-Wert von 7,4 neutral sind. Darüber hinaus weisen sie alle einen hohen Verkapselungswirkungsgrad von >95 % auf (Abbildung 5C). So können LNPs mit optimalen physikalisch-chemischen Eigenschaften einfach mit Hilfe von turbulenten Mischtechnologien hergestellt werden. Die Leistung dieser LNPs wird durch die Durchführung einer in vitro Transfektion in HeLa-Zellen bewertet.

Das Luciferase-basierte In-vitro-Transfektionsassay-Protokoll wurde aus einer früheren Veröffentlichungübernommen 34. Abbildung 6A zeigt die Lumineszenz (RLU) pro 1000 Zellen für die drei in Tabelle 5 zusammengefassten Formulierungen. Lipofectamine 3000 wird als Positivkontrolle verwendet. Es ist wichtig zu beachten, dass Lipofectamine 3000 im Allgemeinen für DNA-Formulierungen verwendet wird; In diesen Experimenten funktionierte es jedoch als adäquate Kontrolle. LNPs, die mit 2-Strahl-CIJ- und 4-Strahl-MIVM-Mischern hergestellt werden, transfizieren viel besser als LNPs, die mit Pipettenmischung hergestellt werden. Obwohl davon ausgegangen wird, dass die größeren Partikel aufgrund der höheren Nutzlast pro LNP besser transfizieren als die kleinen Partikel, transfizieren die LNPs, die hier durch Pipettenmischung hergestellt werden, weniger effektiv. Dies impliziert eindeutig, dass es einen signifikanten Unterschied in den Strukturen von LNPs gibt, die mit CIJ-Technologien hergestellt werden, im Vergleich zu LNPs, die mit Pipettenmischung hergestellt werden. Die Transfektionswirkungsgrade von LNPs, die mit CIJ- und MIVM-Mischern hergestellt werden, sind im Wesentlichen identisch. Lipofectamine 3000 zeigt die geringste Transfektionseffizienz. Abbildung 6B bewertet die LNP-Toxizität in vitro an HeLa-Zellen unter Verwendung eines Zellviabilitätsassays auf der Basis von Natriumresazurinsalz35. Alle Formulierungen weisen eine geringe Zytotoxizität auf, die sich in einer hohen Zellviabilität zeigt, wenn sie als Prozentsatz der lebenden Zellen im Vergleich zur Kontrolle ohne Nanopartikelbehandlung aufgetragen werden.

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Abbildung 1: Mischverfahren zur Herstellung von LNPs. (A) Der zweistrahlige Confined Impinging Jet Mixer (CIJ) zeigt ein Foto eines transparenten Mischers und eines zusammengebauten Delrin-Mischaufbaus, der regelmäßig im Labor verwendet wird. (B) Der Vier-Jet-Mikro-Mehrfacheinlass-Vortex-Mischer (μMIVM) zeigt ein Foto eines transparenten Mischers und eines zusammengebauten Mischer-Setups aus Edelstahl und Delrin. Die Einlaufströme für den transparenten Mischer wurden zur besseren Visualisierung der Mischgeometrie an die Seiten des Mischers verlegt, während beim praktischen Mischer die Einlaufströme von oben eintreten. Sowohl das CIJ als auch das μMIVM arbeiten mit einer ausreichenden Flüssigkeitsgeschwindigkeit, so dass sich die Strömungen im turbulenten Bereich befinden, und das Mischen erzeugt Kolmogorov-Mikroskalen kleiner als 1 μm, was das Erreichen einer Übersättigung in ~1,5 ms ermöglicht. (C) Der Pipettenmischaufbau wird häufig zur Herstellung kleiner Volumina von LNP-Dispersionen durch Mischen von wässrigen und ethanolischen Lösungen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Erweiterte Ansicht der μMIVM und ihres Mischstandes. (A) Zusammengebautes μMIVM mit Glasspritzen unter dem Mischständer, das ein gleichmäßiges und schnelles Absenken der Spritzen ermöglicht. Diese Abbildung ist von Markwalter et al.29 übernommen. (B) Zerlegte μMIVM mit den Innenkomponenten. Diese Mischgeometrie ist identisch mit dem transparenten Mischer in Abbildung 1B, mit der Ausnahme, dass die Einlassströme durch die obere Scheibe und nicht durch die seitliche zylindrische Fläche eintreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Eine Erhöhung der Reynoldszahl in einem turbulenten Mischer verringert den hydrodynamischen LNP-Durchmesser bis zu einer plateaukritischen Reynoldszahl. (A) Schematische Darstellung der Spritzenpumpe und des μMIVM-Aufbaus, der zur Steuerung der Reynoldszahl im turbulenten Mischer durch Einstellen der Volumenströme verwendet wird. (B) LNP hydrodynamischer Durchmesser in Abhängigkeit von der Reynolds-Zahl in der MIVM. Die Erhöhung der Reynoldszahl und der turbulenten Energiedissipation verbessert die Durchmischung und führt zu einer homogeneren Durchmischung, Übersättigung und einem Wachstum der Partikel. Oberhalb der kritischen Reynolds-Zahl bleiben die LNP-Größen mit zunehmenden Durchflussraten aufgrund der Da<<1-Bedingung konstant, d. h. die Lösungsmittel-/Lösungsmitteldiffusionszeit ist kürzer als die NP-Assemblierungszeit. Die angegebenen Durchflussmengen sind die Gesamtdurchflussraten aller vier Ströme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Kolloidale Eigenschaften von LNPs, die mit unterschiedlichen ionisierbaren Lipiden hergestellt wurden. (A) Hydrodynamische Durchmesser und Zetapotentiale von LNPs, die mit zwei verschiedenen ionisierbaren Lipiden hergestellt werden: ALC-0315 und MC3. Die Messungen erfolgen bei pH 5 im Abschreckbad nach der LNP-Bildung. Unterschiede im scheinbaren pKa der ionisierbaren Lipide beeinflussen die kolloidalen Eigenschaften der LNPs. (B) Messungen der Verkapselungseffizienz beider LNPs (n = 3, Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Kolloidale Eigenschaften von LNPs, die mit verschiedenen Mischern hergestellt werden, die Luciferase-mRNA mit ionisierbarem MC3-Lipid verkapseln. (A) Hydrodynamische Durchmesser von LNPs, die mit 2-Strahl-, 4-Strahl- und Pipettenmischern hergestellt werden. Die Messungen werden sowohl unter den sauren Bedingungen des Abschreckbades nach LNP-Bildung (linke Seite) als auch nach der Dialyse in einen neutralen HEPES-Puffer (rechte Seite) durchgeführt. Die LNP-Größe wächst während der pH-Neutralisation aufgrund der Deionisierung des ionisierbaren Lipids, was zu LNP-Fusion und -Wachstum führt. Der Lipid-PEG-Stabilisator stoppt dieses Partikelkoaleszenzwachstum, bevor die Bildung von mikrometergroßen Präzipitationen ausfällt. (B) Messungen der Oberflächenladung (als ζ-Potential) an dialysierten LNPs im 10 mM HEPES, pH 7,4. Alle LNPs liegen innerhalb von 2 mV von 0 mV, was darauf hindeutet, dass diese Partikeloberflächen neutral sind und nur eine nahezu nicht nachweisbare Menge an kationischer Ladung aufweisen. (C) Messungen der Verkapselungseffizienz nach der Dialyse von LNPs (n = 3, Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Transfektion von HeLa-Zellen mit präparierten LNPs. (A) Lumineszenz des exprimierten Luciferase-Enzyms nach Behandlung mit Luciferin. (B) Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen nach Inkubation mit LNPs. Die Zellen zeigen keine statistisch signifikante Veränderung der Lebensfähigkeit, wie ein Resazurin-Stoffwechselassay zeigt (n = 4, Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Bach(e) /
Abschreckbad		BestandteilFormulierungLagerVolumen
Spritze 1 -
Ethanol-Strom
(6 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3)50 mol%50 mg/ml0,5 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 2 -
Wässriger Strom
(0,3 mg/ml RNA)		Hefe-RNAN/P 610 mg/ml0,5 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 4100 mM, pH 4
AbschreckbadAcetat-Puffer10 mM, pH 4100 mM, pH 44 mL

Tabelle 1: Standard-Patisiran LNP-Formulierung, hergestellt von einem CIJ-Mischer. Hefe-RNA wird als Modell-RNA für dieses Protokoll verwendet. Alle Lösungen werden molekular aufgelöst und gründlich gemischt, bevor sie in die Spritzen geladen werden.

Bach(e) /
Abschreckbad		BestandteilFormulierungLagerVolumen
Spritze 1 -
Ethanol-Strom
(6 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3)50 mol%50 mg/ml0,5 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 2 -
Wässriger Strom
(0,3 mg/ml RNA)		Hefe-RNAN/P 610 mg/ml0,5 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Spritze 3 -
Ethanol-Strom
(6 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3)50 mol%50 mg/ml0,5 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 4 -
Wässriger Strom
(0,3 mg/ml RNA)		Hefe-RNAN/P 610 mg/ml0,5 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 4100 mM, pH 4
AbschreckbadAcetat-Puffer10 mM, pH 4100 mM, pH 48 mL

Tabelle 2: Standard-Patisiran LNP-Formulierung, hergestellt von einem MIVM-Mischer. Ein MIVM-Mischer verwendet vier Ströme - zwei Lösungsmittel und zwei Lösungsmittel. Bäche mit ungleichem Impuls können verwendet werden; Für dieses Protokoll werden jedoch Streams mit gleichen Impulsen ausgewählt.

Bach(e) /
Abschreckbad		BestandteilFormulierungLagerVolumen
Spritze 1 -
Ethanol-Strom
(6 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3)50 mol%50 mg/ml20 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 2 -
Wässriger Strom
(0,3 mg/ml RNA)		Hefe-RNAN/P 610 mg/ml20 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Spritze 3 -
Ethanol-Strom
(6 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3)50 mol%50 mg/ml20 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 4 -
Wässriger Strom
(0,3 mg/ml RNA)		Hefe-RNAN/P 610 mg/ml20 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 4100 mM, pH 4
Abschreckbad
(Abholzeit
= 30 s)		HEPES-Puffer10 mM, pH 7,51 m, pH 7,5320 mL

Tabelle 3: LNP-Formulierung, die von einem MIVM-Mischer hergestellt wird, der von einer Spritzenpumpe angetrieben wird. DODMA wird als ionisierbares Lipid zusammen mit Hefe-RNA als Modell-RNA verwendet. Für dieses Protokoll wird ein Beispiellauf mit 40 mL/min gewählt.

Bach(e) /
Abschreckbad		BestandteilFormulierungLagerVolumen
Spritze 1 -
Ethanol-Strom
(12 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3 oder ALC0315)50 mol%50 mg/ml0,5 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 2 -
Wässriger Strom
(0,6 mg/ml RNA)		Hefe-RNAN/P 610 mg/ml0,5 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 5100 mM, pH 5
AbschreckbadAcetat-Puffer10 mM, pH 5100 mM, pH 59 mL

Tabelle 4: LNP-Formulierungen aus zwei verschiedenen ionisierbaren Lipiden, die von einem CIJ-Mischer hergestellt wurden. Die Formulierungen werden entweder aus ALC-0315 oder MC3 hergestellt, während alle anderen Komponenten gleich bleiben.

Bach(e) /
Abschreckbad		BestandteilFormulierungLagerVolumen
Spritze 1 -
Ethanol-Strom
(6 mg/ml Gesamtlipid)		Ionisierbares Lipid (MC3)50 mol%50 mg/ml0,5 mL
Zwitterion-Lipid (DSPC)10 mol%5 mg/ml
Cholesterin38,5 mol%5 mg/ml
Pegyliertes Lipid (DMG-PEG2000)1,5 mol%4 mg/ml
Spritze 2 -
Wässriger Strom
(0,3 mg/ml RNA)		FLuc-mRNAN/P 61 mg/ml0,5 mL
Acetat-Puffer20 mM, pH 4100 mM, pH 4
AbschreckbadAcetat-Puffer10 mM, pH 4100 mM, pH 44 mL

Tabelle 5: Standard-Patisiran LNP-Formulierung, hergestellt von einem CIJ-Mischer. FLuc-mRNA, die ein Luciferase-Protein exprimiert, wird verwendet, um die Genexpression mit Hilfe eines Biolumineszenz-Assays zu messen.

Ergänzende Datei 1: Lieferanten von CIJ- und MIVM-Mischern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Synthese von LNPs, die Nukleinsäurepolymere enthalten, unter Verwendung von zwei geschlossenen turbulenten Aufprallstrahlmischern wurde vorgestellt. Wenn sie bei geeigneten Geschwindigkeiten durchgeführt werden, stellen turbulente CIJ-Mischer sicher, dass die Zeitskala des Mischens kürzer ist als die LNP-Assemblierungszeit, wodurch homogene Übersättigungsbedingungen für die Bildung kleiner LNPs mit engen Größenverteilungen erzeugtwerden 21. Folglich weisen LNPs, die mit der gleichen Chemie unter Verwendung unterschiedlicher turbulenter Mischergeometrien (dem 2-Strahl-CIJ und dem 4-Strahl-MIVM-Mischer) hergestellt werden, ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften auf und weisen eine gute Transfektionseffizienz auf (Abbildung 5 und Abbildung 6). Im Gegensatz dazu führen LNPs, die durch Pipettieren hergestellt werden, zu schlechteren Mischergebnissen bei größeren und polydisperseren LNPs (Abbildung 5A) mit geringerer Transfektionseffizienz. Es ist seit langem bekannt, dass die Misch- und Montagekinetik bei der LNP-Verarbeitung eine wichtige Rolle spielt. Cullis et al. stellten fest, dass schnelles konvektiv-diffusives Mischen von Ethanol und Puffer zur Bildung kleiner Partikel mit einer engen Größenverteilung führt, während langsames diffusives Mischen zu größeren Partikeln mit breiten Größenverteilungen führt9. Die Zeitskala des Mischens in turbulenten CIJ-Mischern nimmt proportional zu den Einlassströmungen der Ströme zum Mischer27 ab. Dies wird durch die dimensionslose Reynoldszahl (Re) quantifiziert, die das Verhältnis zwischen den Trägheitskräften und den viskosen Kräften misst. Die Turbulenzen in den Mischkammern des CIJ und MIVM treten bei ausreichend hohem Re auf, so dass die turbulente Wirbeldehnung zu kleinen Längenskalen führt, die durch Diffusion eine schnelle Vermischung von Lösungsmittel und Lösungsmittel erzeugen. Die turbulente Längenskala hängt vom Re ab und nicht von der spezifischen Geometrie der Mischvorrichtung. Aus diesem Grund erzeugt entweder der CIJ oder der MIVM die gleichen LNP-Partikel und warum MIVM-Mischer in verschiedenen Größen die gleichen NP-Größen erzeugen27. Bei hohen Re-Geschwindigkeiten, die mit hohen Einlassgeschwindigkeiten einhergehen, können LNPs reproduzierbar hergestellt werden, ohne dass es zu Schwankungen von Charge zu Charge kommt (Abbildung 3B).

Dieses Protokoll ermöglicht die Formulierung einer Vielzahl von mRNA-, DNA- oder siRNA-LNPs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften unter Verwendung von turbulenten CIJ-Mischern. Diese Technik ermöglicht nicht nur eine Vielseitigkeit in Bezug auf Zusammensetzung und Konzentrationen, sondern bietet auch einen klaren Weg zum schnellen Screening von Formulierungen im Laborverkauf (wenige Milligramm) und zur Skalierung der Bleiformulierungen auf größere industrielle Chargengrößen mit Produktionsraten von 5 l/min36. Dies war eine große Hürde für mehrere andere Techniken, darunter Bulk-Mixing und Mikrofluidik. So gelingt es beispielsweise bei der Massenverarbeitung nicht, LNPs selbst im Maßstab von wenigen Millilitern konsistent reproduzierbar herzustellen. Mikrofluidische Techniken bieten eine erhebliche Verbesserung gegenüber Bulk-Mischtechniken, um die Herstellung einheitlicher und reproduzierbarer LNPs zu ermöglichen. Sie liegen jedoch nur im Milligramm-Bereich29. Wie in der Einleitung beschrieben, bietet die Parallelisierung von mikrofluidischen Geräten einen Versuch der Skalierung auf den Produktionsmaßstab, beseitigt jedoch nicht das Problem der Verschmutzung, und sie kann nicht so erfolgreich skaliert werden wie Mischer, die auf der Technologie des begrenzten Aufprallstrahls basieren.

Abgesehen von diesen Vorteilen werden CIJ-Mischer eine wichtige Rolle bei der Herstellung von LNPs der nächsten Generation spielen, die Targeting-Fähigkeiten aufweisen oder Gen-Editing durchführen. Die aktuellen LNP-Formulierungen enthalten Lipide und Nukleinsäuren, die ähnliche Diffusivitäten aufweisen, und können daher auch bei leicht schlechter Mischung im Labormaßstab hergestellt werden. Gen-Editing-Ansätze können jedoch die Verkapselung von Nukleinsäurespezies mit sehr unterschiedlichen Molekulargewichten, wie z. B. kleinen Leit-RNA-Molekülen und großen mRNA-Transkripten, erfordern, um ein CAS9-Protein zu kodieren37. Die sehr unterschiedlichen Diffusionszeitskalen dieser verschiedenen Spezies machen eine einheitliche Verkapselung bei stöchiometrischen Verhältnissen schwierig. Dieses Problem der gleichmäßigen Verkapselung wird mit zunehmender Schlechtigkeit der Mischeffizienz immer deutlicher. Ebenso könnte die Ausrichtung auf nicht-hepatische Zellen den Einbau von stark gebundenen, langsam diffundierenden Stabilisatoren erfordern (wie z. B. Blockcopolymere mit großem Molekulargewicht und Zielliganden). Liganden mit einer Größe von bis zu 14 kDa können konjugiert werden, um Copolymere vor dem Zusammenbau der Nanopartikel zu blockieren, was ihren gleichmäßigen Einbau in NPs unter Verwendung von CIJ-Mischenermöglicht 38. Die turbulenten CIJ-Mischer sind nützliche Werkzeuge für die Herstellung von LNPs, die aus Komponenten mit unterschiedlichen Diffusivitäten hergestellt werden.

Obwohl turbulente CIJ-Mischer mehrere Vorteile gegenüber anderen Mischern für die Formulierung von LNPs aufweisen, ist es wichtig, die mit den einzelnen Geometrien verbundenen Einschränkungen zu beachten. Der 2-Strahl-CIJ-Mischer erfordert, dass beide Einlassströme (Ethanol und Wasser) gleiche Impulse (innerhalb von 10 % bis 30 %) haben, um eine gleichmäßige turbulente Mikromischung in der Kammer zu erreichen. Die Tatsache, dass der Austrittsstrom 50:50 Lösungsmittel/Antisolvent umfasst, begrenzt den Grad der Übersättigung in dem Mischhohlraum, in dem die Fällung auftritt29. Dieser Nachteil wird durch den 4-Jet MIVM-Mischer behoben, da er vier Düsen mit ungleichem Impuls nutzen kann, um hohe Übersättigungsbedingungen in der Mischkammer zu erreichen. Darüber hinaus müssen beide Mischer in der Größenordnung von Milligramm Gesamtmasse liegen, was sie zu einer nicht idealen Wahl für das Hochdurchsatz-Screening vieler verschiedener LNP-Formulierungen macht. Bei einfachen LNP-Formulierungen kann das Screening am besten mit Mikrofluidik oder Pipettierstrategien im Mikrogrammmaßstab durchgeführt und dann auf die Technologie des begrenzten Aufpralljets übertragen werden, wenn einige Elektrodenformulierungen identifiziert wurden. Entscheidend ist auch die Berücksichtigung der Totvolumina in den Mischern. Im CIJ, zwei Strahlmischern, liegen die Rückhaltevolumina bei 50-100 Mikrolitern. Diese Materialmenge muss bei der Berechnung der Rückgewinnung aus dem Prozess von der im Abschreckbad erfassten Menge abgezogen werden. Diese Verluste sind beim Betrieb in großem Maßstab unbedeutend, würden aber 10 % Verluste ausmachen, wenn Gesamtvolumina von 5 ml erzeugt werden, wie hier gezeigt. Die turbulenten Aufprallstrahlmischer sind ein wertvolles Werkzeug für die Herstellung von LNPs im GMP-Maßstab, wie die beiden von der FDA zugelassenen COVID-19-Impfstoffe zeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

NSF Fellowship an die BKW (DGA1148900), Unterstützung durch Tessera Therapeutics Inc., die Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF, Vertragsnummern OPP1150755 und INV-041182) und die FDA unter der Auszeichnung 75F40122C00186.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
18:0 PC (DSPC)Avanti Polar Lipids850365PHelper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide NeedleBD305167
96 Well Black Wall Black Bottom PlateFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC SurfaceThermo Fisher Scientific165306
Acetic Acid, GlacialFisher ScientificA38-212
ALC-0315Avanti Polar Lipids890900Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mLMillipore SigmaUFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mLMillipore SigmaUFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2620
CholesterolMillipore SigmaC8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)Trilink BiotechnologiesL-7202
Confined Impinging Jets MixerHolland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)N/AContact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA MedChemExpressHY-112251 Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific11995065
DMG-PEG 2000Avanti Polar Lipids880151PPEG-lipid
DODMAAvanti Polar Lipids890899PIonizable lipid
Ethanol 200 ProofDecon Labs, Inc.2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United StatesThermo Fisher Scientific16000044
HeLaATCCCCL-2
HEPES, free acidIBI ScientificIB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL LuerHenke Sass Wolf4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer LockHenke Sass Wolf4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing figure-materials-3228” OD 0.093” IDIdex Health & Science1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fittingIdex Health & ScienceP-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubingIdex Health & ScienceP-940
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo Fisher ScientificL3000001
Luer fittingIdex Health & ScienceP-604Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer standHolland Applied TechnologiesN/ASee Markwalter &  Prud'homme for design.26 Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex MixerHolland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)N/AContact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)C.E. ConoverMM1.5 35.50 V75Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule - CIJIdex Health & ScienceP-200Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting - CIJIdex Health & ScienceP-205Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting - MIVMIdex Health & ScienceP-942Combination with ferrule
Outlet tubing - CIJIdex Health & Science1517Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing - MIVMN/AN/AFit to ferrule ID.
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
PHD 2000 Programmable Syringe PumpHarvard ApparatusN/A
Plastic two-piece syringe 1 mLThermo Fisher ScientificS7510-1
Plug fittingIdex Health & ScienceP-309Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation KitInvitrogen by Thermo Fisher ScientificR11491
Resazurin, Sodium SaltThermo Fisher ScientificR12204
RNase AWAY Surface DecontaminantThermo Fisher Scientific7000TS1
Scintillation vialDWK Lifesciences74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mLSGE100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mLSGE50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCOThermo Fisher Scientific66012
Sodium AcetateMillipore Sigma32319-500G-R
Sodium HydroxideFisher ScientificS320-500
SucroseMillipore SigmaS7903-1KG
Syringe Filters, SterileGenesse Scientific25-243
Triton X-100Millipore Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Fisher Scientific25200056
Water, Endotoxin FreeQuality Biological118-325-131RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM7118

Referenzen

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