肿瘤缺氧评估：通过电子顺磁共振进行体内 3D 氧成像

摘要

使用脉冲电子顺磁共振对小鼠肿瘤的定量 3D 氧图进行无创成像。超声 B 型和功率多普勒用于解剖学和血管结构。来自两种模式的图像叠加在一起，可实现多参数肿瘤分析。

摘要

氧分压 （pO₂） 的精确实时测量为包括癌症在内的许多病理学提供了有价值的信息。低肿瘤 pO₂ （即缺氧） 与肿瘤侵袭性和对治疗反应不佳有关。肿瘤 pO₂ 的定量允许评估治疗效果。电子顺磁共振成像 （EPRI），尤其是脉冲 EPRI，已成为一种评估 体内组织氧合的先进三维 （3D） 方法。EPR（电子顺磁共振）的技术发展和三芳基水溶性血氧自旋探针的应用实现了这一创新，从而提供了快速、灵敏的氧合数据。自旋探针（T1 和/或 T2）的弛豫时间提供有关选定体素中 pO₂ 的准确信息。

人胶质母细胞瘤 LN229 肿瘤生长在 BALB/c 裸鼠的肩胛间时尚垫中。超声 （US） 成像用作肿瘤解剖信息的参考。为了对组织 pO₂ 进行成像，将动物放置在带有基准点的动物床上的固定位置，从而可以在成像模式之间进行配准。给予 OX071 造影剂后，进行 EPRI，然后进行 US B 模式。由于自旋探针毒性低，可以在肿瘤生长或治疗期间重复该过程。成像后，使用用 MATLAB 编写的软件执行配准过程。最终，可以计算特定肿瘤的缺氧分数，并且可以比较 pO₂ 组织分布的直方图随时间的变化。EPRI 联合超声是在临床前环境中对肿瘤进行氧标测的出色工具。

引言

理解肿瘤微环境 （TME） 及其复杂的空间和动态相互作用，可以更全面地了解肿瘤生物学。缺氧或低氧水平是 TME 的关键组成部分，在其他危及生命的疾病的发展中起着关键作用，包括心血管疾病、糖尿病等代谢紊乱和慢性肾病 ^1,2,3。组织氧合是一个基本因素，尤其是在癌症的情况下，其中部分组织氧压 （pO₂） 与治疗耐药性相关。pO₂ 水平超过 10 毫米汞柱与低线性能量转移 （LET） 放疗（氧增强效果）的有效性增加有关。

最近使用电子顺磁共振成像 （EPRI） 的研究表明，氧引导放射治疗可以使小鼠模型中不同癌症的生存率提高两倍 ^4,5。这类似于人类受试者，他们的肿瘤 pO₂ 通过多次 Eppendorf 电极测量，发现中位或平均 pO₂ 值低于 10 torr⁶。除放疗外，肿瘤缺氧还与肿瘤侵袭性和其他疗法（如免疫疗法）的结果直接相关 ^7,8。这种关联强调了精确氧测量在提高治疗结果和了解疾病病理生理学方面的重要性。

最佳的 体内 血氧饱和度测定需要直接测量组织部分氧压，而不受组织灌注和血红蛋白饱和度等因素的影响。该程序应该是无创的，成像时间简短而精确，以避免对生物体产生潜在影响，例如长时间麻醉、组织温度改变或组织压力和 pH 值的显着变化。组织血氧饱和度仪应表现出高准确性和可靠性，无论组织微环境的变化如何，包括 pH 值和氧化还原状态的差异，都能确保测量结果的一致性。为了制定有效的治疗计划，实时图像数据重建和直接解读至关重要。这不仅需要实现最好小于 1 毫米的空间分辨率，而且还需要实现快速数据收集以监测组织氧状态的动态变化，例如循环缺氧。

在此背景下，已经开发了各种测量分子氧或评估缺氧的技术，每种技术都有其独特的适用性和优势。铂电极被认为是细胞和活体动物组织血氧测定的“金标准”，通过精确插入组织提供一致的测量。其他方法，例如使用荧光探针的光学方法、光声学、通过基因或蛋白质表达监测缺氧的影响或彗星测定，都易于使用，但受组织中光路的间接或限制。评估缺氧和/或氧合的有前途的替代方案似乎是磁共振成像 （MRI）-^{OE-MRI 10} -- 或 MOBILE¹¹、使用各种缺氧敏感探针的正电子发射断层扫描 （PET）¹² 或电子顺磁共振 （EPR）。

EPR 在生物医学领域有着悠久的历史。这种现象本身于 1944 年首次报道，并被广泛用作分析化学结构的工具，最近又被广泛用于分析具有不成对电子的生物系统和材料¹³。EPR 波谱已用于研究生物系统的动力学和结构，例如光合作用、金属蛋白、自由基酶和磷脂膜 14,15,16。电子顺磁共振 （EPR） 波谱和断层扫描已成为研究肿瘤氧合和微环境的关键非侵入性方法，空间分辨率为 ~1 mm，时间分辨率为 1-10 分钟，pO₂ 分辨率为 1-3 torr ^5,17,18。

由于记录和解释波谱的简单性，连续波 （CW） EPR 方法在大多数应用中仍然得到广泛使用。氧-自旋探针相互作用通过评估 EPR 信号强度或线形的变化来发挥作用，从而深入了解样品中的氧含量。与脉冲方法相比，CW EPR 在对更宽范围的 pO₂ 的灵敏度方面具有显著优势。通过应用各种脉冲序列，可以阐明电子自旋-自旋弛豫时间、自旋-晶格弛豫时间以及与相邻自旋的相互作用等信息^18,19。脉冲 EPR 技术，例如使用电子自旋回波读数进行反转恢复 （IRESE） 技术，测量自旋晶格弛豫速率，避免了在低氧浓度下自旋探针-自旋探针弛豫引起的弛豫伪影^19,20。EPR 可用于监测具有高时间和空间分辨率的氧浓度变化;然而，在高氧浓度的血氧测定中，由于用电子自旋回波 （ESE） 测量的横向磁化弛豫时间短，脉冲 EPR 面临限制。归根结底，CW 和脉冲 EPR 是互补的，对自旋系统的可靠理解需要应用这两种方法。

EPR 血氧饱和度技术依赖于氧水平与自旋晶格之间的线性关系以及溶液中的自旋-自旋弛豫速率。所有血氧探头通常分为两种类型：可溶性和颗粒自旋探头。选择正确的自旋探针取决于实验设置和所需的信息 21,22,23。分布在整个组织中的可溶性自旋探针，如亚硝酸酯或三苯甲基衍生物^24,25，如 OX063 及其氘代形式 OX071，提供来自整个体积的信息。或者，对于单点测量以及长时间和反复的氧气评估，可以使用 LiPc、LiBuO 或碳衍生物等固态探针（见表 1）22,23,26。

超声 B 型成像在临床上广泛用于软组织成像。分辨率取决于所使用的换能器频率，对于临床前研究，18 MHz 及更高的频率可在图像的平面和深度上提供足够的分辨率。超声检查的另一个优点是可以使用功率多普勒模式获得功能性脉管系统图像。在这里，我们提出了电子顺磁共振氧成像 （EPROI） 作为生成活体小鼠肿瘤 3D 氧图的方法。相应的超声检查为 EPROI 中的肿瘤定义提供了必要的解剖参考。每只动物都可以进行多次成像。最后一步是分析，包括图像重建和模态之间的配准，以从肿瘤体积中获得 pO₂ 直方图。

研究方案

小鼠来自经批准的动物饲养设施，所有实验均按照伦理准则进行（在我们的例子中 - 许可号 165/2023，波兰克拉科夫第一地方伦理委员会）。

1. 动物和肿瘤系

注：小鼠在标准实验室条件下饲养：光照/黑暗：12 小时/12 小时，湿度：60%，温度：23 °C。 他们得到了标准的食物，可以免费获得社区笼子里的饮用水。

1. 小鼠多形性胶质母细胞瘤 LN229 细胞系培养
   1. 在 25 cm² 组织培养瓶中培养 LN229 细胞，其中 DMEM 培养基分别补充有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS） 和青霉素-链霉素，浓度分别为 10 U/mL 和 0.1 mg/mL。
   2. 将细胞维持在37°C下含有5%CO₂ 的潮湿气氛中，使用不含镁和钙离子（pH 7.4）的0.25%胰蛋白酶-EDTA和PBS每48小时传代一次。
2. 肿瘤接种
   1. 接种前一周，每天处理小鼠以使它们熟悉研究者。
   2. 接种当天，称量小鼠。
   3. 将 200,000 个 LN229 细胞悬浮在 50 μL 不含生长因子的细胞外基质中。使用 29 G 针头，将细胞混合物皮下接种到 16 周龄 BALB/c 裸鼠 （N = 5） 的肩胛内脂肪垫中。

2. 多普勒超声成像

肿瘤成像的总体时间表如图 1 所示。超声成像用于 Doppler US 和 Anatomy US 的脉管系统成像，作为 EPROI 之前的参考（图 2）。B 型解剖成像对于 EPR 的肿瘤氧合分析至关重要，如第 3 节所述。虽然多普勒超声成像（第 2 部分）对于成功的配准性能不是必需的，但它仍然提供了有关 EPR 研究最佳时间窗口的宝贵信息，并允许确定肿瘤区域的活动脉管系统。

1. 小鼠制备
   1. 等到肿瘤达到 30 毫米³ 左右。如有必要，在肿瘤部位周围手动剃除小鼠。
   2. 使用 2% 异氟醚诱导麻醉，并用 1-1.5% 异氟醚维持麻醉。
   3. 在制备过程中将动物从麻醉室转移到加热垫上，以将体温保持在 37 °C（基于直肠温度探头）。稳定动物温度以获得适当的生理参数反馈。
2. 超声
   1. 使用带有 57-25 MHz 换能器 的超声系统进行临床前成像（图 2，第 1 步）。
   2. 获取 3D B 型测量值，以便在矢状方向上可视化肿瘤形态。使用 0.1 mm 步长。
      注意： 请勿移动动物或传感器以保持完全相同的设置。
   3. 采用 功率多普勒 模式通过以下参数可视化功能性肿瘤脉管系统： 速度：1.5 kHz，壁滤波器：低，优先级：75%，持久性：中等，步长 0.10 毫米。
   4. 旋转传感器以沿轴向重复步骤 2.2.2 和 2.2.3。
   5. 使用超声制造商提供的软件进行数据分析。标记肿瘤边界，将其上传到 3D 图像中，并计算肿瘤体积和脉管系统的百分比。

3. EPROI

1. 探针制备
   1. 将储存在 -80 °C 的 OX071 粉末溶解在可注射的 H₂O 中，至终浓度为 1 g/10 mL （~70 mM）。
2. 小鼠制备
   1. 用 1%-3% 异氟醚与室内空气混合麻醉小鼠，并将它们放在动物支架上。
   2. 皮下注射 1 mL 生理盐水以保持适当的水合作用水平。
   3. 使用呼吸枕式传感器和连接到小鼠皮肤的表面温度计监测动物的呼吸频率 （80 ± 20 BPM） 和温度 （37 ± 1 °C）。监测直肠温度作为参考点（37 °C ± 1 °C）。
   4. 将聚四氟乙烯 （PTFE） 管（外径 0.7 毫米）插入腹膜内用于自旋探针给药。使用乙烯基聚硅氧烷 （VPS） 固定套管，以防止其从腹腔中脱落。
   5. 插入尿导管 （24 G） 以收集排泄的旋转探针。
   6. 使用 VPS 牙科粘土将小鼠固定在动物床上以进行固定（图 2A）。
3. 用于注册的 US 解剖成像
   1. 打开 3D 控制的桌子和水平床。将平台温度设置为 60 °C，以便由塑料床架隔离的动物温度保持在 37 °C。
   2. 将动物床和固定的动物放在床架中，并将其转移到 3D 控制台上进行解剖成像，然后再进行 EPR 测量（图 2B）。确保动物固定在床架内，不要接触加热平台。
   3. 在三个维度上固定床架的位置以防止旋转，特别是 XZ（矢状面）旋转，这对于准确套准至关重要。
   4. 在床架上放置一个位置标记（胶带上的鱼丝，直径 0.35 毫米），标记谐振器的起点。
   5. 手动进行 B 型成像，沿轴向和矢状方向以 1 mm 的步长朝向 Y 轴。
   6. 使用以下参数对肿瘤结构进行成像，具体取决于特定的换能器频率;对于 18 MHz 传感器，深度 20 mm，动态范围 84 dB，功率 8 dB，增益 80%;对于 40 MHz 传感器，深度 20 mm，动态范围 32 dB，增益 100%;对于 57 MHz 传感器，深度 13 mm，增益 6 dB，功率 100%。根据特定的肿瘤位置调整换能器焦点的设置。
   7. 在解剖成像结束时，擦去小鼠身上多余的凝胶，然后从床架上取下动物床上固定的小鼠。
4. EPR 氧成像
   1. 使用氧成像仪进行脉冲 EPR，在 685 MHz 至 735 MHz 的无线电频率范围内工作。对于设置，使用偏移线圈进行 3D 成像和弛豫时间分析。使用尺寸为 32 mm x 35 m 的水平谐振器。
   2. 解剖超声后，立即将动物床中固定的小鼠转移到 EPR 成像仪（图 2C）。小心保持动物床的位置，以尽量减少谐振器内的旋转，类似于第 3.3 节中概述的程序。
   3. 重新连接温度探头，以确保持续监测和维持动物的体温，并将其与谐振器内的温度相关联。
   4. 在 EPR 波谱仪软件中，通过使用调谐轮将频率集中在 725 MHz 附近来执行谐振器调谐（图 3A）。
      注意：匹配良好的谐振器应具有 25 dB 或更高的下降。
   5. 通过将衰减值从 20 dB 调整到 3 dB，优化微波功率以获得 60 ns 的峰值（图 3B）。
   6. 调整仪器，使位于动物床内的基准点的自由感应衰减 （FID） 以磁场为中心并定相（图 3C）。
   7. 通过先前插入的套管腹膜内注射 100 μL OXO71，然后用 50-100 μL 盐水溶液冲洗。
   8. 使用编程的队列序列，使用设置的参数获取测量值;典型的序列包含 T1、T2 弛豫时间、用于基准图像的 3D 电子自旋回波 （ESE） 和用于动物图像的 4D 反演恢复电子自旋回波 （IRESE）。以 1.5 G/cm 梯度收集 IRESE 成像，重复时间为 55 μs，预触发 -250 ns，t90 为 60 ns，tau 为 400 ns;总采集时间 ~12 min.探针注射后至少重复 IRESE 成像 30-40 分钟 （3-4x）。
   9. 成像后，将鼠标从动物床转移到加热垫上。皮下注射 1 mL 生理盐水以保持适当的水合作用水平。监控鼠标直到恢复直立运动。

4. 数据分析

1. “ProcessGUI” 中的 4D 重建分析
   1. 在重建之前，通过选择场景 “PulseRecon.scn” 并加载参数文件 “IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par” 来分析 IRESE 原始数据，对投影进行基线校正。
   2. 使用宽度为 4 磅的高斯过滤器过滤每个投影，这是所选场景的默认设置。
   3. 将筛选的投影子采样为 64 个点（矩阵大小），这是所选方案的默认设置。
   4. 使用 Ram-Lak 滤波器进一步过滤投影，其切趾频率为 0.6 倍奈奎斯特频率（单击 重建参数 |FilterCutOff）的 FilterCutOff）。
   5. 对过滤后的投影进行反向投影，以生成 4D 光谱空间图像。
   6. 利用拟合算法从每个体素的频谱中提取自旋包线宽。截面 拟合参数 设置： 最后一个点扩展器 - 3，拟合方法 - 默认。
   7. 在拟合过程中使用参数的默认设置，包括频谱的幅度、相位、频谱中心和频谱自旋包线宽。
2. 在“ArbuzGUI”中解剖 US 和 EPROI 之间的配准（图 4）
   注意：使用芝加哥大学的 Boris Epel 开发的“ArbuzGUI”MATLAB 程序执行注册。该软件可在 EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit 获取。注册工具箱之前在其他地方有解释²⁷.有关详细的分步说明²⁸，请参阅用户手册。
   1. 以 1 mm 的步长（步长与 B 模式成像的帧采集严格相关，点 3.3.7）将 2D US 图像作为堆栈加载，以创建 3D US 图像。
   2. 将收集的 pO 2 图像（在步骤 4.1 中重建）添加为设置为 “PO2_pEPRI” 数据的 3D 图像类型。在项目中存储数据。
   3. 通过选择 特殊 |MRI-EPRI 注册。
   4. 通过选择 Sequence |Add作，选择需要调整为 EPRI 数据的图像（例如，US axial 3D）。使用 Stage 5：T2 以获得最佳性能。在结果中，所选图像的名称前面将出现一个黑色加号。
   5. 在 SliceMaskEditPLG 中打开 US 图像。根据图像上显示的标尺调整 US 图像的比例。根据选定的帧标记 US 位置标记、动物轮廓和肿瘤位置。
   6. 在 SliceMaskEditPLG 中，在重建的 4D pO₂ 图像中标记 pO₂ 映射轮廓和基准。
   7. 使用图窗查看器和 RotateImagePLG 工具箱，根据美国位置标记与基准位置旋转美国图像，以使用美国轮廓配准 pO₂ 映射。
   8. 将肿瘤掩码从 US 图像转换为 pO₂ 图。
   9. 在小鼠的 pO₂ 图中可视化肿瘤掩码，并导出每个体素的 pO₂ 值。

结果

图5 显示了在肩胛内脂肪垫中生长的 LN229 肿瘤以及脉管系统的超声图像的代表性横截面。在肿瘤边界外可以看到一些脉管系统。出乎意料的是，肿瘤脉管体积的百分比并没有降低，并且随着肿瘤生长而保持稳定。

如图 2 所示，第 2 步涉及将鼠标与所有附件一起固定在床上，以确保两种图像模式的位置完全?...

讨论

所描述的成像协议中有几个关键步骤。首先，要使用氧合图配准解剖图像，MRI 可能是比超声更好的选择，因为它具有更好的分辨率和提供详细 3D 数据的能力¹⁹。带有高频换能器的超声为临床前研究提供了出色的分辨率和足够的成像深度。然而，MRI 和 US 都需要使用基准点来确保不同成像方式的肿瘤位置。

对实验装置进行一些修改对?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua pro injectione	Polpharma	1280610	-
ArbuzGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
disodium phosphate	POCH S.A.	799280115	-
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Merck Life Science	D5648	4500 mg/L glucose and L-glutamine
fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10500064	-
fishing wire	Good Fish	A-55A-035	US position marker - 0.35 mm
Geltrex	Gibco, Thermo Fisher Scientific	A1413302	reduced growth factor basement membrane matrix
ibGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
injectio natrii chlorati isotonica	Polpharma	multipe items were used	9 mg/mL
insulin needles 29 G	Becton, Dickinson and Company	multipe items were used	-
Jiva 25	O2M Technologies	-	EPROI
MATLAB	MathWorks	-	version R2021b
penicillin-streptomycin	Merck Life Science	P4333	with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
potassium chloride	POCH S.A.	739740114	-
potassium dihydrogen phosphate	POCH S.A.	742020112	-
ProcessGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
PTFE tubing	Cole Palmer Instrument Co	06412-11	-
sodium chloride	POCH S.A.	794121116	-
SpecMan4EPR	FEMI Instruments	-	version 3.4 CS 64bit
Surflash I.V. Catheter	Terumo	SR*FF2419	size: 24G x ¾"
tape	3M	multipe items were used	micropore
Trypsin-EDTA	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25200072	-
Ultrasonography	Telemed	-	Anatomical US
US gel	KONIX	NUG-0019	-
Vetflurane	Virbac	137317	1000 mg/g
Vevo F2	FujiFilms, Visual Sonics	-	B-mode and Doppler
vinyl polysiloxane dental clay	3M ESPE	multiple items were used	-