종양 저산소증 평가: 전자 상자성 공명을 통한 생체 내 3D 산소 이미징

요약

쥐 종양의 정량적 3D 산소 맵은 Pulse Electron Paramagnetic Resonance를 사용하여 비침습적으로 이미지화되었습니다. 초음파 B 모드와 파워 도플러는 해부학 및 혈관 구조에 사용되었습니다. 두 양식의 이미지를 중첩하여 다중 매개변수 종양 분석을 가능하게 했습니다.

초록

산소 분압(pO₂)의 정확한 실시간 측정은 암을 포함한 많은 병리학에서 귀중한 정보를 제공합니다. 낮은 종양 pO₂ (즉, 저산소증)는 종양의 공격성 및 치료에 대한 낮은 반응과 관련이 있습니다. 종양 pO₂ 의 정량화를 통해 치료 효과를 평가할 수 있습니다. EPRI(Electron Paramagnetic Resonance Imaging), 특히 Pulse EPRI는 생체 내 조직 산소화를 평가하는 고급 3차원(3D) 방법으로 부상했습니다. 이러한 혁신은 EPR(Electron Paramagnetic Resonance)의 기술 개발과 빠르고 민감한 산소화 데이터를 제공하는 트리아릴 제품군의 수용성 산소 측정 스핀 프로브의 적용으로 가능했습니다. 스핀 프로브(T1 및/또는 T2)의 이완 시간은 선택된 복셀에서_pO2 에 대한 정확한 정보를 제공합니다.

인간 교모세포종 LN229 종양은 BALB/c 누드 마우스의 견갑골 유행 패드에서 성장했습니다. 초음파(미국) 영상은 종양 해부학적 정보에 대한 참조로 사용되었습니다. 조직 pO₂를 이미지화하기 위해, 동물을 기준점이 있는 동물 침대의 고정된 위치에 배치하여 이미징 양식 간의 등록을 가능하게 했습니다. OX071 조영제를 투여한 후 EPRI를 수행한 후 US B-모드를 수행했습니다. 스핀 프로브 독성이 낮기 때문에 종양 성장 또는 치료 중에 절차를 반복할 수 있습니다. 이미징 후, 등록 프로세스는 MATLAB으로 작성된 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 궁극적으로 특정 종양에 대한 저산소 분율을 계산할 수 있으며_pO2 조직 분포의 히스토그램을 시간 경과에 따라 비교할 수 있습니다. EPRI는 초음파와 결합되어 전임상 환경에서 종양의 산소 매핑을 위한 훌륭한 도구입니다.

서문

복잡한 공간적, 동적 상호 작용이 있는 종양 미세환경(TME)을 이해하면 종양 생물학을 보다 완벽하게 이해할 수 있습니다. 저산소증(Hypoxia) 또는 낮은 산소 수치는 TME의 핵심 구성 요소이며 심혈관 질환, 당뇨병과 같은 대사 장애, 만성 신장 질환 등 생명을 위협하는 다른 질환의 발병에 중요한 역할을 합니다 ^1,2,3. 조직 산소화는 특히 부분적인 조직 산소압(pO₂)이 치료 저항성과 상관관계가 있는 암의 맥락에서 근본적인 요인입니다. pO₂ 수치가 10mmHg를 초과하면 낮은 선형 에너지 전달(LET) 방사선 요법의 효과 증가(산소 향상 효과)와 관련이 있습니다.

EPRI(Electron Paramagnetic Resonance Imaging)를 사용한 최근 연구에서는 산소 유도 방사선 요법이 쥐 모델에서 다른 암의 생존율을 2배 향상시킬 수 있음을 입증했습니다 ^4,5. 이는 여러 Eppendorf Electrode 측정으로 종양 pO₂를 측정한 결과 중앙값 또는 평균 pO₂ 값이 10 torr⁶ 미만인 것으로 확인된 인간 피험자와 유사합니다. 방사선 요법 외에도 종양 저산소증은 종양의 공격성 및 면역 요법과 같은 다른 치료법의 결과와 직접적인 상관관계가 있었다 ^7,8. 이러한 연관성은 치료 결과를 향상시키고 질병의 병태생리학을 이해하는 데 있어 정확한 산소 측정의 중요성을 강조합니다.

최적의 in vivo 산소 측정을 위해서는 조직 관류 및 헤모글로빈 포화도와 같은 요인과 무관하게 부분 조직 산소 압력을 직접 측정해야 합니다. 절차는 비침습적이어야 하며, 장기간의 마취, 조직 온도의 변화 또는 조직 압력 및 pH의 현저한 변화와 같이 유기체에 대한 잠재적인 영향을 피하기 위해 짧고 정확한 이미징 시간이 있어야 합니다. 조직 산소 포화도 측정은 높은 정확도와 신뢰성을 보여야 하며, pH 및 산화 환원 상태의 차이를 포함하여 조직 미세환경의 변화에 관계없이 일관된 측정을 보장해야 합니다. 효과적인 치료 계획을 위해서는 실시간 이미지 데이터 재구성과 간단한 해석이 중요합니다. 여기에는 1mm 미만의 공간 해상도를 달성하는 것이 바람직할 뿐만 아니라 사이클링 저산소증과 같은 조직 산소 상태의 동적 변화를 모니터링하기 위한 빠른 데이터 수집이 포함됩니다.

이러한 맥락에서 분자 산소를 측정하거나 저산소증을 평가하기 위한 다양한 기술이 개발되었으며, 각각 고유한 적용 가능성과 장점이 있습니다. 세포 및 살아있는 동물 조직 산소 측정의 "황금 표준"으로 간주되는 백금 전극은 조직에 정밀하게 삽입하여 일관된 측정을 제공합니다. 형광 프로브를 사용한 광학 방법, 광 음향학, 유전자 또는 단백질 발현을 통한 저산소증의 영향 모니터링 또는 혜성 분석과 같은 다른 접근 방식은 사용하기 쉽지만 간접적이거나 조직의 광학 경로에 의해 제한됩니다. 저산소증 및/또는 산소화를 평가하기 위한 유망한 대안으로는 자기공명영상(MRI)-OE-MRI¹⁰ 또는 MOBILE¹¹, 다양한 저산소증에 민감한 프로브를 이용한 양전자 방출 단층촬영(PET)¹² 또는 전자 상자성 공명(EPR)이 있습니다.

EPR은 생물 의학 분야에서 오랜 역사를 가지고 있습니다. 이 현상 자체는 1944년에 처음 보고되었으며 화학 구조를 분석하기 위한 도구로 널리 채택되었으며 최근에는 짝을 이루지 않은 전자를 가진 생물학적 시스템 및 재료에 대한 도구로 채택되었습니다¹³. EPR 분광법은 광합성, 금속 단백질, 라디칼 효소 및 인지질막과 같은 생물학적 시스템의 역학 및 구조를 연구하는 데 사용되었습니다 14,15,16. 전자 상자성 공명(EPR) 분광법 및 단층 촬영은 ~1mm의 공간 해상도, 1-10분의 시간 해상도, 1-3 torr ^5,17,18의 pO₂ 해상도로 종양 산소화 및 미세환경을 연구하기 위한 중추적인 비침습적 방법으로 부상했습니다.

연속파(CW) EPR 방법은 스펙트럼 기록 및 해석의 단순성으로 인해 대부분의 응용 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 산소-스핀 프로브 상호 작용은 EPR 신호 강도 또는 선 모양의 변화를 평가하여 작동하여 샘플 내 산소 수준에 대한 통찰력을 제공합니다. CW EPR은 펄스 방법에 비해 더 넓은 범위의 pO₂에 대한 감도에서 주목할만한 이점이 있습니다. 다양한 펄스 시퀀스를 적용함으로써, 전자 스핀-스핀 이완 시간, 스핀-격자 이완 시간 및 주변 스핀과의 상호 작용과 같은 정보를 설명할 수 있습니다^18,19. IRESE(electron spin echo) 판독을 통한 반전 복구와 같은 펄스 EPR 기술은 스핀 격자 이완 속도를 측정하여 낮은 산소 농도에서 스핀 프로브-스핀 프로브 이완으로 인한 이완으로 인한 아티팩트를 방지합니다^19,20. EPR은 높은 시간 및 공간 분해능으로 산소 농도 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 높은 산소 농도의 산소 측정에서 펄스 EPR은 전자 스핀 에코(ESE)로 측정된 횡방향 자화의 짧은 이완 시간으로 인해 한계에 직면합니다. 궁극적으로 CW와 펄스 EPR은 상호 보완적이며, 스핀 시스템에 대한 신뢰할 수 있는 이해를 위해서는 두 가지 방법을 모두 적용해야 합니다.

EPR 산소 측정 기술은 산소 수준과 스핀-격자 사이의 선형 관계와 용액의 스핀-스핀 이완 속도에 의존합니다. 모든 산소 측정 프로브는 종종 용해성 스핀 프로브와 미립자 스핀 프로브의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 올바른 스핀 프로브를 선택하는 것은 실험 설정과 필요한 정보 21,22,23에 따라 다릅니다. 니트록시드 또는 OX063 및 이의 중수소화 형태 OX071과 같은 트리틸 유도체^24,25와 같은 용해성 스핀 프로브는 조직 전체에 분포하여 전체 부피의 정보를 제공합니다. 또는 단일 지점 측정 및 장기간 및 반복적 인 산소 평가를 위해 LiPc, LiBuO 또는 탄소 유도체와 같은 고체 프로브를 사용할 수 있습니다 (표 1 참조) 22,23,26.

초음파 검사 B 모드 영상은 연조직 이미징을 위해 클리닉에서 널리 사용됩니다. 해상도는 사용된 트랜스듀서 주파수에 따라 다르며, 전임상 연구의 경우 18MHz 이상이 평면에서 충분한 해상도와 이미지의 깊이를 제공합니다. 초음파 검사의 또 다른 장점은 파워 도플러 모드를 사용하여 기능적 혈관 구조 이미지를 얻을 수 있다는 것입니다. 여기에서는 살아있는 쥐의 종양에 대한 3D 산소 맵을 생성하는 방법으로 전자 상자성 공명 산소 이미징(EPROI)을 제시합니다. 해당 초음파는 EPROI 내에서 종양 정의에 필요한 해부학적 참조를 가능하게 합니다. 모든 동물에 대해 여러 번의 이미징 세션이 가능합니다. 마지막 단계는 종양 부피에서_pO2 히스토그램을 얻기 위한 이미지 재구성 및 양식 간 등록을 포함한 분석입니다.

프로토콜

승인된 동물 사육 시설에서 생쥐를 얻었으며 모든 실험은 윤리 지침(우리의 경우 - 허가 번호 165/2023, 폴란드 크라쿠프, First Local Ethics Committee)에 따라 수행되었습니다.

1. 동물과 종양 계통

참고: 마우스는 표준 실험실 조건에서 보관되었습니다: 밝음/어두움: 12시간/12시간, 습도: 60%, 온도: 23°C. 그들은 공동체 우리에서 식수를 무료로 이용할 수 있는 표준 차우 식단을 제공받았습니다.

1. 쥐 교모세포종 다형 LN229 세포주 배양
   1. LN229 세포를 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)과 페니실린-스트렙토마이신이 각각 10 U/mL 및 0.1 mg/mL 농도로 보충된 DMEM 배지에서 25cm² 조직 배양 플라스크에 배양합니다.
   2. 37°C에서 5% CO₂ 를 포함하는 가습된 분위기에서 세포를 유지하고 마그네슘 및 칼슘 이온(pH 7.4)이 없는 0.25% 트립신-EDTA 및 PBS를 사용하여 48시간마다 패시징합니다.
2. 종양접종
   1. 접종 일주일 전에 매일 쥐를 다루어 조사관과 친숙해지도록 하십시오.
   2. 접종 당일에는 쥐의 무게를 잰다.
   3. 성장 인자 없이 50μL의 세포외 기질에 200,000개의 LN229 세포를 현탁시킵니다. 29G 바늘을 사용하여 16주 된 BALB/c 누드 마우스(N = 5)의 견갑골 내 지방 패드에 세포 혼합물을 피하로 접종합니다.

2. 도플러 US 이미징

종양 영상의 전체 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 초음파 영상은 EPROI 직전에 Doppler US와 Anatomy US의 혈관 촬영에 참조로 사용됩니다(그림 2). B-모드 해부학적 영상은 EPR에 의한 종양 산소화 분석에 필수적이며 섹션 3에 설명되어 있습니다. 도플러 초음파 영상(섹션 2)이 성공적인 등록 수행을 위해 필수는 아니지만, 그럼에도 불구하고 EPR 연구를 위한 최적의 시간 창에 대한 귀중한 정보를 제공하고 종양 영역의 활성 혈관 구조를 결정할 수 있습니다.

1. 마우스 준비
   1. 종양이 약 30mm에 도달할 때까지 기다립니다³. 필요한 경우 종양 부위 주위를 수동으로 면도합니다.
   2. 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도하고 1-1.5% 이소플루란으로 유지합니다.
   3. 준비하는 동안 체온을 37°C로 유지하기 위해 마취실에서 발열 패드로 동물을 옮깁니다(직장 온도 프로브 기준). 적절한 생리학적 매개변수 피드백을 얻기 위해 동물의 온도를 안정화합니다.
2. 초음파 검사
   1. 전임상 이미징을 위해 57-25MHz 변환기 와 함께 초음파 시스템을 사용합니다(그림 2, 1단계).
   2. 시상 방향의 종양 형태학 시각화를 위한 3D B-모드 측정을 획득합니다. 0.1mm 스텝 크기를 사용합니다.
      알림: 정확히 동일한 설정을 유지하기 위해 동물이나 변환기를 움직이지 마십시오.
   3. 파워 도플러 모드를 사용하여 다음 매개변수로 기능적 종양 혈관 구조를 시각화합니다: 속도: 1.5kHz, 벽 필터: 낮음, 우선 순위: 75%, 지속성: 중간, 단계 크기 0.10mm.
   4. 변환기를 회전하여 축 방향으로 2.2.2 및 2.2.3 단계를 반복합니다.
   5. 초음파 제조업체에서 제공하는 소프트웨어로 데이터 분석을 수행합니다. 종양 경계를 표시하고, 3D 이미지에 업로드하고, 종양 부피와 혈관 구조의 비율을 계산합니다.

3. 에프로이

1. 프로브 준비
   1. -80°C에서 보관된 OX071 분말을 주사용 H_2O에 1g/10mL(~70mM)의 최종 농도로 용해합니다.
2. 마우스 준비
   1. 실내 공기와 혼합된 1%-3% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 동물 홀더에 놓습니다.
   2. 적절한 수분 수준을 유지하기 위해 생리식염수 1mL를 피하로 투여합니다.
   3. 호흡 베개 센서와 쥐 피부에 부착된 표면 온도계를 사용하여 동물의 호흡수(80 ± 20 BPM)와 온도(37 ± 1 °C)를 모니터링합니다. 직장 온도를 기준점으로 모니터링합니다(37°C ± 1°C).
   4. 스핀 프로브 투여를 위해 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브(외경 0.7mm)를 복강내에 삽입합니다. 비닐 폴리실록산(VPS)을 사용하여 캐뉼라를 고정하여 캐뉼라가 복강에서 떨어지는 것을 방지합니다.
   5. 소변 카테터(24G)를 삽입하여 배설된 스핀 프로브를 수집합니다.
   6. 고정을 위해 VPS 치과용 점토를 사용하여 동물 침대에 마우스를 고정합니다(그림 2A).
3. 등록을 위한 해부학적 미국 이미징
   1. 3D 제어 테이블과 수평 침대를 켭니다. 플라스틱 침대 홀더에 의해 격리된 동물의 온도가 37°C로 유지되도록 플랫폼 온도를 60°C로 설정합니다.
   2. 움직이지 못하는 동물과 함께 동물 침대를 침대 홀더에 놓고 EPR 측정 전에 해부학적 이미징을 위해 3D 제어 테이블로 옮깁니다(그림 2B). 동물이 침대 홀더 안에 고정되어 있고 난방 플랫폼을 만지지 않았는지 확인하십시오.
   3. 침대 홀더의 위치를 3차원으로 고정하여 회전, 특히 정확한 등록에 중요한 XZ(시상면) 회전을 방지합니다.
   4. 침대 홀더에 위치 마커(테이프의 낚싯줄, 직경 0.35mm)를 놓고 공진기의 시작을 표시합니다.
   5. Y축을 향해 축 방향과 시상 방향 모두에서 1mm 간격으로 B 모드 이미징을 수동으로 수행합니다.
   6. 특정 변환기 주파수에 따라 달라지는 다음 매개변수로 종양 구조를 이미지화합니다. 18MHz 변환기의 경우 깊이 20mm, 동적 범위 84dB, 전력 8dB, 이득 80%; 40MHz 변환기의 경우, 깊이 20mm, 동적 범위 32dB, 이득 100%; 57MHz 변환기의 경우 깊이 13mm, 이득 6dB, 전력 100%. 특정 종양 위치에 따라 변환기 초점의 설정을 조정합니다.
   7. 해부학적 영상이 끝나면 마우스에서 여분의 젤을 닦아내고 침대 홀더에서 동물 침대에 고정된 마우스를 제거합니다.
4. EPR 산소 이미징
   1. 685MHz에서 735MHz 범위의 무선 주파수 내에서 작동하는 Pulse EPR용 산소 이미저를 활용합니다. 설정을 위해 3D 이미징 및 이완 시간 분석을 위해 오프셋 코일을 사용합니다. 32mm x 35m 크기의 수평 공진기를 사용하십시오.
   2. 동물 침대에 있는 고정된 마우스를 해부학적 초음파 후 즉시 EPR 이미저로 옮깁니다(그림 2C). 섹션 3.3에 설명된 절차와 유사하게 공진기 내부의 회전을 최소화하기 위해 동물 침대의 위치를 조심스럽게 유지하십시오.
   3. 온도 프로브를 다시 연결하여 동물의 온도를 지속적으로 모니터링하고 유지 관리하여 공진기 내부의 온도와 연관시킵니다.
   4. EPR 분광계 소프트웨어에서 튜닝 휠을 사용하여 주파수를 약 725MHz의 중심에 두어 공진기 튜닝을 수행합니다(그림 3A).
      알림: 잘 일치하는 공진기는 25dB 이상의 딥을 가져야 합니다.
   5. 감쇠 값을 20dB에서 3dB로 조정하여 60ns에서 피크를 얻도록 마이크로파 전력을 최적화합니다(그림 3B).
   6. 동물 침대 내에 위치한 기준점의 자유 유도 붕괴(FID)가 자기장의 중심에 있고 위상이 형성되도록 기기를 조정합니다(그림 3C).
   7. 이전에 삽입된 캐뉼라를 통해 100μL의 OXO71을 복강내로 투여한 다음 50-100μL의 식염수로 플러시합니다.
   8. 프로그래밍된 대기열 시퀀스를 사용하여 설정된 매개변수로 측정값을 획득합니다. 일반적인 시퀀스에는 T1, T2 이완 시간, 기준 이미지를 위한 3D ESE(Electron Spin Echo), 동물 이미지를 위한 4D IRESE(Inversion Recovery Electron Spin Echo)가 포함됩니다. 1.5G/cm 기울기, 55μs의 반복 시간, 사전 트리거링 -250ns, t90은 60ns, tau 400ns로 IRESE 이미징을 수집합니다. 총 획득 시간 ~ 12 분. 프로브 주입 후 최소 30-40분(3-4x) 동안 IRESE 이미징을 반복합니다.
   9. 이미징 후 동물 침대에서 가열 패드로 마우스를 옮깁니다. 적절한 수분 수준을 유지하기 위해 생리식염수 1mL를 피하로 투여합니다. 마우스가 직립 운동을 회복할 때까지 모니터링합니다.

4. 데이터 분석

1. "ProcessGUI"에서 4D 재구성 해석
   1. 재구성하기 전에 시나리오 "PulseRecon.scn"을 선택하고 매개 변수 파일 "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par"을 로드하여 IRESE 원시 데이터를 분석하여 프로젝션에 기준선 보정을 적용합니다.
   2. 선택한 시나리오의 기본 설정인 4포인트 너비의 가우스 필터로 각 투영을 필터링합니다.
   3. 필터링된 투영을 선택한 시나리오의 기본 설정인 64포인트(행렬 크기)로 하위 샘플링합니다.
   4. 또한 Nyquist 주파수의 0.6배에서 아포디제이션을 사용하는 Ram-Lak 필터로 투영을 필터링합니다( Reconstruction parameter | FilterCutOff)를 사용합니다.
   5. 필터링된 투영을 역투영하여 4D 스펙트럼 공간 이미지를 생성합니다.
   6. 피팅 알고리즘을 사용하여 각 복셀의 스펙트럼에서 스핀 패킷 선폭을 추출합니다. 단면 피팅 매개변수 설정: 마지막 포인트 익스텐더 - 3, 피팅 방법 - 기본값.
   7. 피팅 절차의 파라미터에 대해 스펙트럼의 진폭, 위상, 스펙트럼 중심, 스펙트럼 스핀 패킷 선폭을 포함한 디폴트 설정을 사용합니다.
2. "ArbuzGUI"에서 해부학적 US와 EPROI 간의 등록(그림 4)
   참고: 시카고 대학의 Boris Epel이 개발한 "ArbuzGUI" MATLAB 프로시저가 등록을 수행하는 데 사용되었습니다. 이 소프트웨어는 EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit 에서 사용할 수 있습니다. 정합 도구 상자는 이전에 다른 곳에서 설명되었습니다²⁷. 자세한 단계별 지침은 사용 설명서를 참조하십시오²⁸.
   1. 2D US 이미지를 1mm 단계(단계는 B 모드 이미징, 포인트 3.3.7)의 스택으로 로드하여 3D US 이미지를 생성합니다.
   2. 수집된 pO2 이미지(4.1단계에서 재구성)를 "PO2_pEPRI" 데이터로 설정된 3D 이미지 유형으로 추가합니다. 프로젝트에 데이터를 저장합니다.
   3. Create a registration sequence and transformation by selecting Special(특수) | MRI-EPRI 등록.
   4. 시퀀스 | 작업 추가를 선택하여 EPRI 데이터(예: US axial 3D)로 조정해야 하는 이미지를 선택합니다. 최상의 성능을 위해 Stage 5:T2를 사용하십시오. 결과에서 선택한 이미지의 이름 앞에 검은색 더하기 기호가 나타납니다.
   5. SliceMaskEditPLG에서 미국 이미지를 엽니다. 이미지에 표시된 눈금자를 기준으로 미국 이미지의 크기를 조정합니다. 선택한 프레임을 기준으로 US 위치 마커, 동물 윤곽 및 종양 위치를 표시합니다.
   6. SliceMaskEditPLG에서 재구성된 4D pO₂ 이미지의 pO₂ 맵 개요와 기준점을 표시합니다.
   7. Figure 뷰어 및 RotateImagePLG 툴박스를 사용하여 기준 위치 대비 기준 위치 마커에 따라 미국 이미지를 회전하여 pO₂ 맵을 US 윤곽선에 등록합니다.
   8. 종양 마스크를 US 이미지에서 pO₂ 맵으로 변환합니다.
   9. 마우스의 pO₂ 맵에서 종양 마스크를 시각화하고 각 복셀에 대한 pO₂ 값을 내보냅니다.

결과

견갑골 내 지방 패드에서 자라는 LN229 종양과 혈관 구조의 초음파 이미지에서 대표적인 단면이 그림 5에 나와 있습니다. 일부 혈관 구조는 종양 경계 밖에서 볼 수 있습니다. 예상외로, 종양 혈관 부피의 비율은 감소하지 않았고 종양 성장에 따라 안정적으로 유지되었습니다.

그림 2에 요약된 것처럼 2단계?...

토론

설명된 이미징 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 산소 지도에 해부학 이미지를 등록하기 위해서는 해상도가 향상되고 상세한 3D 데이터를 제공할 수 있기 때문에 MRI가 초음파보다 더 나은 선택일 수 있다¹⁹. 고주파 변환기를 사용한 초음파는 전임상 연구를 위한 뛰어난 해상도와 충분한 이미징 깊이를 제공합니다. 그러나 MRI와 US 모두...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua pro injectione	Polpharma	1280610	-
ArbuzGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
disodium phosphate	POCH S.A.	799280115	-
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Merck Life Science	D5648	4500 mg/L glucose and L-glutamine
fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10500064	-
fishing wire	Good Fish	A-55A-035	US position marker - 0.35 mm
Geltrex	Gibco, Thermo Fisher Scientific	A1413302	reduced growth factor basement membrane matrix
ibGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
injectio natrii chlorati isotonica	Polpharma	multipe items were used	9 mg/mL
insulin needles 29 G	Becton, Dickinson and Company	multipe items were used	-
Jiva 25	O2M Technologies	-	EPROI
MATLAB	MathWorks	-	version R2021b
penicillin-streptomycin	Merck Life Science	P4333	with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
potassium chloride	POCH S.A.	739740114	-
potassium dihydrogen phosphate	POCH S.A.	742020112	-
ProcessGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
PTFE tubing	Cole Palmer Instrument Co	06412-11	-
sodium chloride	POCH S.A.	794121116	-
SpecMan4EPR	FEMI Instruments	-	version 3.4 CS 64bit
Surflash I.V. Catheter	Terumo	SR*FF2419	size: 24G x ¾"
tape	3M	multipe items were used	micropore
Trypsin-EDTA	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25200072	-
Ultrasonography	Telemed	-	Anatomical US
US gel	KONIX	NUG-0019	-
Vetflurane	Virbac	137317	1000 mg/g
Vevo F2	FujiFilms, Visual Sonics	-	B-mode and Doppler
vinyl polysiloxane dental clay	3M ESPE	multiple items were used	-